Name: פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למד שיטה לייצור תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן מתאי גזע iPSCs לטיפול בארתריטיס אוטואימונית. השיטה מספקת אוכלוסייה אחידה של תאים פונקציונליים לשימוש בחקר וברפואה קלינית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן בחלקו תחת מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01AI121180, R21AI109239 ו K18CA151798), ה- American Diabetes Association (1-16-IBS-281), ואת מחלקת פנסילבניה הבריאות (קופות להתיישבות טבק) כדי JS

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of rheumatoid arthritis.</a> Nature. 423, 356-361 (2003).</li>
<li>Ferraro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+in+human+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation in human T regulatory cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>van Herwijnen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+that+recognize+a+ubiquitous+stress-inducible+self-antigen+are+long-lived+suppressors+of+autoimmune+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).</li>
<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105, 1431-1439 (2005).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lineage+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells.</a> Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> J Vis Exp. , e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בפרוטוקול זה, צעד קריטי הוא בידול במבחנה של iPSCs TCR / FoxP3-transduced הגן. איתות Notch חוץ גופית גורם להתפתחות כלפי השושלת תא T. כדי לבדל iPSCs לתוך CD4 + FoxP3 + Tregs, השתמשנו תאים ב OP9-DL1 / DL4 / IA, אשר מאוד מפורשת MHC II מולקולות (IA ב). רוב iPSCs להתמיין CD4 + תאים. עם זאת, לאחר ביטוי TCR שטח, תאים טרום-T בדיל רבים מאבדים את היכולת להבדיל ובסופו של דבר למות. כתוצאה מכך, את המספר הסלולרי של Tregs הפ...

דלקת מפרקים אוטואימונית היא מחלה מערכתית המאופיינת בהיפרפלזיה של רקמה סינוביאלית והרס מתקדם של סחוס מפרקי, עצם ורצועות1. הייצור או התפקוד הפגומים של Tregs בדלקת מפרקים אוטואימונית תורמים לדלקת כרונית ולפגיעה ברקמות מכיוון ש-Tregs ממלאים תפקיד מכריע במניעת התפתחות של תאי חיסון אוטו-ריאקטיביים. 
מניפולציה של Tregs היא אסטרטגיה אידיאלית לפיתוח טיפולים לדיכוי דלקת באופן תלוי Ag. עבור אימונותרפיה מבוססת Treg, הספציפיות של Tregs המועברים חשובה לטיפול באוטואימוניותמתמשכת 2. כדי להציג את הפעילות המדכאת, Tregs צריכים לנדוד ולהישמר באזור הפגוע, מה שיכול להיות מכוון על ידי הספציפיות של ה-TCR עבור Ag באותו מיקום3. למרות ש-Tregs רב-שבטיים עשויים להכיל אוכלוסייה קטנה המכילה את הספציפיות הזו של Ag מה-TCR שלהם, מספרי ה-Tregs הספציפיים ל-Ag הם בדרך כלל נמוכים. כתוצאה מכך, טיפולים מבוססי תאים המשתמשים ב-Tregs רב-שבטיים כנגד הפרעות אוטואימוניות דורשים העברות אימוץ של מספר רב של Tregs4,5. מכיוון שלתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) יש את היכולת להתפתח לכל סוג של תא, PSC-Tregs ספציפיים ל-Ag עשויים להתגלות כמועמדים טובים לאימונותרפיה מבוססת Treg. מחקרים קודמים הראו פיתוח מוצלח של תאי T שמקורם ב-PSC, כולל Tregs6-8. 
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח iPSC-Tregs ספציפיים ל-Ag. אנו מתארים עוד טיפול מבוסס תאים בדלקת מפרקים אוטואימונית במודל עכברי באמצעות Tregs כאלה. שיטה זו מבוססת על שינוי גנטי של iPSCs בעכברים עם TCRs ספציפיים ל-Ag וגורם השעתוק FoxP3. לאחר מכן, ה-iPSCs המהונדסים מתמיינים ל-Tregs ספציפיים ל-Ag על תאי הסטרומה של OP9 המבטאים מולקולות Notch ligands DL1, DL4 ו-MHC-II (I-Ab) בנוכחות ציטוקינים mFlt3L ו-mIL-7. iPSC-Tregs ספציפיים ל-Ag יכולים לייצר ציטוקינים מדכאים, כגון TGF-β ו-IL-10, כאשר הם מגורים עם Ag, ולהעברה מאמצת של Tregs כאלה יש את היכולת לדכא את התפתחות AIA במודל עכברי. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר לפיתוח Tregs ספציפיים ל-Ag שמקורם בתאי גזע להתערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

<table><tbody><tr><td>עכברי C57BL/6j</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CD3 (2C11) BD</td><td>Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) נוגדן</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD25 (3C7) Biolegend</td><td></td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF &beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>מדע משולב</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>זהירות: אלרגני, מסרטן, מאגר</td></tr><tr><td>פרמיביליזציה</td> רעיל <td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova albumin</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי t נגד אוטואימוניות

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

מחלות אוטואימוניות להתעורר עקב אובדן סובלנות עצמית אימונולוגית. בתאי T רגולטוריים (Tregs) הם מתווכים חשובים של סובלנות עצמית אימונולוגית. Tregs מייצג כ 5 - 10% של תת-אוכלוסיית תא CD4 + T הבוגר בעכברים ובבני אדם, עם כ 1 - 2% מאלה Tregs במחזור הדם ההיקפי. תאי גזע מושרים (iPSCs) יכול להיות מובחן לתוך Tregs תפקודית, אשר יש פוטנציאל לשמש עבור טיפולים מבוססי תאים של מחלות אוטואימוניות. כאן, אנו מציגים שיטה לפתח אנטיגן (Ag) Tregs -specific מ iPSCs (כלומר, iPSC-Tregs). השיטה מבוססת על שילוב גורם שעתוק FoxP3 ו קולטן תא Ag-T ספציפי (TCR) לתוך iPSCs ולאחר מכן הבחנה על תאי סטרומה OP9 להביע Notch הליגנדים דלתא דמוית (DL) 1 ו DL4. בעקבות הבידול חוץ גופית, iPSC-Tregs להביע CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, ו Ag ספציפי TCR והם מסוגלים להגיב לגירוי Ag.שיטה זו יושמה בהצלחה לטיפול מבוסס תאים של דלקת אוטואימונית מודל בעכברים. העברת המאמצת של Ag ספציפי iPSC-Tregs אלה לתוך מפרקים הנגרמת Ag (AIA) עכברים -bearing יש את היכולת להפחית דלקת מפרקים ונפיחות וכדי למנוע איבוד מסת העצם.

כפי שניתן לראות כאן, ביום 28, Ag הספציפי Tregs משמעותי הביע CD3 ו Ag הספציפי TCR, שני סמנים של תאי T. אוכלוסיית CD3 + TCRVβ5 + הביע CD4. רוב תאי CD3 + TCRVβ5 + CD4 + הביע גם CD25, CD127, ו CTLA-4, אשר באים לידי ביטוי בדרך כלל ברמות גבוהות טבעי ובתקנות T (nTregs) ו בתאי T להביע FoxP3 ectopically. ביטוי FoxP3 בתאי שמקורם iPSC נמשך גם לאחר לטווח ארוך בגירוי חוץ גופייה עם ליגנד ...

אנו מציגים כאן שיטה לפיתוח תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן פונקציונלי (Ag) (Tregs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) לאימונותרפיה של דלקת מפרקים אוטואימונית במודל עכברי.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לפתח שיטה חדשה להפקת תאי T רגולטוריים הקשורים למפרק דלקתי המגוזרים מתאי גזע, עבור אימונותרפיה נגד דלקת מפרקים אוטואימונית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בתחום האוטואימוניות בנוגע לאפשרויות אימונותרפיות עבור דלקת מפרקים אוטואימונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי ה-T הרגולטוריים המגוזרים מתאי גזע הם בעלי טיפוס אנטיגני ספציפי (nyped) ומסוג אחד בלבד.התחילו בדילול תאי המזין (feeder cells) הרלוונטיים לצפיפות מינימלית של 1x10⁴ תאים לסמ"ר בתווך OP9, וזריעת 1x10⁶ תאי מזין בכל צלחת בקוטר 10 ס"מ. כאשר התאים מגיעים ל-80% עד 90% התמזגות (confluence), הסירו את התווך מהתרביות וזרעו 0.5 עד 1x10⁵ תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה (iPSCs) שעברו טרנסדוקציה רטרו-ויראלית בתווך OP9 בכל צלחת. לאחר חמישה ימים, שאבו את התווך ושטפו את התאים עם 10 milliliters של PBS.לאחר מכן,נתקו את התאים באמצעות 4 mL של Trypsin לכל צלחת, בטמפרטורה של 37 °C. לאחר 10 דקות, עצרו את התגובות באמצעות 8 mL של מצע IPSC והעבירו את התאים לצנטריפוגה. השעיקו את המשקע ב-10 mL של מצע IPSC טרי והעבירו את התאים לצלחות חדשות בקוטר 10 cm.אפשרו לתאי המזין (feeder cells) להיצמד לפיתח במשך 30 דקות באינקובטור לתרבית תאים. לאחר מכן, אספו את תאי ה-IPSCs הצפים וסננו את התאים שעברו טרנסדוקציה דרך מסננת של 70 micron לצורך ספירה. זרעו 5×10⁵ תאי IPSCs על פיתח טרי של תאי מזין בקונופלואנסיות של 80% עד 90%, במצע OP9 מועשר ב-Murine-Flt3-Ligand, והחזירו את התרביות לאינקובטור.לאחר שלושה ימים, השתמשו בפיפט של 10 מיליליטר כדי לשטוף את הצלחת עם תוצר התרבית. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע OP9 טרי לצלחת ושטפו בעדינות כל תאי IPSCs חצי-נ adherent באמצעות פיפטור זהיר אך נחרץ, שאינו פוגע בשכבת תאי המזין (feeder cell layer). חזרו על השטיפה עם 10 מיליליטר של PBS כדי לאסוף את שארית התאים החצי-adherent, והעבירו את השטיפות מכל צלחת לשפופרת קונית אחת לכל תרבית.לאחר סבב צנטריפוגה להורדת התאים, השביה מחדש את המשקעים ב-10 milliliters של מצע OP9 מועשר ב-Murine-Flt3-Ligand וב-IL-7, וסנן את התאים דרך מסננת של 70 micron. זרע תרבית IPSC אחת לכל באר בתוך פלטת תרבית של שש בארות המכילה שכבות מונו-שכבה של תאי מאכילה (feeder cells) בקונופלואנס של 80% עד 90%, והחזר את תרביות השיתוף (co-cultures) לאינקובטור. מדי יומיים, החלף מחצית מהמצע במצע OP9 טרי המועשר ב-Murine-Flt3-Ligand וב-IL-7, ומדי ארבעה עד שישה ימים, זרע מחדש את תאי ה-IPSCs המבדילים על פלטות חדשות עם שכבה טרייה של תאי מאכילה, לפי הצורך.התחילו בניתוק תרביות התאים הרלוונטיות באמצעות Trypsin וסספנדו מחדש כל סוג תא ב-10 milliliters של מצע טרי. זרעו כל תרבית תאים בצלחת חדשה של 10 centimeter ואפשרו לתאי המזינים (feeder cells) להיצמד בתוך אינקובטור לתרביות תאים. לאחר 30 דקות, אספו את תאי ה-iPSCs הצפים והעבירו את התרביות דרך מסנני תאים נפרדים של 70 micron כדי להסיר מקבצי תאים לצורך ספירה.יש להשעות מחדש כל תרבית בריכוז של 1.5 × 10⁷ תאים למיליליטר ב-PBS קר, תוך סינון חוזר במידת הצורך. לאחר מכן, יש להניח עכברים נקבות מסוג C57BL/6 בני ארבעה עד שישה שבועות, אחד אחד, במכשיר לריסון בעלי חיים קטנים, ולהעביר באופן אדופטיבי 200 µL של סוג תא אחד לכל עכבר לתוך וריד הזנב של כל חיה. השתמשו בקליבר עם שעון כדי למדוד את הנפיחות של שני הברכיים לצורך קביעת מדידת הבסיס.10 ימים לאחר העברת התאים, השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי להזריק לעכברים 100 micrograms של methylated BSA שהומוסג ב-complete Freund's adjuvant בבסיס הזנב של כל חיה ניסויית. 17 ימים לאחר העברת התאים, גרם לדלקת פרקים באמצעות הזרקה תוך-מפרקית של 20 micrograms של methylated BSA ב-10 microliters של PBS למפרק הברך השמאלי, ו-20 micrograms של methylated BSA ו-100 micrograms של whole Ovalbumin ב-10 microliters של PBS למפרק הברך הימני של כל חיה שהורדמה ועברה העברה אדופטיבית. שבעה ימים לאחר השראת דלקת הפרקים, מדוד שוב את הברכיים לצורך חישוב אחוז העלייה בקוטר הברך, ובצע כריתה כירורגית של הפיקות.קבעו את המפרקים בפורמלין. לאחר מכן, בעקבות דקאלציפיקציה ב-EDTA, טמנו את הברכיים בפאראפין והפיקו חתכים בעובי של ארבעה מיקרון לצורך צביעה היסטוכימית ואנליזה. ביום ה-28, תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן מבטאים רמות משמעותיות של CD3 וקולטני T ספציפיים לאנטיגן.מרבית תאים אלה מבטאים גם CD25, CD127 ו-CTLA-4, אשר כולם מבטאים בדרך כלל רמות גבוהות בתאי T רגולטוריים המופיעים באופן טבעי. ואכן, FoxP3 נשמר בתאי T רגולטוריים המופקים מ-iPSC, גם לאחר סטימולציה ארוכה in vitro עם ליגנד של Notch, כפי שזוהה על ידי צביעה תוך-תאית. בנוסף, תאי T רגולטוריים אלו מ-iPSC, הספציפיים לאנטיגן, מייצרים ציטוקינים מדכאים כאשר הם מעוררים in vitro על ידי ספלנוציטים שנטענו באנטיגן, מה שמעיד על פנוטיפ מדכא פוטנציאלי של תאים אלו.תאי FoxP3 חיוביים נצפים בברכיים שטופלו ב-OVA, בעוד שבתאי ברכיים שקיבלו IPSCs שעברו טרנסדוקציה עם וקטור בקרה לא נראים תאי FoxP3 חיוביים. יתרה מכך, נצפים הרבה יותר תאים חיוביים ל-CD4, FoxP3 ו-TCR3 Beta 5 בברכיהם של עכברים שקיבלו IPSCs שעברו טרנסדוקציה עם וקטור TCR-FoxP3, מאשר אלו שקיבלו את וקטור FoxP3 לבדו, מה שמרמז כי תאי IPSC-Treg ספציפיים לאנטיגן נודדים לברכיים עם דלקת מפרקים מושרית-אנטיגן לאחר העברתם האדופטיבית לבעלי החיים המקבלים. העברה אדופטיבית של תאים המופקים מ-IPSC גורמת גם לירידה משמעותית בנפיחות הדלקתית של הברך בנוכחות OVA, אך אינה משפיעה על ברכיים שזוהקו ב-BSA מתילציה כבקרה.ההשפעות החיוביות של הפחתת הנפיחות מומחשות עוד יותר באמצעות דימוי Micro-CT ברזולוציה גבוהה של הפחתה באובדן העצם שנצפתה בברכיים שטופלו בהעברת תאים, בהשוואה לבעלי חיים שקיבלו הזרקה של MBSA בלבד כביקורת. לאחר הרכישת המיומנויות, ניתן להשלים הליכים מעמיקים אלו בתוך שישה שבועות אם הם מבוצעים כראוי. בעת ניסיון ליישם טכניקה זו, חשוב לזכור להשרות דיפרנציאציה מודרכת של IPSCs שעברו טרנסדוקציה של אנטיגן TCR-FoxP3.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבחון גם תרכובות שונות של ציטוקינים מדכאים כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להישרדות ואיכות של תאי IPSCs T reg ספציפיים לאנטיגן. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול המבוסס על תאים לבחון את תפקידם של תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן במחלות אוטואימוניות. זכרו כי עבודה עם חיידקים אוטובודיים ישירים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במתקן בסיסי בעל שתי רמות בטיחות, בעת ביצוע הפרוצדורה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.

development-stem-cell-derived-antigen-specific-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

רגולציה T תאים: הפוטנציאל הטיפולי לטיפול דחייה וסוג אני סוכרת

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

הדור של לימפוציטים T מ המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים נותן גישה חלופית של שימוש בתאי גזע עובריים על חיסוני מבוססי תאים T. השיטה מלמדת כי על ידי ניצול...

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

סרטון זה מציג טיפול מבוסס תאים לדלקת מפרקים אוטואימונית בעכברים. תאי בקרת T שמקורם ב-iPSC המבטאים קולטנים ספציפיים לאובאלבומין מוזרקים עם אלבומין בסרום בקר שעבר מתילציה (mBSA) ומתחלב באדג'ובנט. תאים מציגי אנטיגן מורין (APCs) מעבדים ומציגים את mBSA לתאי T, מה שגורם להפעלת תאי T ונדידה לקרום הסינוביאלי של מפרק הברך. זריקות עוקבות כוללות mBSA לבד בברך שמאל ושילוב של mBSA ואובלבומין בברך ימין. בברך שמאל, התגובה החיסונית ל- mBSA מעוררת דלקת פרקים, ואילו בברך ימין, תאי T מווסתים אינטראקציה עם...

טיפול מבוסס תאים לדלקת מפרקים אוטואימונית במודל מורין

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T...

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת אנטיגן גידול פונקציונלי-ספציפי המושרה pluripotent תא גזע בודד באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף.

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

למד שיטה לייצור תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן מתאי גזע iPSCs לטיפול בארתריטיס אוטואימונית. השיטה מספקת אוכלוסייה אחידה של תאים פונקציונליים לשימוש בחקר וברפואה קלינית.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

גלה סרטונים נוספים