פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לפתח שיטה חדשה ליצירת תאי T מודלקים הקשורים למפרקים מודלקים שמקורם בתאי גזע לאימונותרפיה נגד דלקת מפרקים אוטואימונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום האוטואימוני לגבי אימונותרפיוטיקה פוטנציאלית לדלקת מפרקים אוטואימונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי ה-T הרגולטוריים שמקורם בתאי גזע הם מסוג יחיד.

התחל בדילול תאי ההזנה המעניינים לצפיפות מינימלית של אחד כפול 10 התאים הרביעיים לסנטימטר רבוע במדיום OP9, וציפוי אחד כפול 10 לתאי ההזנה השישיים לכל צלחת של 10 סנטימטר. כאשר התאים הופכים ל-80 עד 90% מתלכדים, הסר את המדיום מהתרביות וזרע 0.5 עד 1 פעמים 10 עד החמישית, תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה רטרו-ויראלית או IPSCs במדיום OP9 בכל צלחת. חמישה ימים לאחר מכן, שאפו את המדיום ושטפו את התאים עם 10 מיליליטר PBS.

לאחר מכן, נתקו את התאים עם ארבעה מיליליטר טריפסין למנה, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, עצרו את התגובות עם שמונה מיליליטר של מדיום IPSC ומשכו את התאים לצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום IPSC טרי וציפו מחדש את התאים על צלחות חדשות של 10 סנטימטרים.

אפשר לתאי ההזנה להיצמד לצלחת למשך 30 דקות בחממת תרבית התאים. לאחר מכן, אספו את ה-IPSCs הצפים וסננו את התאים המומרים דרך מסננת של 70 מיקרון לספירה. זרע חמש פעמים 10 עד החמישי IPSCs על צלחת טרייה של 80 עד 90% של תאי הזנה במדיום OP9 בתוספת Murine-Flt3-Ligand והחזר את התרביות לחממה.

לאחר שלושה ימים, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לשטוף את המנה עם מדיום התרבות. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום OP9 טרי לכלי ושטפו בעדינות את כל ה-IPSCs הדביקים למחצה עם פיפטינג זהיר ועוצמתי שאינו משבש את שכבת תאי ההזנה. חזור על הכביסה עם 10 מיליליטר PBS כדי לקצור את אחרון התאים הדבקים למחצה, ומשוך את השטיפות מכל מנה לצינור חרוטי אחד לכל תרבית.

לאחר סיבוב התאים, השעו מחדש את הכדורים ב-10 מיליליטר של מדיום OP9 בתוספת Murine-Flt3-Ligand ו-IL-7 וסנן את התאים דרך מסננת של 70 מיקרון. זרע תרבית IPSC אחת לכל באר לתוך צלחת תרבית בת שש בארות המכילה 80 עד 90% חד-שכבות של תאי הזנה קונפלואנטים והחזירו את התרביות המשותפות לחממה. כל יומיים, החלף מחצית מהמדיום במדיום OP9 טרי בתוספת Murine-Flt3-Ligand ו-IL-7, וכל ארבעה עד שישה ימים, זרע מחדש את ה-IPSCs המבדילים על צלחות חדשות עם שכבה טרייה של תאי הזנה לפי הצורך.

התחל בניתוק תרביות התאים המעניינות עם טריפסין והשעיה מחדש של כל סוג תא ב-10 מיליליטר של מדיום טרי. צלחת כל תרבית תאים בצלחת חדשה של 10 סנטימטרים ואפשר לתאי ההזנה להיצמד לחממת תרבית התאים. לאחר 30 דקות, אספו את ה-IPSCs הצפים והעבירו את התרביות דרך מסנני תאים בודדים של 70 מיקרון כדי להסיר את אשכולות התאים לספירה.

השעו מחדש כל תרבית בריכוז של 1.5 פעמים 10 עד שביעי תאים למיליליטר ב-PBS קר, וסננו שוב לפי הצורך. לאחר מכן, הניחו עכברים נקבות C57BL/6 בנות ארבעה עד שישה שבועות בזה אחר זה במסננת של בעלי חיים קטנים והעבירו באימוץ 200 מיקרוליטר מסוג אחד של תאים לכל עכבר לווריד הזנב של כל חיה. השתמש בקליפר מד חיוג כדי למדוד את הנפיחות של שתי הברכיים כדי לקבוע את מדידת הבסיס.

10 ימים לאחר העברת התאים, השתמש במזרק מיליליטר אחד כדי להזריק לעכברים 100 מיקרוגרם של BSA שעבר מתילציה מתחלב באדג'ובנט פרוינד שלם בבסיס הזנב של כל חיית ניסוי. 17 ימים לאחר העברת התאים, יש לגרום לדלקת פרקים על ידי הזרקה תוך מפרקית של 20 מיקרוגרם של BSA שעבר מתילציה ב-10 מיקרוליטר PBS למפרק הברך השמאלית ו-20 מיקרוגרם של BSA שעבר מתילציה ו-100 מיקרוגרם של אובאלבומין שלם ב-10 מיקרוליטר של PBS למפרק הברך הימנית של כל בעל חיים מורדם שהועבר לאימוץ. שבעה ימים לאחר השראת דלקת המפרקים, מדוד שוב את הברכיים לחישוב אחוז העלייה בקוטר הברך, וכרת את הפיקה בניתוח.

תקן את המפרקים בפורמלין. לאחר מכן, לאחר הסרת האבדן ב-EDTA, הטמיעו את הברכיים בפרפין וקבלו ארבעה חלקי מיקרון לצביעה וניתוח היסטוכימיים. ביום ה-28, תאי הרגולציה הספציפיים לאנטיגן מבטאים רמות משמעותיות של קולטני CD3 ותאי T ספציפיים לאנטיגן.

רוב התאים הללו מבטאים גם CD25, CD127 ו-CTLA-4, שכולם מתבטאים בדרך כלל ברמות גבוהות בתאי T מווסתים טבעיים. ואכן, FoxP3 ממשיך להתקיים בתאי T רגולטוריים שמקורם ב-IPSC, גם לאחר גירוי מבחנה ארוך טווח עם ליגנד ה-Notch, כפי שזוהה על ידי צביעה תוך תאית. בנוסף, תאי ויסות IPSC T ספציפיים לאנטיגן מייצרים ציטוקינים מדכאים כאשר הם מגורים עם טחול פועם אנטיגן במבחנה, מה שמעיד על פנוטיפ מדכא פוטנציאלי עבור תאים אלה.

תאים חיוביים ל-FoxP3 נצפים בברכיים שטופלו ב-OVA ללא תאים חיוביים ל-FoxP3 הנראים בברכיים המקבלות IPSCs המומרים על ידי וקטור בקרה. יתר על כן, הרבה יותר תאים חיוביים ל-CD4, חיוביים ל-FoxP3, TCR3 Beta 5 נראים בברכיהם של עכברים המקבלים IPSCs שהומרו עם וקטור TCR-FoxP3, מאשר עם וקטור FoxP3 בלבד, מה שמצביע על כך שתאי IPSC-Treg ספציפיים לאנטיגן נודדים לברך דלקת מפרקים הנגרמת על ידי אנטיגן לאחר העברתם לאימוץ לבעלי חיים מקבלים. העברת תאים מאמצת שמקורה ב-IPSC משפיעה גם על ירידה משמעותית בנפיחות הדלקתית בברך כאשר קיימת OVA, אך אין לה השפעה על ברכיים מוזרקות BSA במתילציה בקרה.

ההשפעות החיוביות של הפחתת הנפיחות מוכחות עוד יותר על ידי הדמיית מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה של אובדן העצם המופחת שנצפה בברכיים שטופלו בהעברת תאים בהשוואה לבעלי חיים שהוזרקו ב-MBSA בלבד. לאחר הגיוס, הליך מעמיק זה יכול להסתיים תוך שישה שבועות אם הוא מבוצע כראוי. תוך כדי ניסיון טכניקה זו, חשוב לזכור לגרום להתמיינות המוטמעת של ה-IPSCs המומרים באנטיגן TCR-FoxP3.

בעקבות הליך זה, ניתן גם לדון בתרכובות שונות של ציטוקינים מדכאים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההישרדות והאיכות של תאי ה-IPSCs T הספציפיים לאנטיגן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול מבוסס התאים לחקור את תפקידם של תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן במחלות אוטואימוניות. אל תשכח שעבודה עם חיידקי גוף ישירים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה בשני מתקנים בסיסיים, בעת ביצוע הליך.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.