התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

הדור של לימפוציטים T מ המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים נותן גישה חלופית של שימוש בתאי גזע עובריים על חיסוני מבוססי תאים T. השיטה מלמדת כי על ידי ניצול או

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ולאפיין לימפוציטים מסוג T מתאי גזע פלוריפוטנטיים או IPS מושרים. לאחר מכן ניתן להתמיין בתאי ה-IPS במבחנה במערכת תרבית OP תשע DL אחת ולאחר מכן להבשיל in vivo בעכבר חסר סמרטוט. או שניתן להנדס גנטית את התאים כדי לבטא יתר על המידה OTR אחד ואז להעביר אותם באופן מאומץ לפיתוח in vivo.

לאחר שישה שבועות של התמיינות in vivo, ניתן לאתגר את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית עם EEG שבעה תאי גידול ואז ניתן להעריך את ספציפיות האנטיגן של תאי T שמקורם ב-IPS. בסופו של דבר, תאי ה-IPS יכולים להתמיין לתאי T קונבנציונליים וספציפיים לאנטיגן, שהאחרונים מסוגלים להגן על בעלי חיים מפני אתגר הגידול. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אימונותרפיה אינדיבידואלית של הסרטן.

השיטה מאפשרת יצירת מספר רב של תאי T תגובתיים לגידול הנובעים מכמות מינימלית של דם או רקמת עור של המטופל ביום האפס העברה חמש פעמים 10 לתאי ה-IPS הרביעי על צלחת תרבית של 100 מילימטר המכילה OP תשע, DL חד-שכבתי של תא אחד ב-20% FBS אלפא MEM מדיה ביום החמישי, עיני טריפסין. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים לאחר הדגירה שלהם על צלחת תרבית טרייה של 100 מילימטר למשך 30 דקות וצלחת אינקובטור של 37 מעלות, חמש כפול 10 עד חמישית מהתאים הצפים ב-20% FBS אלפא, מדיה MEM ועכבר שטוח שלושה ליגנד על צלחת חדשה של 100 מילימטר המכילה שכבה אחת של OP 9. תא DL אחד ביום השמיני מבצע בעדינות את התאים המחוברים באופן רופף, מצנטריפוגה את התאים, ואז מעביר את התאים לבאר אחת של צלחת תרבית של שש בארות המצופה ב-OP קונפלונטי תשעה תאי DL אחד דוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שבועיים נוספים ביום ה-22.

דגירה של תאי IPS מנותקים במדיה טרייה על צלחת תרבית חדשה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הסר כמחצית מהתאים הצפים והעביר אותם דרך מסננת ניילון של 70 מיקרון כדי לא לכלול גושי תאים ולשטוף את תרחיף התא הבודד שנוצר שלוש פעמים עם PBS קר. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את התאים ב-PBS ב-1.5 כפול 10 מהתאים השביעיים למיליליטר והשאירו את התאים על הקרח לפני הזרקת הווריד.

הניחו עכבר בן ארבעה שבועות עם מחסור בסמרטוטים מתחת לאור אינפרא אדום כדי להרחיב את וריד הזנב. לאחר מכן מלאו מזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26 וחצי עם 200 מיקרוליטר של מתלה התאים והעבירו את התאים באימוץ דרך וריד הזנב המורחב. שלושה שבועות לאחר אישור המתת חסד של העכבר שהועבר לאימוץ, הסר את בלוטות הלימפה והטחול לאחר פירוק מכני של הרקמות.

יש להניח את תרחיף התא הבודד עם מאגר ליזה CK ולאחר מכן לשטוף את ציטי המונוקלאו המתקבלים פעמיים ב-PBS קר. לאחר מכן לאחר צביעה לסמני פני התא, הערך את התאים על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי ביום האפס, השתמש בגן JAMA transfection reagent כדי להעביר תאי אריזה של צלחת E מצופה לילה עם OT MIDR אחד ביום הראשון זרע אחד כפול 10 לששת תאי ה- IPS לבאר אחת של צלחת 24 בארות מקודדת מראש של ג'לטין 0.1% ביום השני, אסוף את הנגיף המדומה, המכיל S natin, מתאי Plat E ולאחר מכן העביר אותו דרך מסנן של 0.4 מיקרון כדי לשלול מזהמים פוטנציאליים לאחר צנטריפוגה. התמרת התאים בנוכחות מוח פולי למשך שעה אחת ב-330 פעמים G ב-32 מעלות צלזיוס.

דגרו אותם למשך הלילה באותה טמפרטורה לאחר חזרה על הליך ההעברה. טריפסין מסתכל על תאי ה-IPS המומרים ביום הרביעי ולאחר מכן לאחר הגלולה, התאים משהים את התאים במדיה טרייה וזורעים אותם על תאי הזנה מקודדים מראש snl 7 6 7. לאחר שהתאים המומרים הגיעו לשטף, מיין את התאים החיוביים הכפולים האדומים GFP ו-DS על ידי ציטומטריית זרימה.

שישה שבועות לאחר ההעברה האימוץ של תאי ה-IPS, הזריקו 50 מיקרוליטר של EEG, שבעה תאי תומא לחלל הצפק של אותו עכבר ביום ה-50 לאתגר הגידול. השתמש בערכת בידוד תאי T חיוביים CD שמונה ביוטק mil E כדי למיין CD שמונה תאי T חיוביים מהטחול ובלוטות הלימפה של בעל החיים המועבר לאימוץ. מערבבים את ה-CD המבודד שמונה תאי T חיוביים עם גודל SPOC מוקרן מעכבר C 57 שחור נאיבי עם שישה J ביחס של 1 ל-10 ודופק את התרבית המשותפת עם 0.5 מיקרומול למיל ביציות למשך 40 שעות.

לאחר מכן, הוסף פלדן A לתאים למשך ארבע שעות נוספות. לבסוף, העריכו את אוכלוסיות התאים על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי לאחר בידוד ציטי SP מעכבר C 57 שחור נאיבי שש J. פצל את תרחיף התאים לשתי קבוצות.

סמן את הקבוצה הגבוהה של CFSE עם חמישה מיקרומול למיל CFSE ודפק את התאים עם 10 מיקרוגרם למיל של פפטיד ביציות למשך שעה, המסומן A-C-F-S-E קבוצה נמוכה עם 0.5 מיקרומול למיל CFSE ואל תדופק. מערבבים 2.5 כפול 10 לשישית, התאים הגבוהים CFSE עם 2.5 כפול 10 לשישי, התאים הנמוכים CFSE ב-PBS. לאחר מכן נתח את הציטים על ידי ציטומטריית זרימה לביטוי CFSE.

16 שעות לאחר ההעברה לאימוץ לעכבר המעניין לספור תאי גידול תוך-צפקי ביום 20 לאתגר הגידול. השתמש במזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בגודל 18 וחצי וב-PBS קר כדי לשטוף את חלל הצפק. ספור את תאי הגידול שהחלימו לזיהוי תאים חודרים לגידול.

הסר את הגידול בשלב מאוחר של אתגר הגידול ולאחר מכן חתוך את הגידול לשלושה חלקים. הנח את חתיכת הגידול הראשונה לתוך בקבוקון קריו והנח את הבקבוקון על קרח יבש. תקן מיד את החתיכה השנייה פורמלדהיד.

שמור את החלק השלישי במדיה ממוזגת RPMI 1640 לאחר ייבוש האוויר של חלקי הרקמה המשומרים בהקפאה. תקן אותם באצטון קר למשך 15 דקות לאחר ייבוש האוויר של החלקים הקבועים למשך 15 דקות נוספות. שטפו את השקופיות במשך חמש דקות ב-PBS לאחר הכביסה.

הנח את השקופיות בתא לח וכסה את חלקי הרקמה ב-30 מיקרוליטר של 3%B, SA ו-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום כריכה לא ספציפית. לאחר מכן מחק את המאגר החוסם ודגר את חלקי הרקמה בתערובת של 50 מיקרוליטר של נוגדן pe anti TCR RV אלפא שני ונוגדני פיצי אנטי ביציות מדולל ב-3% PSA ב-PBS בתא הלח למשך שעתיים בתום הדגירה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS קר, לבסוף הרכיבו את החלקים עם אמצעי הרכבה על בסיס מים לפני בדיקה מיקרוסקופית פלואורסצנטית לניתוח זרימה ציטומטרי של תאי T חודרים לגידול

מועכים את הגידול לתרחיף תא בודד. לאחר מכן נתח את התאים עבור סמני משטח ספציפיים. C, CD 3 ו-TCR beta משמשים כסמנים של תאי T כדי לקבוע אם גירוי של תאי IPS עם ליגנד החריץ DL 1 יכול לתרום לביטוי פני השטח של תאי T CD ארבע ו-CD שמונה ב-CD שלושה חיוביים TCR r בטא חיוביים לתאי IPS שמקורם בתאי IPS.

שימו לב לתרשים הנקודות מימין המציג את יום 22 CD שלושה חיובי TCR R בטא חיובי CD ארבעה CD שלילי שמונה תאי T חיוביים בודדים חיוביים שנוצרו מתאי IPS במבחנה. בנוסף, תא ה-IPS שמקורו בתאים חיוביים בודדים מהאיור הקודם ייצרו אינטרלוקין 2 ואינטרפרון גמא כאשר הם מגורים במבחנה על ידי נוגדנים אנטי-CD 3 ומסיסים נגד CD 28 מצופים בצלחת המאשרים שתאי T שמקורם בתאי IPS מתפקדים לאחר העברה אימוץ לעכברים מקבלים. רוב תאי ה-IPS המתומרים בגן TCR עברו התמיינות ל-CD שמונה CTLs חיוביים, שהגיבו במבחנה לגירוי פפטידי על ידי הפרשת אינטרלוקין 2 ואינטרפרון גמא בחלקות הנקודות הללו מתאי בלוטות הלימפה והטחול המאוגדות.

CD שמונה תאי V חיוביים בטא חמישה תאי T חיוביים נוצרו בעכברים שהועברו באימוץ עם תאי IPS מתמרים TCR אך לא ביקורת. האוכלוסיות החיוביות של CD שמונה V בטא חמש היו חיוביות לצביעה תוך תאית של ציטוקינים עבור אינטרלוקין 2 וייצור אינטרפרון גמא המיוצג בהיסטוגרמות אלה על ידי הקווים הכהים בהשוואה להיסטוגרמות בקרת איזוטיפ מוצללות המצביעות על כך שה-CTLs שמקורם ב-IPS היו פונקציונליים. נתונים אלה מראים שתאים גבוהים של CFSE פעמו עם אפטיד המיוצג על ידי הפסגות מימין בכל גרף ותאי בקרה נמוכים של CFSE המיוצגים על ידי הפסגות משמאל שהוזרקו לעכברים 10 שבועות לאחר העברת תאי IPS או יום אחד לאחר העברת CTL אחת של O OT.

ה-CTLs שמקורם באנטיגן הגיבו לגירוי אנטיגן והיו בעלי פעילות ציטוטוקסית כפי שעולה מהיעדר תאים גבוהים של CFSE כאן. OT תאי IPS שהומרו בגן TCR אחד הועברו באימוץ לשישה עכברים שחורים C 57 ולאחר מכן העכברים היו נתונים לאתגר עם EEG שבעה תאי גידול ביום 20 תאי גידול בחלל הצפק. שימו לב לירידה המשמעותית במספר תאי הגידול בעכברים שקיבלו TCR TRANSDUCTED IPS בהשוואה לקבוצות הביקורת.

והכי חשוב, העברה מאמצת של תאי IPS שעברו טרנספורמציה של TCR עוררה חדירה של CTLs תגובתיות יתר לרקמות הגידול והגנה על בעלי חיים מפני אתגר הגידול כפי שניתן לראות בצביעה זו של רקמות גידול שהתאוששו ימים 30 עד 35 לאחר אתגר הגידול גידולים מעכברים שהועברו באימוץ עם תאים מותמרים TCR או CTLs OT one אך לא הזרקה או ביקורת מדומה. תאים שעברו טרנספורמציה חדרו לתאים דלקתיים כפי שמצוין על ידי החצים האדומים כאן. נמצאו V אלפא ספציפיים לביציות, שני CTLs חיוביים באדום חודרים לביציות המבטאות רקמות גידול בירוק.

בעוד שלגידולים בעכברים מקבוצות הביקורת היו פחות תאים חודרים לגידול או בכלל באיור זה, תרחיפי תאים בודדים מרקמות הגידול נותחו לביטוי של V אלפא שתי חיוביות ו-V בטא חמש חיוביות על ידי זרימה ציטומטרית לאחר שער על האוכלוסייה החיובית CD שמונה. שימו לב שרקמות גידול מעכברים שהועברו באימוץ עם תאי IPS מותמרים TCR הראו את הרמה הגבוהה ביותר של תאים חודרים לגידול בעוד שגידולים מעכברים שקיבלו שליטה. IPS מותמר לא הראה חדירה על ידי CD ספציפי לביציות שמונה תאי T חיוביים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי IPS וכיצד להעריך את הפונקציות של תאי ה- IPS הנגזרים מתאי T.