Name: תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למד את שלבי תגובת שרשרת הפולימרז (PCR) להגברת DNA ספציפי מכמות קטנה של חומר התחלתי. גלה אסטרטגיות לאופטימיזציה ופתרון בעיות נפוצות במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תודה מיוחדת קריס Reddi ב-UCLA להגדרת ריאגנטים לשפוך ג&#39;ל וכדי ארין סנדרס באוניברסיטת קליפורניה השראה, הדרכה, תמיכה והגהה את כתב היד. אני רוצה גם תודה ג&#39;אנקרלו Costaguta וגרגורי ס פיין לאספקת הגנומי שמרים דנ&quot;א primers כדי להגביר את הגן GAL3. אני רוצה גם להודות שאה Bhairav ​​לצילום תמונות של ציוד מעבדה חומרים כימיים המשמשים לייצור דמויות 2 - 4. המימון לפרויקט זה סופק על ידי HHMI (HHMI גרנט מס &#39;52006944).

<ol><li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sensitive%2C+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li>
<li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li>
<li>Blanchard, M. M., Taillon-Miller, P., Nowotny, P., Nowotny, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+buffer+optimization+with+uniform+temperature+regimen+to+facilitate+automation%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">PCR buffer optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation.</a> PCR Methods Appl. 2, 234-240 (1993).</li>
<li>Borer, P. N., Dengler, B., Tinoco, I. Jr, Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+ribonucleic+acid+double-stranded+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.</a> J. Mol. Biol. 86, 843-853 (1974).</li>
<li>Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+DNA+duplex+stability+from+the+base+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Predicting DNA duplex stability from the base sequence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3746-3750 (1986).</li>
<li>Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+pre-PCR+mis-priming+and+primer+dimerization+improves+low-copy-number+amplifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications.</a> Nucleic Acids Res. 20, 1717-1723 (1992).</li>
<li>Coleman, W. B., Tsongalis, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColeman%2C+WB+%22Diagnostics+for+the+clinical+laboration%22">Diagnostics for the clinical laboration</a>. , Humana Press. (2005).</li>
<li>D'Aquila, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+sensitivity+and+specificity+of+PCR+by+pre-amplification+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3749(1991).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Touchdown%27+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4008(1991).</li>
<li>Erlich, H. A., Gelfand, D., Sninsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the polymerase chain reaction.</a> Science. 252, 1643-1651 (1991).</li>
<li>Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., Siffert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-amplification+of+GC-rich+regions%3A+%27slowdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR.</a> Nat. Protoc. 3, 1312-1317 (2008).</li>
<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
<li>King, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+N+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 630, Humana Press. (2010).</li>
<li>Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+polynucleotides.+XCVI.+Repair+replications+of+short+synthetic+DNA%27s+as+catalyzed+by+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.</a> J. Mol. Biol. 56, 341-361 (1971).</li>
<li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nat. Protoc. 3, 1452-1456 (2008).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Appendix 3, 1-14 (2001).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
<li>McConlogue, L., Brow, M. A., Innis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+DNA+amplification+by+PCR+using+7-deaza-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9869(1988).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+origin+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">The unusual origin of the polymerase chain reaction.</a> Sci. Am. 262, 56-65 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+amplification+for+DNA+analysis+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.</a> Ann. Biol. Clin. (Paris). 48, 579-582 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction+in+an+anemic+mode%3A+how+to+avoid+cold+oligodeoxyribonuclear+fusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion).</a> PCR Methods Appl. 1, 1-4 (1991).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Paabo, S., Gifford, J. A., Wilson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sequences+from+a+7000-year+old+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).</li>
<li>Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+can+eliminate+the+base+pair+composition+dependence+of+DNA+melting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting.</a> Biochemistry. 32, 137-144 (1993).</li>
<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Sambrook, J. A. R., David, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+JAR+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual</a>. 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
<li>Wilson, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+facilitation+of+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741-3751 (1997).</li>
<li>Wu, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 218, Academic Press, Inc. San Diego. (1993).</li>
</ol>

אין לי מה לחשוף.

PCR הפך לכלי הכרחית בארסנל מדע הביולוגיה. PCR שינתה את מהלך המדע המאפשר ביולוגים להניב כוח על הגנום, ולהפוך גנים היברידית עם פונקציות חדשות, המאפשר ניסויים קליניים ספציפי ומדויק, צובר תובנות לתוך הגנום לבין גיוון, כמו גם שיבוט גנים פשוט לניתוח ביוכימי נוסף. יישום ה-PCR מוגבל רק על ידי הדמיון של המדען אשר מפעיל את כוחו. יש הרבה ספרים וניירות מיוחדים המתארים את השימושים החדשים של ה-PCR, ועוד רבים יפותח על הדור הבא של מדע הביולוגיה. עם זאת, ללא קשר הגישות הצפויות, את המסגרת הבסיסית נשארה זהה. PCR, בתוך כל הפאר שלה, הוא יישום במבחנה כדי לייצר כמויות גדולות של קטע מסוים של דנ&quot;א. תכנון הניסוי PCR דורש מחשבה וסבלנות. התוצאות המוצגות באיור 3 מדגימים אחד פרק מרכזיallenges בעת תכנון אסטרטגיית אופטימיזציה של ה-PCR. כלומר, כאשר פרמטר אחד של PCR משתנה, זה יכול להשפיע אחרת. לדוגמה, אם ה-PCR הראשוני בוצע בטמפרטורה תת אופטימלית חישול (58 ° C) עם Mg 2 + ריכוז אופטימלי של mM 2.0, אז התוצאה היתה לייצר כתם כפי שניתן לראות באיור 3 ג. ניסיון לפתור את משטח עשוי לכלול הגדרת תנאי ה-PCR עם תגובות המכילות 2.0 mM MgCl 2 והתאמת הטמפרטורה חישול 61 ° C. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3 א, זו לא תניב כל מוצר. כתוצאה מכך, רצוי לכיל ריאגנטים, במקום להוסיף 1 ריכוז לתגובה אחת, כאשר פתרון בעיות תוצאות מזויפות. כמו כן, את ההתאמות הנפוצות ביותר הדרושות לייעול ניסוי ה-PCR הם לשנות את ריכוז 2 מ&quot;ג + ולתקן הטמפרטורות חישול. עם זאת, אם שינויים אלה אינם לצמצם או לבטל תוצאות חריגים, טיטרציה של additiVes ו / או לשנות את מצבו אופניים פרוטוקולים כמתואר טבלאות 2-6 עשוי להקל על הבעיה. אם כל השאר נכשל, לעצב מחדש את primers ונסה, ונסה שוב.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> סיגמא </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2 מ&quot;ל דק וול צינורות צינורות PCR </td><td> ביו רד </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2 מ&quot;ל דקים קיר כמוסות תחתית </td><td> ביו רד </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TE חוצץ: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA הרכב: dihydrate מלח </td><td> סיגמא </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> סיגמא </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> הפאג מותאם אישית פריימר </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> הפאג מותאם אישית פריימר </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> שמרים מותאם אישית פריימר </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> SacI-Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> שמרים מותאם אישית פריימר </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> Gal3 (1848), SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> תרמית Cycler </td><td> ביו רד </td><td> 170-9703 </td><td> שלי Cycler </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל אלקטרופורזה </td><td> Hoeffer מכשירים מדעיים </td><td> דגם HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 קילו סולם DNA </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> ביו רד Power Pack </td><td> ביו רד </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac בסיסי </td></tr><tr><td> ג&#39;ל דוק מערכת </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> Foto / אנליסט חוקר תחנת עבודה FX </td></tr></tbody></table>

תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

במדעים הביולוגיים היו ההתקדמות הטכנולוגית, כי מעוט משמעת לתוך גיל הזהב של גילוי. לדוגמה, בתחום המיקרוביולוגיה הפך עם כניסתו של המיקרוסקופ אנטון ואן לוונהוק, שאיפשרה למדענים לחזות פרוקריוטים בפעם הראשונה. התפתחות התגובה פולימראז שרשרת (PCR) הוא אחד מאותם חידושים ששינו את מהלך המדע מולקולרית עם השפעתה פורש subdisciplines אינספור בביולוגיה. תהליך תיאורטי קווי המתאר של Keppe ועמיתים לעבודה בשנת 1971, עם זאת, זה היה עוד 14 שנים עד הליך שלם PCR תואר ויישם באופן ניסיוני על ידי Kary מוליס תוך Cetus החברה בשנת 1985. אוטומציה ושכלול של טכניקה זו התקדם עם הקדמה של פולימראז ה-DNA תרמית יציבה מ aquaticus החיידק Thermus, וכתוצאה מכך פולימראז שם Taq DNA. PCR הוא poweהגברה rful טכניקה שיכולה ליצור היצע נרחב של קטע מסוים של דנ&quot;א (כלומר, amplicon) מתוך כמות קטנה בלבד של חומר המוצא (כלומר, תבנית ה-DNA או רצף המטרה). אמנם פשוט, ובדרך כלל ללא בעיות, יש מלכודות שיסבכו את התגובה לייצר תוצאות מזויפות. כאשר ה-PCR נכשל זה יכול להוביל שאינם ספציפיים מוצרים רבים דנ&quot;א בגדלים שונים המופיעים כסולם או כתם של להקות על ג&#39;ל agarose. לפעמים מוצרי שום צורה כלל. בעיה נוספת מתרחשת כאשר הפוטנציאל מוטציות פוגש בטעות ב amplicons, וכתוצאה מכך לאוכלוסייה הטרוגנית של מוצרי ה-PCR. כשלים PCR יכול להיות מתסכל, אלא אם כן סבלנות פתרון בעיות זהיר מועסקים לברר ולפתור את הבעיה (S). פרוטוקול זה מתאר את העקרונות הבסיסיים של ה-PCR, מספק מתודולוגיה יביא הגברה של רצפי היעד ביותר, מציג אסטרטגיות למיטוב התגובה. על ידי ביצוע מדריך זה PCR, רח&#39;udents צריכים להיות מסוגלים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובות ותנאי רכיבה תרמית לניסוי ה-PCR קונבנציונאלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את תפקידם של מרכיבי התגובה שונים ואת השפעתם הכוללת על ניסוי ה-PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב לייעל הניסוי PCR עבור כל תבנית ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ה-PCR ניסויים כושלים </li></ul>

PCR התפתחה טכניקה נפוצה הרבה מעבדות ביולוגיה מולקולרית. בתנאי הנה מדריך מהיר קונבנציונאלי פרוטוקולים מספר ה-PCR. כי כל תגובה היא ניסוי ייחודי, תנאים אופטימליים הנדרשים כדי לייצר מוצר להשתנות. הבנת המשתנים התגובה יהיה מאוד לשפר את יעילות לפתרון בעיות, ובכך להגדיל את הסיכוי להשיג את התוצאה הרצויה.

במדעי הביולוגיה חלו התקדמויות טכנולוגיות שהזניקו את הדיסציפלינה אל עידן זהב של תגליות. לדוגמה, התחום של...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השלבים המעורבים בתגובת שרשרת הפולימראז או PCR, המשמשת לייצור כמות מספקת של מקטע DNA ספציפי מכמות קטנה של חומר התחלתי. ראשית, יש להכין את הריאגנטים והחומרים שבהם ייעשה שימוש בתגובת ה-PCR, ולאחר מכן להכין את תערובת התגובה, הכוללת את ארבעת ה-deoxy ribonucleotides, את תבנית ה-DNA, את הפריימרים ואת ה-DNA polymerase. לאחר מכן, הגדירו את תנאי המחזור התרמי והפעילו את תגובת ה-PCR.לאחר מכן, יש לבחון את התוצאות כדי לקבוע אם התגובה הצליחה. בסופו של דבר, תגובת שרשרת פולימראז אמורה להניב אמפליקון ספציפי בגודל המוצר הרצוי.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בפרוטוקול זה יתקשו מעט בהגדרת החישובים של כל אחד מהריאגנטים המשתנים, ולעיתים הם נתקלים בקשיים בפיפטינג ובנפחים הנכונים, במיוחד עם הפולימראז המכיל גליצרול. התחילו את הניסוי עם דלי קרח מלא וטרי. הרכיבו כפפות כדי למנוע זיהום של התגובה.תערובת וריאגנטים. סדרו את רכיבי ה-PCR על קרח להפשרה מלאה. אלו כוללים את הפרימרים של תבנית ה-DNA, DNA polymerase, בופר תגובה 10 x עם או בלי מגנזיום כלוריד, דאוקסי-נוקלאוטידים, מים סטריליים ומגנזיום כלוריד.מגנזיום כלוריד נדרש במידה ומשתמשים בבופר ללא מגנזיום כלוריד. הניחו פלטת 96 בארות בתוך דלי קרח כדי שתשמש כמעמד עבור מבחנות PCR בעלות דפנות דקות בנפח 0.2 milliliters. כעת הצטיידו במבחנות PCR ובמכסים על משטח העבודה.מעמד לאنبובות PCR, טוש עמיד לאתנול וסט של מיקרופיפטים. יש להכין תמיד טבלת ריאגנטים המפרטת את תערובת התגובה עם כמות מדויקת של מים מזוקקים סטריליים כדי להגיע לנפח סופי של 50 µL. לדוגמה, שימוש ב-5 µL של בופר ללא מגנזיום, 1 µL של 10 mM dNTPs, ו-4.0 mM מגנזיום אופטימלי.מיקרוליטר אחד מכל אחד מהפריימרים בריכוז 20 micromolar, 0.5 מיקרוליטר של תבנית בריכוז שני nanograms per microliter, ו-0.5 מיקרוליטר של פולימראז ידרשו 33 מיקרוליטר של מים סטריליים בלבד. יש להוסיף magnesium chloride אם הוא אינו נמצא בבופר 10x או אם הדבר נדרש לאופטימיזציה של ה-PCR.המשיכו בסימון מבחנות ה-PCR באמצעות טוש עמיד באתנול על כל מבחנת תגובה. ראשית, הוסיפו את הכמויות המחושבות של מים סטריליים, לאחר מכן הוסיפו 10 x buffer ו-10 millimolar DN NTPs. בתגובה זו, אנו מבצעים טיטראציה עם מגנזיום כלוריד.מכיוון שריכוז המגנזיום לא יהיה קבוע, מוסיפים מגנזיום כלוריד לכל מבחורת PCR בנפרד, ומביאים את הנפח ל-10 microliters באמצעות מים סטריליים, כך ש-40 microliters מהתערובת הראשית (master mix) הסופית מתווספים לכל מבחורת PCR. להשלמת תגובה של 50 microliter ומגנזיום כלוריד, המשיכו להוסיף את תבנית ה-DNA והפריימרים. לבסוף, הוסיפו 0.5 עד 2.5 יחידות של DNA polymerase לכל תגובה של 50 microliter במבחורת מיקרו-צנטריפוגה של 1.8 milliliter.הכינו תמיסת master mix בכמות המספיקה לביצועי הבקרות וכן לפיצוי על איבוד חומר במהלך ההעברה בפיפט. כווןו מיקרו-פיפט לנפח של כחצי מסך נפח התמיסה וערבבו בעדינות באמצעות פיפוט. עבור כל דגימה לבדיקה, העבירו את ה-master mix לשפופרת PCR.כעת, עבור ביקרת השלילה ללא DNA תבנית, הוסיפו את כל الريאגנטים והשתמשו במים סטריליים כדי לפצות על נפח ה-DNA החסר. לאחר מכן, עבור ביקרת החיוביות, השתמשו בסט של DNA תבנית ופריימרים המגבירים מקטע ידוע תחת אותם תנאים שבהם עובדים דגימות ה-PCR הניסיוניות. מכשירי ה-PCR (תרמוציקלרים) מחממים ומקררים במהירות את תערובת התגובה, מה שמאפשר דנטורציה של הדופלקס המושרית בחום, היבדרות (annealing) של הפריימרים לגדילים הפלוס והמינוס של ה-DNA התבנית והארכה של תוצר ה-PCR.זמני המחזורים מבוססים על גודל התבנית ועל תכולת ה-GC של ה-DNA עבור הנוסחה הכללית. התחלו בדנטורציה ראשונית של התבנית, ולאחר מכן התניעו 25 עד 35 סבבים של תוכנית מחזורי טמפרטורה תלת-שלבית. השלב הראשון של מחזורים אלו נועד לדנטורציה של תבנית ה-DNA.לאחר מכן, תכנתו עבור האופטימיזציה טמפרטורת התחלה (annealing) של הפריימרים שהיא נמוכה בכ-5 °C מטמפרטורת ההמסה (melting temperature) הנראית של הפריימרים, ולאחריה את שלב ההארכה (elongation) כדי להביא את הפולימראז לתבנית ה-DNA ולסנתז את תוצר ה-PCR. כעת הזינו את מספר המחזורים. תכנתו את השלב הבא.שלב הארכה ממושך להשלמת הסינתזה של האמפליקונים. לבסוף, יש להוסיף שלב סיום הכולל קירור של התערובת ל-4 °C. אם תנאי PCR סטנדרטיים אינם מניבים את האמפליקון הרצוי, נדרשת אופטימיזציה של ה-PCR כדי להשיג תוצאות טובות יותר.לכן, אם התגובות לא הצליחו בפעם הראשונה, כדאי לנסות לאתר את מקור התקלה בתגובה. ראשית, עליכם לוודא שהבעיה לא נבעה מטעות אנושית. דבר זה עלול לקרות במקרה של טעות בפיפוט או אם שכחתם להוסיף ריאגנט לאחת מכלים המבחנה.בשלב הבא, ניתן לנסות לשנות חלק מתנאי המחמירות כדי להתאים את הגדרות התרמוציקלר, או לחלופין לשנות את ריכוז המגנזיום. ניתן גם לנסות להוסיף חומרים מסוימים לריאגנט כדי לפתור את הבעיות. כחלופה, שקלו שימוש ב-hot start PCR כשינוי ורסטילי שבו זמן הדנטורציה הראשוני מוארך באופן משמעותי.לאחר מכן משתמשים באלקטרופורזה של ג'ל AROS כדי להפריד את תוצרי ה-PCR של הגן GAL three מ-DNA גנומי של S seia, במטרה לקבוע את ריכוז יוני המגנזיום האופטימלי עבור סט ריאגנטים זה; שימו לב, תוצר PCR בגודל הצפוי, 2098 base pairs, מופיע החל מריכוז מגנזיום של 2.5 millimolar, כאשר הריכוז האופטימלי הוא 4 millimolar. בהגברה של תבניות DNA שונות, השגת תוצר ה-PCR הרצוי כפס נפרד דורשת 2 millimolar מגנזיום. הפחתת מחומריות (stringency) התגובה לתנאי הגברה תת-אופטימליים למעשה גורמת להיווצרות של מריחה (smear) של תוצרי לא ספציפיים.יתרה מכך, עם ההפחתה הכוללת של מחמירות התגובה, נדרשת כמות נמוכה יותר של יוני מגנזיום כדי ליצור אמפליקון. לפיכך, אופטימיזציה של ה-PCR תוך התחשבות במשתנים יכולה להניב את המוצר הרצוי באופן מובחן. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ההקמה וההכנה של תגובת שרשרת פולימראז.המטרה היא להבין את המשתנים של כל תגובת PCR וכיצד ניתן לתמרן אותם כדי ליצור את האמפליקון הרצוי.

polymerase-chain-reaction-basic-protocol-plus-troubleshooting

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שיטה ממוקדת אחזור רצף ה-DNA העתיק, שבו השתמשנו לשחזר את הגנום המיטוכונדריאלי המלא של חמישה אנשים Neandertal. השוואה בין הרצפים עם בני האדם של ימינו מציע כי הניאנדרטלים היה ארוך טווח אפקטיבי נמוך גודל האוכלוסייה.

הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

סרטון זה מדגים את תגובת שרשרת פולימראז הדרגתי לאופטימיזציה של טמפרטורת החישול של פריימרים, הקובעת טמפרטורת חישול הדרגתית לאורך בארות. ההשפעה של טמפרטורות חישול שונות נקבעת על ידי התשואה של מוצרים מוגברים המסייעים לייעל את מצב התגובה.

תגובת שרשרת פולימראז הדרגתית לקביעת טמפרטורת החישול האופטימלית

בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות לתרופה במחיר סביר ונגיש ושיטות פרשנות.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) הוא כלי שימושי עבור גילוי רגישות גבוהה של נוקלאוטיד יחיד גרסאות ו- DNA עותק מספר גרסאות. . הנה, נדגים שיקולים מרכזיים למדידת גרסאות נדיר הגנום האנושי באמצעות PCR דיגיטלי עם התבנית שבב-ב--שפופרת.

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ביעילות ובמיוחד לרוקן חלבון של עניין השמרים סכביסיטאה cerevisiae ס באמצעות מערכת העזרה β-est.

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

התגובה אוגי הוכיחה להיות דרך נוחה במהירות ליצור ספריות מגוונת של תרכובות. היא כוללת את תגובת אמין, אלדהיד, חומצה carboxylic ו isonitrile בדרך כלל מתנול בטמפרטורת החדר. בסרטון הזה, אנו מנצלים 48-חריץ Mettler-טולדו MiniBlock מצויד צינורות סינון מטפל Mettler-טולדו MiniMapper נוזלי אוטומטי היה בשימוש, כדי לספק את ריאגנטים ממס. הפרמטרים של עניין היו ריכוז, הרכב הממס ואת עודף של כמה חומרים כימיים.

אופטימיזציה של התגובה אוגי באמצעות סינתזה במקביל וטיפול נוזלי אוטומטי

למד את שלבי תגובת שרשרת הפולימרז (PCR) להגברת DNA ספציפי מכמות קטנה של חומר התחלתי. גלה אסטרטגיות לאופטימיזציה ופתרון בעיות נפוצות במעבדה.

תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

גלה סרטונים נוספים