שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פיגום תרבית תאים רב שכבתי. סרטון זה ידגים כיצד לייצר מטריצת תרבית תאים דו-ממדית, המשלבת את פפטיד ההדבקה RGDS בשכבות חלופיות כדי להפריד בין אזורים של C שני תאי C 12. זה מושג על ידי קשירה ראשונה של פפטיד RGDS למאקרו נאמן לאקרו נאמן.

לאחר מכן מתויג שילוב פפטידי המאקרו עם צבע LOR כדי לאפשר הדמיה של הפפטיד המכיל שכבות של הג'לים הרב-שכבתיים. השלב השני הוא ליצור את התבניות על ידי חיתוך מגיליון סיליקון וסנדוויץ' שלהן בין שתי שקופיות זכוכית לאחר הפרם, ערבוב רכיבים בודדים של כל שכבה. פתרונות של peg di acrl ו-peg di acrl עם PEG RGDS Alexa three 50 הם לחלופין שכבות בתוך התבניות.

ג'לים מפולמרים על ידי קרינת UV. השלב האחרון הוא לזרוע C שני תאי C 12 על ג'לים רב-שכבתיים דו-ממדיים על מנת לבחון כיצד הרכב המטריצה משפיע על צמיחת התאים והצמדותם. בסופו של דבר, מיקרוסקופ שדה בהיר ופלואורסצנטי משמשים להמחשת הצמיחה הסלקטיבית של תאי C שני C 12 על הפיגומים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמדובר בשיטה פשוטה וחסכונית ליצירת מטריצות תרבית תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות רב-שכבתיות. הוא אינו מסתמך על הצורך במכשור יקר. בעוד שהממשקים בין השכבות הם רציפים ואינטגרליים מבחינה מבנית.

אין ערבוב בין רכיבים של שכבות בודדות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כגון כיצד תאים נודדים ומקטבים בתגובה לרמזים ביולוגיים, כימיים ומכניים דפוסיים. שיטה זו יכולה לספק תובנה עדינה לגבי נדידת תאים והתמיינות וניתן ליישם אותה על מערכות אחרות כגון הכוונת צמיחה ימנית חדשה וסינפטוגנזה של תאי גזע עצביים.

כדי להתחיל בהליך זה, שלב פפטיד RGDS ושמן אקרו peg succinyl carbo methyl ester ביחס מולארי של אחד לשניים לאחד ב-DMSO יבש תחת ארגון. לאחר מכן הוסף NN diop, פרופיל מתילאמין או D-I-P-E-A ביחס מולארי של שניים לאחד ביחס ל-aquilo PEG SCM כדי לעזור להקל על התגובה, לאשר את הצימוד של מולקולת aquilo PEG RGDS באמצעות ספקטרומטריית מסה TOF עובש. לשם כך בנפרד, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת התגובה AQUILO PEG RGDS, ומיקרוליטר אחד של aquilo PEG SCM לא תגובתי לנקודות שונות על המטרה העובשת.

הניחו לשניהם להתייבש. לאחר מכן הכינו תמיסה רוויה של מטריצת עובש אוניברסלית במערבולת THF למשך דקה אחת והוסיפו מיקרוליטר אחד לאותן שתי נקודות. הניחו לשניהם להתייבש.

לאחר מכן, טען את הדגימות. בצע ניתוח קשיח עובש עם לייזר 60 הרץ בהספק של כ-19% באמצעות SAVIS gole, החלקת כובע עליון, חיסור בסיסי ואלגוריתמים לזיהוי שיא OID. יש להזיז את המשקל המולקולרי של אקרו PEG RGDS ימינה, בהתאם לשינוי במסה עקב פפטיד קשור קוולנטי.

השלב הבא הוא להצמיד את הפלואור על ידי הוספת כמות שווה ערך של LOR שלוש 50 חומצה קרבוקסילית יונקת באסטר בינוני ביחס ל-aquilo PEG SCM המומס בנפח מינימלי של DMSO לתמיסת התגובה של aquilo PEG RGDS תחת דגירה של ארגון למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן טהר את יתד שמן האקרו RGD S3 50 על ידי דיאליזה כנגד מי צבע בארבע מעלות צלזיוס באמצעות קלטת דיאליזה במשקל מולקולרי של 3,500 DAU. המשך בדיאליזה במשך 48 שעות באמצעות יחס נפח של 1001, והחלף דיאליזה קרה לפחות פעמיים ביום.

המוצר מטוהר עוד יותר על ידי עיקור פילטר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרון. לבסוף, בסביבה סטרילית, הוצא את יתד שמן האקרו המטוהר הסטרילי RGD S3 50 לצינורות מיקרו צנטריפוגה סטריליים משוקללים מראש. אטום את צינורות המיקרו צנטריפוגה הפתוחים בתוך צינורות נשימה סטריליים.

ייבשו בהקפאה את הדגימות ואחסנו כל אחת אטומה בניילון פרפין במינוס 20 מעלות צלזיוס. כביסה מוקדמת מחליקה ב-100% מתנול ומייבשת בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס עד שהנוזל מתאדה. לאחר מכן מניחים צלחת המכילה את שקופיות הזכוכית לתוך מכסה אדים ומוסיפים 250 מיקרוליטר של מעיל סיגמא לכל שקופית.

נדנד בעדינות את השקופיות למשך 30 שניות על מנת לצפות את כל המשטח. לאחר מכן, יש לשטוף היטב את השקופיות המצופות ב-100% מתנול, ולאחר מכן שטיפה ומים מזוקקים, על ידי השרייתן פעמיים למשך חמש דקות ב-10 מיליליטר מים לפחות. לאחר השטיפה, הניחו למגלשות להתייבש באוויר.

הכן חללי סיליקון בעובי 0.8 מילימטר על ידי חיתוך יריעת סיליקון לאותם מידות כמו מגלשות הזכוכית. לאחר מכן בעזרת אגרופי ביופסיה, צור חורים של 10 מילימטר או שמונה מילימטר בסיליקון כדי להחזיק את הפיגומים באמצעות סכין גילוח. צרו כשני תעלות מילימטר בחלק העליון של התבנית כדי לאפשר תוספת של חומר הפיגומים.

לאחר מכן חיטוי חללי הסיליקון ושקופיות זכוכית שטופלו בציפוי סיגמא כדי לעקר אותם. כמו כן לעקר חומרים נוספים ליציקת הג'לים כגון צינורות עינור ומלקחיים. במסנן מכסה מנוע של תרבית רקמות יש לעקר תמיסת מלאי של Peg di aquil באמצעות מזרק סטרילי של מיליליטר אחד ומסנן 0.2 מיקרון.

התחל בגיבוש תמיסות PEG pre polymer ביחס משקל לנפח של 15% עבור כל שכבה בהתאמה בצינורות פסולת מיקרו ענבר בודדים על ידי שילוב של 50% PEG D acrl עם כמויות שונות של תמיסת מלאי סטרילית 60% IO DAL PBS ויוזם צילום כדי להניב ריכוזים סופיים משתנים של 10%20%30% ו-40%I oal מערבבים היטב את התמיסות להכנת תמיסת הפולימר 15% PEG המסומנת פלואורסצנטית, שלב 50% PEG di aquil ו-aquilo PEG RGD S3 50 בריכוז סופי של שמונה מילימולר עם תמיסת מלאי IO Dal PBS ויוזם צילום בצינורות Microview ענבר כדי להניב ריכוזים של 15%25% ו-35% IO IAL מערבבים היטב את התמיסות. לאחר מכן, הרכיבו את התבנית שהוגדרה על ידי הנחת מרווח חתוך מראש בין שתי שקופיות זכוכית שטופלו בסיגמא ואבטחו בעזרת מלחציים. לאחר הרכבת התבנית, יצקו ג'ל שכבתי על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסה של 40% תחילה, ואחריה 10 מיקרוליטר של תמיסת 35% המסומנת בפלואורסצנט.

חזור על השכבות החלופיות כדי להשיג מספר שכבות. לאחר מכן, הקרינו את התבנית באור של 365 ננומטר למשך שלוש דקות. באמצעות מנורת UVR 9,000 ניידת, אפשר להידרוג'ל הפולימרי להתרפא במשך חמש דקות.

לאחר מכן הסר את המהדקים והרם בעדינות את מגלשת הזכוכית העליונה ואת התבנית. שיפוע הצפיפות המרובד. פילמור רב מונח או ג'לים DG MP יישארו על השקופיות.

בעזרת מרית סטרילית מוציאים בזהירות את הג'לים מהתבנית ומניחים אותם בצינור של 50 מיליליטר המכיל DMEM סטרילי. שטפו את הג'לים הפולימריים באמצעות יחס נפחי של 1000 לאחד של DMEM למשך 48 שעות עם שתי החלפות חיץ ביום. פעולה זו תסיר כל צפיפות, משנה, יוזם צילום ועל פולימר טרום ריאקטיבי.

לאחר מכן יש לאחסן את הג'ל DGMP ב-DMEM בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין. כדי להמחיש שכבות מתחלפות, סדרו ג'ל DGMP לאורך סרגל על מגש הדגימה של יחידת תיעוד ג'ל. לאחר מכן חשוף ודמיין את הג'לים באמצעות Alexa שלוש 50 רצועות כהות וכחולות לסירוגין בהידרוג'ל DGMP מדגימות היווצרות שכבות דיסקרטיות בעלות הרכב כימי מובהק.

כדי להכין את ג'לי ה-DGMP לתרבית תאים, הכנס אותם בעדינות לבארות של צלחת תרבית תאים של 48 בארות. השתמש במגרד תאים סטרילי ושטוף אותם שלוש פעמים במדיום תרבית תאים. לאחר מכן, קצרו C שני מיובלסטים C 12 מצלחת תרבית תאים של 100 מילימטר כשהם מתכנסים ב-60%.

לשם כך יש לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS חם מראש. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של 0.25% נסיעות ב-EDTA ודגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר שהתאים התנתקו, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תרבית חם מראש והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר לצנטריפוגה.

לאחר שהתאים עברו כדורי ריס, עט אותם במצע גידול וספור את התאים החיים על ידי הוספת טריאם כחול ושימוש במונה תאי TC 10. לאחר מכן זרעו את פיגום ה-DG MP עם C שני C 12 מיובלסטים ודגרו למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. אשר את ההצמדה של C שני מיובלסטים C 12 על ה-RGDS המכילים שכבות של ג'ל DGMP באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי וניגודיות פאזה.

השכבות המתחלפות של ג'ל DGMP עשויות להכיל פפטידים שונים כגון RGDS המוצגים מימין, התומכים בהתקשרות וצמיחה של תאים. השכבה משמאל, לעומת זאת, לא הכילה פפטידים של התקשרות תאית והתאים לא שרדו באזור זה. IO diol יכול להשפיע על נוקשות הג'ל.

כאן, המודול האלסטי נמדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. עלייה של 60% בנוקשות נצפתה בעת שימוש ב-30% IAL בפורמולת ג'ל זו, השפעת IAL על קשיחות הג'ל יכולה להשתנות בהתאם לחומרים בהם נעשה שימוש בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את רצף השכבות. השכבה המכילה את הכמות הגבוהה ביותר של IEX null תהיה בתחתית, בעוד שהשכבה עם הכמות הנמוכה ביותר של IEX null תהיה בחלק העליון.

זכור תמיד להוסיף את יוזם הצילום בסוף כדי למנוע פילמור מאור הסביבה. עם משתפי הפעולה שלנו, אנו מתאימים את הטכניקה הזו כדי לארגן את צמיחת הנויריטים בתלת מימד. זה יאפשר השוואות בין תאי אב עצביים שמקורם באנשים בריאים ואלה של חולים עם הפרעות נוירו-התפתחותיות.

אל תשכח שעבודה עם אור אולטרה סגול עלולה להיות מסוכנת. הרכיבו משקפי מגן UV בזמן ביצוע שלב הקישור הצולב.