התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

המטרה הכללית של נוהל זה היא להפיק ולאפיין לימפוציטים T מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (IPS cells). ניתן לגומה את תאי ה-IPS באופן in vitro על מערכת תרבית OP9 DL1 ולאחר מכן להבשילו באופן in vivo בעכבר עם חסר ב-Rag. לחלופין, ניתן להנדס את התאים גנטית כך שיבטאו באופן יתר את TCR OT-I ולאחר מכן להעבירם בהשתלה אדופטיבית לפיתוח in vivo.

לאחר ששה שבועות של דיפרנציאציה in vivo, ניתן להעביד את העכברים באמצעות הזרקה תוך-פעטונית של תאי גידול EEG seven, ולאחר מכן להעריך את הספציפיות לאנטיגן של תאי ה-T שהופקו מ-IPS. בסופו של דבר, תאי ה-IPS יכולים להבדיל עצמם הן לתאי T קונבנציונליים והן לתאי T ספציפיים לאנטיגן, אלו האחרונים מסוגלים להגן על בעלי חיים מפני חשיפה לגידול. ההשלכות של טכניקה זו נשמעות עד לאימונותרפיה מותאמת אישית לסרטן.

השיטה מאפשרת ייצור של מספרים גדולים של תאי T מגיבים לגידולים המופקים מכמות מינימלית של דם או רקמת עור של המטופל. ביום אפס, העבר 5×10⁴ תאי IPS לתוך צלחת תרבית של 100 מילימטר המכילה שכבה רצופה (confluent monolayer) של תאי OP9-DL1 במצע alpha-MEM עם 20% FBS. ביום החמישי, בצע trypsinization. לאחר מכן, סנטריפוג את התאים לאחר דגירה של 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C על גבי צלחת תרבית נקייה של 100 מילימטר. זרע 5×10⁵ מהתאים הצפים במצע alpha-MEM עם 20% FBS וליגנד mouse Flt3 לתוך צלחת 100 מילימטר חדשה המכילה שכבה של תאי OP9-DL1. ביום השמיני, שאב בעדינות את התאים שאינם קשורי היטב, סנטריפוג אותם, ולאחר מכן העבר את התאים לבאר אחת של פלטת תרבית בעלת 6 בארות המצופה בתאי OP9-DL1 רצופים. דגור את התאים בטמפרטורה של 37°C וב-5% CO₂ למשך שבועיים נוספים. ביום ה-22.

דגרו תאי IPS שהופרדו במצע טרי בצלחת תרבית חדשה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו כחצי מהתאים הצפים והעבירו אותם דרך מסננת ניילון של 70 micron כדי להוציא גושי תאים, ושטפו את תגלי התאים הבודדים שנוצרו שלוש פעמים ב-PBS קר. לאחר השטיפה השלישית, השהו מחדש את התאים ב-PBS בריכוז של 1.5 × 10⁷ תאים למיליליטר ושמרו את התאים על קרח לפני הזרקה IV.

הנח עכבר עם מחסור ב-rag בן ארבעה שבועות תחת אור אינפרה-אדום כדי להרחיב את וריד הזנב. לאחר מכן, מלא מזרק של 1 mL המצויד במחט בעובי 26.5 gauge ב-200 µL של תרחיף התאים והעבר את התאים בהשתלה אדופטיבית דרך וריד הזנב המורחב. שלושה שבועות מאוחר יותר, לאחר אישור ההמתה של העכבר שקיבל את ההשתלה האדופטיבית, הסר את קשרי הלימפה והטחול לאחר פירוק מכני של הרקמות.

בצע ליזה לתלים התאים הבודדים באמצעות בופר ליזה CK, ולאחר מכן שטוף את המונונוקלארים שהתקבלו פעמיים ב-PBS קר. לאחר צביעה של סמני שטח תאיים, הערך את התאים באמצעות ניתוח ציטומטריה זרימה ביום אפס. השתמש בריאגנט transfection מהג'ין JAMA כדי לבצע טרנספקציה למשך לילה לתאי אריזה plat E שנסתרו בצלחת עם OT one MIDR. ביום אחד, זרע 1×10⁶ תאי iPS לתוך באער אחת של פלטת 24 באערים שצופה מראש ב-0.1% ג'לטין. ביום שני, אסוף את הפסאודו-וירוס המכיל S natin מתאי ה-plat E ולאחר מכן העברה דרך מסנן של 0.4 מיקרון כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים לאחר סבוב בצנטריפוגה. בצע טרנסדוקציה לתאים בנוכחות poly brain למשך שעה אחת ב-330×g בטמפרטורה של 32 °C.

דגרו אותם למשך לילה בטמפרטורה זהה לאחר חזרה על הליך הטרנסדוקציה. ביום הרביעי, בצעו Trypsinization לתאי ה-IPS שעברו טרנסדוקציה, ולאחר תספין, השהו מחדש את התאים במצע טרי וזרעו אותם על תאי מזינים irradiated snl 7 6 7 מקודדים מראש. ברגע שהתאים שעברו טרנסדוקציה הגיעו לקונפלואנציה, בצעו מיון של התאים הכפולים החיוביים ל-GFP ו-DS red באמצעות ציטומטריה של זרימה.

ששה שבועות לאחר ההעברה האימונית (adoptive transfer) של תאי ה-IPS, מזריקים 50 µL של תאי EEG seven thoma אל חלל הפריטונאום של אותה עכבר ביום ה-50 של אתגר הגידול. השתמש בערכה לבידוד תאי T חיוביים ל-CD8 מבית Miltenyi Biotec כדי למיין תאי T חיוביים ל-CD8 מהטחול ומקשרי הלימפה של בעל החיים שעבר את ההעברה האימונית. ערבב את תאי ה-T החיוביים ל-CD8 המבודדים עם תאי SPOC irradiated מעכבר C57BL/6J נאיבי ביחס של 1:10, ובצע דופק (pulse) לתרבית המשותפת עם 0.5 µM של ova למשך 40 שעות.

לאחר מכן, הוסף felden A לתאים למשך ארבע שעות נוספות. לבסוף, הערך את אוכלוסיות התאים באמצעות ניתוח של זרימה ציטומטרית (flow cytometric analysis) לאחר בידוד SP cytes מעכבר C 57 black six J נאיבי. פצל את תרחיף התאים לשתי קבוצות.

סמנו את קבוצת ה-CFSE high באמצעות 5 µM של CFSE ובצעו פולס לתאים עם 10 µg/ml של פפטיד ova למשך שעה אחת; סמנו את קבוצת ה-CFSE low באמצעות 0.5 µM של CFSE וללא פולס. ערבבו 2.5 × 10⁶ תאי CFSE high עם 2.5 × 10⁶ תאי CFSE low ב-PBS. לאחר מכן, נתחו את התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) לבדיקת ביטוי CFSE.

16 שעות לאחר העברה אדופטיבית לעכבר הנבדק. כדי לספור תאי גידול תוך-פריטוניים ביום ה-20 של אתגר הגידול, השתמש במזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בכיל 18.5 וב-PBS קר לשטיפת החלל הפריטוני. ספור את תאי הגידול שהופקו לצורך זיהוי תאים המסתננים לגידול.

הסר את הגידול בשלב מאוחר של אתגר הגידול ולאחר מכן חתוך את הגידול לשלושה חלקים. הנח את חלק הגידול הראשון למבחנה לקירור (cryo vial) והנח את המבחנה על קרח יבש. קבע מיד את החלק השני בפורמלדהיד.

שמור את החלק השלישי במצע RPMI 1640 מותנה לאחר ייבוש באוויר של נתחי הרקמה שהוקפאו בשימור קריוגני. קבע אותם באצטון קר למשך 15 דקות לאחר ייבוש באוויר של הנתחים המקובעים למשך 15 דקות נוספות. שטוף את השקופיות למשך חמש דקות ב-PBS לאחר השטיפה.

הנח את השקופיות בתא לח, וכסה את חתכי הרקמה ב-30 µL של 3%B, SA ו-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום קישור לא ספציפי. לאחר מכן, ספוג את תמיסת החסימה והדגרה את חתכי הרקמה עם תערובת של 50 µL של נוגדן pe anti TCR RV alpha two ונוגדן fitzy anti ova המדוללים ב-3%PSA ב-PBS בתא הלח למשך שעתיים. בסיום ההדגרה, שטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS קר, ולבסוף רכס את החתכים באמצעות מדיום רכיסה על בסיס מים לפני בדיקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי לצורך ניתוח ציטומטריה של תאי T חודרי גידול.

מעכו את הגידול לסuspended של תאים בודדים. לאחר מכן, נתוחו את התאים לסממנים סביבתיים ספציפיים. CD3 ו-TCR beta שימשו כסממנים לתאי T כדי לקבוע האם גרייה של תאי iPS עם הליגנד notch DL1 עשויה לתרום לביטוי של CD4 ו-CD8 על פני השטח של תאים נגזרים מתאי iPS החיוביים ל-CD3 ו-TCR beta.

שימו לב לתרשים הפיזור (dot plot) מצד ימין, המציג תאי T חיוביים למסלול יחיד (single positive) מסוג CD3 חיובי, TCR $\beta$ חיובי, CD4 שלילי ו-CD8 חיובי, אשר נוצרו מתאי iPS in vitro ביום ה-22. בנוסף, תאי ה-single positive שהופקו מתאי iPS מהאיור הקודם ייצרו interleukin 2 ו-interferon gamma כאשר עוררו in vitro באמצעות נוגדני anti-CD3 מצופים על פלטה ונוגדני anti-CD28 מסיסים, מה שמאשר כי תאי ה-T שהופקו מתאי iPS הם תפקודיים לאחר העברה אדופטיבית לעכברי מקלט. מרבית תאי ה-iPS שעברו טרנסדוקציה של גן TCR עברו דיפרנציאציה ל-CTLs חיוביים ל-CD8, אשר הגיבו in vitro לגירוי פפטידי על ידי הפרשת interleukin 2 ו-interferon gamma, כפי שניתן לראות בתרשימי הפיזור אלה של תאים מאוחדים מקשרי לימפה ומהטחול.

תאי T חיוביים ל-CD8 וחיוביים ל-V beta 5 נוצרו בעכברים שהועברו להם באופן אדופטיבי תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של TCR, אך לא בעכברים שקיבלו תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של ביקורת. האוכלוסיות החיוביות ל-CD8 וחיוביות ל-V beta 5 היו חיוביות לצביעה תוך-תאית של ציטוקינים עבור ייצור של interleukin two ו-interferon gamma, המוצגים בהיסטוגרמות אלו על ידי הקווים הכהים בהשוואה להיסטוגרמות של ביקורת isotype המוצלות, מה שמעיד על כך שתאי ה-CTL המופקים מתאי IPS היו תפקודיים. נתונים אלו מראים תאים עם רמת CFSE גבוהה שהוצגו לפפטיד, המיוצגים על ידי הפסגות מימין בכל גרף, ותאי ביקורת עם רמת CFSE נמוכה המיוצגים על ידי הפסגות משמאל, שהוזרקו לעכברים 10 שבועות לאחר העברת תאי IPS או יום אחד לאחר העברת O OT one CTL.

תאי ה-CTL שהופקו מ-IPS ספציפיים לאנטיגן הגיבו לגירוי של אנטיגן והפגינו פעילות ציטוטוקסית, כפי שמעידה היעדרותם של תאי CFSE high כאן. תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של גן TCR מסוג OT one הועברו באופן אדופטיבי לעכברי C 57 black six, ולאחר מכן העכברים הועמדו לאתגר עם תאי גידול מסוג EEG seven; ביום 20 נספרו תאי הגידול בחלל הפריטונאום. שימו לב להפחתה המשמעותית במספר תאי הגידול בעכברים שקיבלו TCR TRANSDUCED IPS בהשוואה לקבוצות הביקורת.

החשוב מכל, העברה אדופטיבית של תאי IPS שעברו טרנסדוקציית TCR עוררה חדירה של תאי CTL תגובתיים-יתר לרקמות הגידול והגנה על בעלי החיים מפני אתגר גידול, כפי שניתן לראות בצביעה זו של H&E של רקמות גידול שהחלימו בימים 30 עד 35 לאחר אתגר הגידול; גידולים מעכברים שקיבלו העברה אדופטיבית של תאים שעברו טרנסדוקציית TCR או תאי OT one CTLs, אך לא אלו שקיבלו הזרקת דמה (mock) או ביקורת. התאים שעברו טרנסדוקציה חודרו על ידי תאים דלקתיים כפי שמוצג על ידי החצים האדומים כאן. תאי CTL חיוביים ל-V alpha two ספציפיים ל-Ova, בצבע אדום, נמצאו כחודרים לרקמות גידול המבטאות Ova, בצבע ירוק.

בעוד שבגידולים של עכברים מקבוצות הביקורת בדמות זו היו מעט תאים חודרים לגידול או שלא היו כלל, תלי השהייה של תאים בודדים מרקמות גידול נותחו באמצעות ציטומטריה של זרימה לבדיקת ביטוי של חיוביות ל-V alpha two וחיוביות ל-V beta five, לאחר ביצוע gating לאוכלוסייה חיובית ל-CD eight. שימו לב שרקמות גידול מעכברים שקיבלו העברה אדופטיבית של תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של TCR הראו את הרמה הגבוהה ביותר של תאים חודרים לגידול, בעוד שגידולים מעכברים שקיבלו תאי IPS שעברו טרנסדוקציה של ביקורת לא הראו חדירה של תאי T חיוביים ל-CD eight ספציפיים ל-ova.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי IPS, וכיצד להעריך את תפקודי תאי ה-T שהופקו מה-IPS.