טומוגרפיה ממוחשבת מונחה תחום בזמן מפוזר טומוגרפיה זוהר על בעלי חיים קטנים על לוקליזציה של סמנים לסרטן

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק תמונות פלואורסצנציה של ביטוי קולטן גורם גדילה אפידרמלי במודל עכבר עם גליומה אורתוטופית. זאת מושג על ידי הזרקה של תאי גליומה אנושיים מסוג U2 51 המבטאים חלבון פלואורסצנציה ירוק להמיספירה המוחית השמאלית של עכבר A IIC. לאחר שהגידול גדל במשך שבועיים, מוזרק לעכבר תערובת של שני סממני פלואורסצנציה.

לאחר מכן, העכבר נסרק במערכת רנטגן לבעלי חיים קטנים כדי לאסוף נתונים אנטומיים הדרושים לשחזור מדויק של התמונה. הנתונים משמשים למיקום אנטומי של המקור ושל נקודות הגילוי של מערכת הטומוגרפיה האופטית, ותוכנה מותאמת אישית משמשת לאיסוף נתוני הפלואורסצנציה ולבניית התמונה הסופית. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה לבנות תמונה של גידול המבוססת על ביטוי יתר של epidermal growth factor באמצעות דימות פלואורסצנציה ורנטגן, כאשר ניתן להשוות את דיוקה לדימות תהודה מגנטית עם חומר ניגוד.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טומוגרפיית פלואורסצנציה לבעלי חיים קטנים המבוססת על התקני מטען מצומד (charge couple device), הוא שגילוי באמצעות ספירת פוטונים בודדים בעזרת שפופרות הכפלה פוטואלקטרית (photo multiplier tubes) מציע רגישות וטווח דינמי גבוהים בהרבה לגילוי אור. ניתן להשתמש בשיטה זו בסופו של דבר כדי לנטר ולהעריך את הצלחתן של תרפיהות מולקולריות על ידי מדידת הביטוי של יעדיהן. בעוד שגידולים תת-עוריים ניתן לדימות בקלות בשיטות לא-טומוגרפיות באמצעות דימוי פני שטח, מערכת זו תוכננה לדימוי דרך רקמה בעובי של מספר סנטימטרים, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לדימוי של הובלת חומרי ניגוד ודליפתם לתוך גידולי מוח.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביטוי של סמנים ביולוגיים לסרטן, ניתן להחיל אותה גם על מחקרים אחרים של מחלות, כגון זיהומים, השמנה, או גורמי הזדקנות כגון מחלת אלצהיימר. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בגישורה בשל אופיה הדיפוזי של התפשטות האור ברקמה ביולוגית והקושי בשימוש בטומוגרפיה של קרני X עבור שחזור האור הדיפוזי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

מכיוון ששלבי איסוף הנתונים ושחזור התמונות עשויים להיות קשים ללמידה, חשוב להבטיח שהנתונים שנאספו מהמערכת הפלורסצנטית מכוילים היטב. חבילת התוכנה near fast תוכננה לקלוט נתונים אופטיים ולהשתמש בתמונות טומוגרפיה של קרני X ליצירת רשת אלמנטים סופית (finite element mesh), המשמשת כתבנית מרחבית לשחזור הפלורסצנציה. לתחילת הפעולה, הניחו עכבר עירום אתמי (athymic nude mouse) המורדם על סמרט ניתוחי סטרילי, ואשרו את עומק ההרדמה לפני שתמשיכו לניקוי וחיטוי העור מעל אזור החיתוך.

בעזרת Betadine, הנח סדין סטרילי מעל אתר החתך. בעזרת סקאלפל, בצע חתך קטן מעט משמאל לקו האמצע ובמרחק של 0.5 סנטימטרים אחורי הקו האינטרא-אוקולרי (intraocular line). נקה את פני הגולגולת על ידי הסרת רקמה חיבורית כדי שניתן יהיה לזהות את נקודות הייחוס. לאחר חשיפת הגולגולת, השתמש במקדח מהיר עם מקדח סטרילי בקוטר מילימטר אחד כדי ליצור חור במרחק של שני מילימטרים משמאל לקו המרכזי ושני מילימטרים מאחורי ה-bgma.

מלאו מזרק Hamilton Micros עם מחט בעלת קצה קהה במידה 27 בתאים המיועדים להשתלה. לאחר מכן, מקמו את העכבר על מסגרת סטריאוטקסית. לאחר מכן, ודאו כי בעבר עומק של הרדמה כירורגית ואסתטית באמצעות צביטה בבוהן, והניחו מחדש את כיסוי הניתוח על בעל החיים.

בשלב הבא, קיבעו את המזרק הטעון למסגרת הסטריאוטקסית. מקמו את המזרק מעל החור בגולגולת והחדירו את קצה המחט שלושה מילימטרים מתחת לפני הגולגולת. לאחר מכן, משכו את המחט חזרה מילימטר אחד כדי ליצור כיס.

השלב הבא הוא להזריק את התאים לאט לחצי הכדור המוחי השמאלי לאורך תקופה של חמש דקות. עם סיום ההזרקה, הוצא את המחט ונגב את החור עם Betadine. כדי למנוע צמיחת תאים מחוץ לאתר ההזרקה, הוצא את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסיטית ומלא את החור החשוף בשעוות עצם שחוממה מראש.

לבסוף, סגרו את אתר החתך באמצעות תפר ניילון סטרילי 5-0. החזירו את העכבר לכלוב מחומם ועקבו אחריו עד להחלמתו. לאחר ההחלמה, מזריקו לעכבר 130 µL של buprenorphine בריכוז 0.1 mg/kg בדרך תוך-בטנית (IP) והניחו לגידול לגדול במשך 14 ימים לפני הדימות. ביום הדימות של העכבר, הפעילו את המערכת כדי לאפשר ללייזרים ולגלאי האור להתחמם במשך כ-20 דקות.

כדי למנוע סטיות ורגישות של המערכת, מקמו מפזר קווים הנדסי (engineered line diffuser) של 100 מעלות על ארבע מעלות במרכז המדויק של גנטרי ההדמיה, כדי לפזר את לייזרי העירור בין ערוצי הגילוי של המערכת בעוצמה שווה. כווננו את זווית המפזר ידנית כדי למקסם את כמות האות המגולה על ידי כל חמישה ערוצי איסוף האור. לאחר מכן, מקמו צפיפות אופטית.

שני מסנני צפיפות ניטרלית (neutral density filters) ממוקמים לפני כל צינורות הכפלה פוטואלקטרית (PMTs) לגילוי פלואורסצנציה ולצפיפות אופטית. מסנן צפיפות ניטרלית אחד ממוקם לפני כל גילוי נחירה (transmittance). ה-PMTs אוספים 100 פונקציות פיזור פולס זמנית או T psfs של הלייזר, כאשר לכל אחת זמן אינטגרציה של שנייה אחת עבור כל לייזר באופן רצפי; יש לנרמל כל TPSF לפי רפרנס הלייזר, לתקן עבור סחיפה זמנית (temporal drift) ברפרנס הלייזר, ולבצע ממוצע על פני כל האיטרציות עבור כל גלאי ועבור כל לייזר בנפרד.

ערכי ה-TPS הממוצעים הללו הם פונקציות התגובה של המכשיר, הספציפיות לגלאי, המשמשות לשחזור התמונה האופטית 12 שעות לפני הליך ההדמיה. הזרק לעכבר הבדיקה תערובת של סמנים פלואורסצנטיים. כיול מדויק של מערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית והגבלת תנועת החיה הם ההיבטים המאתגרים ביותר של הליך זה.

שחזור הדימות הוא בעיה בעלת הגדרה לקויה (ill-posed) עד כדי כך ששגיאות קלות בלבד באיסוף הנתונים עלולות להוביל לשגיאות משמעותיות בתמונה המשוחזרת. כדי להבטיח איסוף נתונים מדויק, אנו מקבעים את העכבר בצורה הטובה ביותר וחוזרים על הכיול לפני ואחרי הסריקה כדי להגדיל את הסיכוי לקבל כיול מדויק. כאשר הדבר מוכן, הניחו את החיה המורדמת על תומכי הפיברגלס של מיטת הדימות.

לאחר מיקום הראש בתוך קונוס האף להרדמה רציפה בגז, קבעו את השיניים על מוט הנשיכה והדביקו את בעל החיים. יש להניח את העכבר בקירוב במרכז גנטרי הדימות. ניתן להנחות מיקום זה על ידי סיבוב לייזר העירור ב-180 מעלות סביב העכבר, תוך הבטחה שנקודת המוקד של הלייזר מאירה נקודה שנמצאת בקירוב במרכז העכבר מנקודת המבט של הלייזר בכל הזוויות.

לאחר המיקום הנכון, העבירו בזהירות את מיטת הדימות ואת העכבר לסורק ה-micro CT ואספו מידע אנטומי ברזולוציה של 93 micrometers isotropic עבור כל ראשו של העכבר. בצעו ויזואליזציה של מחזור תמונות ה-CT ובחרו את הפרוסות שידוממו באמצעות מערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית. העבירו בזהירות את מיטת הדימות ואת העכבר בחזרה למערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית.

בחרו את מספר מיקומי המקור עבור כל פרוסת הדמיה, את זמן האינטגרציה עבור כל מדידת TPSF, את מספר האיטרציות עבור כל מיקום מקור, ואת המיקום ומספר פרוסות ההדמיה הרצויות מתוך מחסנית תמונות ה-CT שנוצרה קודם לכן. לאחר מכן, הניחו מסננים לפני ה-PMTs של גילוי הפלואורסצנציה כדי לחסום את כל אור העירור, ומסנני צפיפות אופטית (neutral density filters) לפני ה-PMTs של גילוי הנבérica. כדי למנוע רוויה של גלאים אלו, הפעילו את תוכנת רכישת הנתונים לאיסוף t-psfs של פלואורסצנציה ונבérica בכל מיקום מקור-גלא שהוגדר, בשני אורכי גל העירור.

עבור כל סט של psfs T שנאספו, נתרו ורשמו את עוצמת הלייזר באמצעות ערוץ PMT ייחוס. קבעו את פני השטח החיצוניים של העכבר ואת מיקומו של מיטת הדימות. תמכו במוטות מתוך תמונות ה-CT וצרו מסכות המכסות את גבולות העכבר ואת מוט הדימות.

בנפרד, השתמשו במסכת העכבר כדי להפיק רשת אלמנטים סופית של החיה באמצעות תוכנת ה-near fast. מקמו את מיקומי המקור והגלאי ממערכת הטומוגרפיה הפלואורסצנטית על פני השטח של הרשת, בהתבסס על קואורדינטות רישום מרחבי של micro CT ופלואורסצנציה. הסירו נקודות נתונים אופטיות הקשורות למיקומי מקור או גלאי המקיימים אינטראקציה עם מיקום מיטת הדימות.

מוטות תמיכה מנרמלים את הנתונים שנאספו בכל מיקום של גלאי המקור באמצעות ייחוס הלייזר, מתקנים סחף זמני בייחוס הלייזר ומתקנים רגישויות של מסננים, אשר נקבעו בבדיקות ניסיוניות בעת הרכישה. חשבו את יחס born של הנתונים עבור כל מיקום של גלאי המקור והכפילו בסימולציית מודל קדמי של נבליות המבוססת על רשת אלמנטים סופית של בעל חיים עבור תכונות אופטיות אחידות. פעולה זו מבוצעת כדי לצמצם שגיאות הקשורות לצימוד של המקור או הגלאי לרקמה, כדי לכלל את הנתונים למודל ולהתאים את הנתונים להיבטים אחרים של אי-התאמה בנתוני המודל; בנו, בנו וקטור נתונים המורכב מההפרש המנורמל של נתוני יחס born שנאספו בשני אורכי הגל.

גורם השקלוב נבחר כדי למקסם את ניגודיות קישור ה-EGFR, בוצע שחזור תמונה במישור הזמן עם נתוני ההפרש המכויילים תוך שימוש ב-TPSF עבור כל ערוץ גילוי כקלט, ונוצרו מפות פלואורסצנציה של הסמן המכוון עם הניגודיות המוגברת שנצפה. להלן דוגמה לשחזור פלואורסצנציה המוטל על גבי תמונה אנטומית של CT שנרשמה במקביל מעכבר עם גידול גליומה אורתוטופי מסוג U2 51. מרכז המסה של הגליומה שנקבע על ידי שחזור הפלואורסצנציה היה במרחק של מילימטר אחד ממרכז המסה של הגידול, כפי שנקבע על ידי דימות תהודה מגנטית עם ניגודיות מוגברת.

התוכנה לרכישת נתונים נבנתה במיוחד עבור מכשיר זה, אך ניתן לבצע את מרבית טכניקות עיבוד התמונה באמצעות תוכנת near fasts הזמינה בכתובת nearfasts.org@. לכן, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שגם המערכת וגם הנתונים מכויילים במדויק לפני שחזור התמונה. כיול זה דורש התחשבות בהבדלי הרגישות והזמנים בין הגלאים, לאחר שחזור תמונה של סמן (tracer) המכוון לסמן ביולוגי.

דימות דומה של סמן שאינו מכוון מספק אמצעי לתיקון של ספיגה שאינה מתווכת בקולטנים. דבר זה מאפשר לכמת את כמות קישור הסמן וכן את צפיפות הקולטנים in vivo לאחר פיתוחו. טכניקה זו נתנה השראה לחוקרים אחרים לתכנן מערכות של טומוגרפיה פלואורסצנטית המודרכת על ידי דימות רנטגן, וסללה את הדרך לדימות של הגוף כולו בבעלי חיים גדולים יותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע ניסוי בטומוגרפיה פלואורסצנטית דיפוזית, המשלבת מערכות של דימוי אנטומי בקרני x ודימוי אופטי לצורך דימוי של סממנים ביולוגיים לסרטן.