תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השלבים הכרוכים בתגובת שרשרת הפולימראז או PCR, המשמשת לייצור אספקה מספקת של קטע ספציפי של DNA מכמות קטנה של חומר מוצא. ראשית, הרכיבו את הריאגנטים והחומרים שישמשו בתגובת ה-PCR, ולאחר מכן הקימו את תערובת התגובה, כולל ארבעת הריבונוקלאוטידים של דאוקסי, תבנית ה-DNA, הפריימרים וה-DNA פולימראז. התוכנית הבאה, תנאי המחזור התרמי והפעלת תגובת ה-PCR.

לאחר מכן. בדוק את התוצאות כדי לקבוע אם התגובה הצליחה. בסופו של דבר, תגובת שרשרת פולימראז אמורה להניב אמפליקון ספציפי בגודל המוצר הרצוי.

בדרך כלל, אנשים חדשים בפרוטוקול זה יתקשו מעט בהגדרת החישובים של כל אחד מהריאגנטים המשתנים, ולפעמים יש להם בעיות עם הפיפטינג, הנפחים הנכונים, במיוחד עם הפולימראז שיש בו גליצרול. התחל את הניסוי עם דלי קרח טרי. ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום התגובה.

תערובת וריאגנטים. מסדרים את רכיבי ה-PCR על קרח להפשרה מלאה. אלה כוללים את פריימרים של תבנית ה-DNA, מאגר תגובה של DNA פולימראז 10 x עם או בלי מגנזיום כלוריד, נוקלאוטידים דאוקסי, מים סטריליים ומגנזיום כלוריד.

מגנזיום כלוריד נדרש אם משתמשים במאגר ללא מגנזיום כלוריד. הנח צלחת 96 בארות בדלי קרח כמחזיק לצינורות ה-PCR הדקים של 0.2 מיליליטר. כעת ציידו את שולחן העבודה בצינורות וכובעים PCR.

מתלה צינורות PCR, טוש עמיד לאתנול וסט מיקרו פיפטרים. צור תמיד טבלה של ריאגנטים המפרטת את תערובת התגובה עם מים מזוקקים סטריליים קוונטיים כדי להשיג נפח סופי של 50 מיקרוליטר. לדוגמה, שימוש בחמישה מיקרוליטר של מאגר ללא מגנזיום, מיקרוליטר אחד של 10 מילי-מולרי DN NTPs ומגנזיום אופטימלי של 4.0 מילי-מולרי.

מיקרוליטר אחד מכל 20 פריימרים מיקרומולריים, 0.5 מיקרוליטר של שני ננוגרם לתבנית מיקרוליטר. ו-0.5 מיקרוליטר פולימראז ידרוש 33 מיקרוליטר מים סטריליים בלבד. הוסף מגנזיום כלוריד אם הוא לא קיים במאגר פי 10 או במידת הצורך לאופטימיזציה של PCR.

המשך לתייג את צינורות ה-PCR עם סמן עמיד לאתנול לכל צינור תגובה. ראשית, הוסף את הכמויות המחושבות של מים סטריליים, ולאחר מכן הוסף 10 x buffer ו-10 מילי-מולרי DN NTPs. עבור תגובה זו, אנו מבצעים טיטרציה עם מגנזיום כלוריד.

מכיוון שריכוז המגנזיום לא יהיה קבוע, מגנזיום כלוריד מתווסף לצינורות ה-PCR בנפרד, והנפח מנורמל ל-10 מיקרוליטר עם מים סטריליים, כך שמתווספים 40 מיקרוליטר מתערובת המאסטר הסופית לכל צינור PCR. כדי להשלים את תגובת 50 המיקרוליטר ומגנזיום כלוריד, המשך להוסיף את תבנית ה-DNA והפריימרים. לבסוף, הוסף 0.5 עד 2.5 יחידות של DNA פולימראז לכל תגובה של 50 מיקרוליטר בצינור מיקרו-פוגה של 1.8 מיליליטר.

הכן תמיסת תערובת מאסטר מספיק כדי להכיל בקרות כמו גם אובדן העברת פיפטה. הגדר מיקרו פיפטר לכמחצית מנפח התמיסה הכולל וערבב בעדינות על ידי פיפטינג. עבור כל דגימת בדיקה תערובת מאסטר רהוטה לתוך צינור PCR.

כעת לבקרה השלילית ללא DNA תבנית, הוסף את כל הריאגנטים והשתמש במים סטריליים כדי לפצות על נפח ה- DNA החסר. לאחר מכן, לצורך הבקרה החיובית, השתמש בקבוצה של DNA תבנית ופריימרים המגדילים שבר ידוע באותם תנאים כמו דגימות ה-PCR הניסיוניות. מחזורים תרמיים של PCR מחממים ומקררים במהירות את תערובת התגובה, ומאפשרים דנטורציה המושרה בחום של דופלקס, כריעת DNA של פריימרים לגדילים פלוס ומינוס של תבנית ה-DNA והתארכות של תוצר ה-PCR.

זמני הרכיבה מבוססים על גודל התבנית ותכולת ה-GC של ה-DNA עבור הנוסחה הכללית. התחל עם דנטורציה ראשונית של התבנית, ולאחר מכן התחל 25 עד 35 סיבובים של תוכנית מחזור טמפרטורה תלת-שלבית. השלב הראשון במחזורים אלה הוא דנטורציה של תבנית הדנ"א.

לאחר מכן תוכנית לאופטימלי, כריעה של פריימרים כחמש מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת ההיתוך לכאורה של הפריימרים, ואחריה שלב ההתארכות כדי להביא את הפולימראז לתבנית ה-DNA ולסנתז את תוצר ה-PCR. כעת הזן את מספר המחזורים. התוכנית הבאה.

שלב התארכות מורחב להשלמת סינתזה של מגברים. לבסוף, כלול שלב סיום, מצנן את התערובת לארבע מעלות צלזיוס. אם תנאי PCR סטנדרטיים אינם מניבים את המגבר הרצוי, יש צורך באופטימיזציה של PCR כדי להשיג תוצאות טובות יותר.

אז אם התגובות לא עבדו בפעם הראשונה, אתה רוצה לנסות לפתור את התגובה. אז ראשית, אתה רוצה לוודא שהבעיה לא הייתה טעות אנוש. וזה יכול לקרות אם יש לך שגיאת פיפטינג או אם אתה, אם שכחת להוסיף מגיב לבדיקה, אחת ממבחנות.

לאחר מכן, אתה יכול לנסות לשנות כמה מהחומרות של המצב כך שתוכל לשנות את ההגדרה של התרמו-סייקלר או שאתה יכול לשנות את ריכוז המגנזיום היא שיטה חלופית אחרת. אתה יכול גם לנסות להוסיף כמה תוספים לריאגנטים, כדי לפתור את הבעיות. לחלופין, שקול PCR התחלה חמה כשינוי רב-תכליתי שבו זמן הדנטורציה הראשוני גדל באופן דרמטי.

לאחר מכן משתמשים באלקטרופורזה של ג'ל AROS כדי לפתור PCR של הגן GAL 3 מ-DNA גנומי של S seia כדי לקבוע את ריכוז יוני המגנזיום האופטימלי עבור קבוצה זו של ריאגנטים, שימו לב, תוצר PCR בגודל הצפוי. 2098 זוגות בסיסים מופיעים החל מריכוז מגנזיום של 2.5 מילימולר עם ריכוז אופטימלי בארבעה מילימולר על הגברת תבנית DNA שונה של תוצר ה-PCR הרצוי מכיוון שפס בדיד דורש שניים מגנזיום מילי-מולרי. הפחתת חומרת התגובה לתנאי הגברה לא אופטימליים ביעילות מייצרת מריחה של מוצרים לא ספציפיים.

יתר על כן, עם הקפדנות הכוללת של הפחתת התגובה, נדרשת כמות נמוכה יותר של יון מגנזיום כדי ליצור אייקון אמפליקון. לפיכך, אופטימיזציה של PCR תוך התחשבות במשתנים יכולה לייצר את המוצר הרצוי הבדיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר ולהכין תגובת שרשרת פולימראז.

המטרה היא להבין את המשתנים של כל PCR וכיצד ניתן לתמרן אותם כדי ליצור את המגבר הרצוי.