פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לפתח שיטה חדשה להפקת תאי T רגולטוריים הקשורים למפרק דלקתי המגוזרים מתאי גזע, עבור אימונותרפיה נגד דלקת מפרקים אוטואימונית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בתחום האוטואימוניות בנוגע לאפשרויות אימונותרפיות עבור דלקת מפרקים אוטואימונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי ה-T הרגולטוריים המגוזרים מתאי גזע הם בעלי טיפוס אנטיגני ספציפי (nyped) ומסוג אחד בלבד.

התחילו בדילול תאי המזין (feeder cells) הרלוונטיים לצפיפות מינימלית של 1x10⁴ תאים לסמ"ר בתווך OP9, וזריעת 1x10⁶ תאי מזין בכל צלחת בקוטר 10 ס"מ. כאשר התאים מגיעים ל-80% עד 90% התמזגות (confluence), הסירו את התווך מהתרביות וזרעו 0.5 עד 1x10⁵ תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה (iPSCs) שעברו טרנסדוקציה רטרו-ויראלית בתווך OP9 בכל צלחת. לאחר חמישה ימים, שאבו את התווך ושטפו את התאים עם 10 milliliters של PBS.

לאחר מכן,נתקו את התאים באמצעות 4 mL של Trypsin לכל צלחת, בטמפרטורה של 37 °C. לאחר 10 דקות, עצרו את התגובות באמצעות 8 mL של מצע IPSC והעבירו את התאים לצנטריפוגה. השעיקו את המשקע ב-10 mL של מצע IPSC טרי והעבירו את התאים לצלחות חדשות בקוטר 10 cm.

אפשרו לתאי המזין (feeder cells) להיצמד לפיתח במשך 30 דקות באינקובטור לתרבית תאים. לאחר מכן, אספו את תאי ה-IPSCs הצפים וסננו את התאים שעברו טרנסדוקציה דרך מסננת של 70 micron לצורך ספירה. זרעו 5×10⁵ תאי IPSCs על פיתח טרי של תאי מזין בקונופלואנסיות של 80% עד 90%, במצע OP9 מועשר ב-Murine-Flt3-Ligand, והחזירו את התרביות לאינקובטור.

לאחר שלושה ימים, השתמשו בפיפט של 10 מיליליטר כדי לשטוף את הצלחת עם תוצר התרבית. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע OP9 טרי לצלחת ושטפו בעדינות כל תאי IPSCs חצי-נ adherent באמצעות פיפטור זהיר אך נחרץ, שאינו פוגע בשכבת תאי המזין (feeder cell layer). חזרו על השטיפה עם 10 מיליליטר של PBS כדי לאסוף את שארית התאים החצי-adherent, והעבירו את השטיפות מכל צלחת לשפופרת קונית אחת לכל תרבית.

לאחר סבב צנטריפוגה להורדת התאים, השביה מחדש את המשקעים ב-10 milliliters של מצע OP9 מועשר ב-Murine-Flt3-Ligand וב-IL-7, וסנן את התאים דרך מסננת של 70 micron. זרע תרבית IPSC אחת לכל באר בתוך פלטת תרבית של שש בארות המכילה שכבות מונו-שכבה של תאי מאכילה (feeder cells) בקונופלואנס של 80% עד 90%, והחזר את תרביות השיתוף (co-cultures) לאינקובטור. מדי יומיים, החלף מחצית מהמצע במצע OP9 טרי המועשר ב-Murine-Flt3-Ligand וב-IL-7, ומדי ארבעה עד שישה ימים, זרע מחדש את תאי ה-IPSCs המבדילים על פלטות חדשות עם שכבה טרייה של תאי מאכילה, לפי הצורך.

התחילו בניתוק תרביות התאים הרלוונטיות באמצעות Trypsin וסספנדו מחדש כל סוג תא ב-10 milliliters של מצע טרי. זרעו כל תרבית תאים בצלחת חדשה של 10 centimeter ואפשרו לתאי המזינים (feeder cells) להיצמד בתוך אינקובטור לתרביות תאים. לאחר 30 דקות, אספו את תאי ה-iPSCs הצפים והעבירו את התרביות דרך מסנני תאים נפרדים של 70 micron כדי להסיר מקבצי תאים לצורך ספירה.

יש להשעות מחדש כל תרבית בריכוז של 1.5 × 10⁷ תאים למיליליטר ב-PBS קר, תוך סינון חוזר במידת הצורך. לאחר מכן, יש להניח עכברים נקבות מסוג C57BL/6 בני ארבעה עד שישה שבועות, אחד אחד, במכשיר לריסון בעלי חיים קטנים, ולהעביר באופן אדופטיבי 200 µL של סוג תא אחד לכל עכבר לתוך וריד הזנב של כל חיה. השתמשו בקליבר עם שעון כדי למדוד את הנפיחות של שני הברכיים לצורך קביעת מדידת הבסיס.

10 ימים לאחר העברת התאים, השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי להזריק לעכברים 100 micrograms של methylated BSA שהומוסג ב-complete Freund's adjuvant בבסיס הזנב של כל חיה ניסויית. 17 ימים לאחר העברת התאים, גרם לדלקת פרקים באמצעות הזרקה תוך-מפרקית של 20 micrograms של methylated BSA ב-10 microliters של PBS למפרק הברך השמאלי, ו-20 micrograms של methylated BSA ו-100 micrograms של whole Ovalbumin ב-10 microliters של PBS למפרק הברך הימני של כל חיה שהורדמה ועברה העברה אדופטיבית. שבעה ימים לאחר השראת דלקת הפרקים, מדוד שוב את הברכיים לצורך חישוב אחוז העלייה בקוטר הברך, ובצע כריתה כירורגית של הפיקות.

קבעו את המפרקים בפורמלין. לאחר מכן, בעקבות דקאלציפיקציה ב-EDTA, טמנו את הברכיים בפאראפין והפיקו חתכים בעובי של ארבעה מיקרון לצורך צביעה היסטוכימית ואנליזה. ביום ה-28, תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן מבטאים רמות משמעותיות של CD3 וקולטני T ספציפיים לאנטיגן.

מרבית תאים אלה מבטאים גם CD25, CD127 ו-CTLA-4, אשר כולם מבטאים בדרך כלל רמות גבוהות בתאי T רגולטוריים המופיעים באופן טבעי. ואכן, FoxP3 נשמר בתאי T רגולטוריים המופקים מ-iPSC, גם לאחר סטימולציה ארוכה in vitro עם ליגנד של Notch, כפי שזוהה על ידי צביעה תוך-תאית. בנוסף, תאי T רגולטוריים אלו מ-iPSC, הספציפיים לאנטיגן, מייצרים ציטוקינים מדכאים כאשר הם מעוררים in vitro על ידי ספלנוציטים שנטענו באנטיגן, מה שמעיד על פנוטיפ מדכא פוטנציאלי של תאים אלו.

תאי FoxP3 חיוביים נצפים בברכיים שטופלו ב-OVA, בעוד שבתאי ברכיים שקיבלו IPSCs שעברו טרנסדוקציה עם וקטור בקרה לא נראים תאי FoxP3 חיוביים. יתרה מכך, נצפים הרבה יותר תאים חיוביים ל-CD4, FoxP3 ו-TCR3 Beta 5 בברכיהם של עכברים שקיבלו IPSCs שעברו טרנסדוקציה עם וקטור TCR-FoxP3, מאשר אלו שקיבלו את וקטור FoxP3 לבדו, מה שמרמז כי תאי IPSC-Treg ספציפיים לאנטיגן נודדים לברכיים עם דלקת מפרקים מושרית-אנטיגן לאחר העברתם האדופטיבית לבעלי החיים המקבלים. העברה אדופטיבית של תאים המופקים מ-IPSC גורמת גם לירידה משמעותית בנפיחות הדלקתית של הברך בנוכחות OVA, אך אינה משפיעה על ברכיים שזוהקו ב-BSA מתילציה כבקרה.

ההשפעות החיוביות של הפחתת הנפיחות מומחשות עוד יותר באמצעות דימוי Micro-CT ברזולוציה גבוהה של הפחתה באובדן העצם שנצפתה בברכיים שטופלו בהעברת תאים, בהשוואה לבעלי חיים שקיבלו הזרקה של MBSA בלבד כביקורת. לאחר הרכישת המיומנויות, ניתן להשלים הליכים מעמיקים אלו בתוך שישה שבועות אם הם מבוצעים כראוי. בעת ניסיון ליישם טכניקה זו, חשוב לזכור להשרות דיפרנציאציה מודרכת של IPSCs שעברו טרנסדוקציה של אנטיגן TCR-FoxP3.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבחון גם תרכובות שונות של ציטוקינים מדכאים כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להישרדות ואיכות של תאי IPSCs T reg ספציפיים לאנטיגן. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול המבוסס על תאים לבחון את תפקידם של תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן במחלות אוטואימוניות. זכרו כי עבודה עם חיידקים אוטובודיים ישירים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במתקן בסיסי בעל שתי רמות בטיחות, בעת ביצוע הפרוצדורה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.