היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים
22 ביוני 2013
כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אורוגניטל מכרסמים, מזנכימה סינוס או UGSM מעוברי מכרסמים ותערובות רקמות השתלה לתוך קפסולת הכליה שיכולה ליצור אפיתל ערמונית אנושי. זה מושג על ידי בידוד הסינוס האורוגניטלי מעוברי עכבר או חולדה. לאחר מכן, המזנכימה של הסינוס האורוגניטלי מופרדת מהאפיתל.
לאחר מכן משולבים תרחיפי תאים בודדים של מזנכימה של סינוס אורוגניטלי עם תאי גזע פלוריפוטנטיים. לבסוף, תערובת התאים מושתלת מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אפיתל ערמונית אנושי שנוצר על כליית העכבר באמצעות אימות ביטוי PSA ספציפי לבני אדם.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד הערמונית והתחלת המחלה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון קסנוגרפט של גידולי ערמונית אנושיים ואינדוקציה של קווי תאים גידוליים שבועיים ליצירת גידולים. לאחר המתת חסד של עכבר או חולדה בהריון מתוזמן ובידוד העוברים, הפרד אותם משק מי השפיר, חתוך את חבל הטבור והעביר אותם לצינור של 50 מיליליטר המכיל חנקים קרים כקרח. מאזנים את תמיסת המלח ושומרים על קרח.
הניחו עובר בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר והשתמשו במספריים כדי לחתוך אותו בגובה הבולוס. הסר את הקיבה והמעי הדק ולאחר מכן אתר את השחלות בעובר הנקבי, הנמצאות בקטבים של הכליות או באשך אצל הזכר הממוקם בגובה שלפוחית השתן. תחת טווח דיסקציה.
השתמש במספריים של ונציה כדי לחתוך את דופן הבטן כדי לחשוף את שלפוחית השתן ואת הדופן האחורית של הבטן. שחרר את דרכי המין העליונות מהחיבורים ושחרר את חבל הטבור. חותכים את עצם הערווה ובעזרת מלקחיים עדינים של דומונט.
בצורה בוטה, הפרד אותו מהדופן הקדמית של הסינוס האורוגניטלי. הפרד את הדופן האחורית של הסינוס האורוגניטלי מפי הטבעת וחתך את הסינוס האורוגניטלי עם שלפוחית השתן בקצה התחתון. לאחר מכן הפרד את שלפוחית השתן מהסינוס האורוגניטלי.
אחסן את הסינוס האורוגניטלי וחסום ב-HBSS קר כקרח. מעבירים את הסינוס האורוגניטלי לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 1% טריפסין ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום ודוגרים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה הסר את הטריפסין והוסף 10% FBS ו- DM A MF 12 בינוני כדי לנטרל את העיכול.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים במחט או בקצה דק כדי להקניט בזהירות את השרוול המזנכימלי הדביק מצינור האפיתל. שמירה על צינור האפיתל שלם מפחיתה את הסיכוי לזיהום תאי אפיתל של המזנכימה. זה יכול לגרום להיווצרות בלוטות מכרסמים יחד עם אפיתל הבלוטות האנושי שמקורו בתאי גזע.
העבירו את ה-UGSM לתוך שפופרת חדשה של 50 מיליליטר המכילה מדיום DMM F 12 המכיל 10% FBS 1% סטרפטוקוס עט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות וננו-מולר אחד. R 1 8 81 דגירה על הצינור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך הלילה. למחרת צנטריפוגה את הרקמה ב-200 גרם.השליכו את הסופרנטנט והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את הגלולה.
לאחר הסרת ה-PBS, יש להשהות את הרקמה ב-0.2% קולגנאז ב-D-M-A-M-F 12 ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין במשך שעה, מערבל במרץ את רקמת העיכול שלוש פעמים עד שהיא הופכת לתערובת תאים בודדים הומוגנית ומנטרל את הקולגנאז על ידי הוספת מדיום D-M-A-M-F 12 עם 10% FBS 1% סטרפטוקוס עט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות וננו-מולרית אחת R 1 8 81. שטפו את התאים שלוש פעמים על ידי כדורים ב-200 גרם והשעיית התאים ב-HBSS. לבסוף, החייאה, השעו את התאים המזנכימליים ב- DMM F 12 והשתמשו בציטומטר המו כדי לספור אותם לביצוע ההשתלה.
לאחר הכנת אזור ניתוח סטרילי והרדמת עכבר עירום אתימי זכר עם הזרקת IP של קטמין קסילזין, על פי פרוטוקול הטקסט, בצע צביטה בבוהן כדי לאשר את רמת ההרגעה הכינו את העכבר בניתוח על ידי גילוח אזור הניתוח במידת הצורך, וניקויו עם שלושה מגבונים לסירוגין של 70% אלכוהול ואחריהם תמיסת בטדין. לאחר מריחת משחת עיניים יש לבצע חתך אורכי של סנטימטר אחד בגב ולהמשיך לחתוך את דופן הבטן בחתך אורכי של 0.5 ס"מ. סחטו בעדינות את הכליה מהבטן והשתמשו בטיפות של מי מלח סטריליים כדי לשמור על לחותה.
לאחר מכן, בעזרת מחט מזרק בגודל 27, נקב בעדינות את קפסולת הכליה כדי ליצור אתר הזרקה לתערובת התאים. לאחר מכן מלאו מחט מזרק בגודל 28 ב-10 מיקרוליטר של תערובת תאים והכניסו אותה לאט לאתר הניקוב, תוך חדירה לפרנכימת הכליה. כדי להגיע לאזור מתחת לקפסולה הכליה.
הזרקו 10 מיקרוליטר מתערובת התאים ליצירת בולוס על הכליה מתחת לקפסולת הכליה והוציאו את המחט. החזר את הכליה לחלל הבטן ואבטח את השכבה השרירית של הצפק בארבעה תפרי ניילון. סגרו את העור עם תפרים או סיכות והשתמשו במי מלח סטריליים כדי לנקות את כל הדם מהעור.
מוצגת כאן תמונת אולטרסאונד של קסנוגרפט גדל שמונה שבועות לאחר ההשתלה. האזור המעוגל מייצג את הקסנוגרפט על פני הכליה. תמונות אלה מדגימות צמיחת קסנוגרפט על פני הכליה.
לאחר 12 שבועות, תאי ES אנושיים המושתלים בהיעדר סינוס אורוגניטל, מזנכימה תיצור טרטומה גדולה, ואילו מזנכימה של סינוס אורוגניטלי המושתל לבד לא יצליח ליצור שום מבנה שניתן להבחין בו. מוצג במרכז. לוחות של איור זה הם צביעות אימונוהיסטוכימיות מייצגות של אפיתל ערמונית אנושי שמקורו בתאי גזע לעומת רקמת ערמונית אנושית בוגרת.
כפי שמוצג כאן משמאל, הבלוטות מכילות שכבת אפיתל לומינלית חיובית AR. זה גם PSA חיובי, שכבת תאי אפיתל בסיסית חיובית P 63 וכרומוגרנין נדיר. תאים נוירואנדוקריניים, הבלוטות אינן סרטניות כפי שמוצג על ידי צביעת A-M-A-C-R שלילית על סירוס המארח.
תאי התאורה החיוביים של AR PSA אינם קיימים עוד ומדגימים תלות אופיינית באנדרוגנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בהפרדת המזנכימה של הסינוס האורוגניטלי מהאפיתל. כאפיתל סינוס אורוגניטלי מזהם ייצור בלוטות ועלול לבלבל את התוצאות שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבידוד מזנכימה של הסינוס העורוגניטלי (UGSM) ממכרסמים על מנת לבחון את פוטנציאלה ביצירת אפיתליום של ערמונית אנושית. באמצעות שילוב של UGSM עם תאי גזע פלוריפוטנטיים והשתלת התערובת בקפסולה הכלית של עכבר מאכסן, חוקרים שואפים להבין את מנגנוני ההיווצרות של סרטן הערמונית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר על סרטן הערמונית
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- סרטן הערמונית הוא בעיה בריאותית משמעותית.
- הבנת המנגנונים המולקולריים המוקדמים היא קריטית למניעה.
- דרושות מערכות מודל אנושיות לצורך מחקר יעיל.
- ל-UGSM יש פוטנציאל ביצירת אפיתל של הערמונית.
מטרת המחקר
- לבידוד UGSM מעוברי מכרסמים.
- לבדיקת היכולת של UGSM להשרות התפתחות של אפיתל פרוסטטה אנושי.
- לפיתוח מודל לחקר תחילתו של סרטן הערמומי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של הסינוס העורוגניטלי מעוברי מכרסמים.
- הפרדת ה-UGSM מהאפיתל.
- שילוב של UGSM עם תאי גזע פלוריפוטנטיים.
- השתלה של תערובת התאים תחת הקפסולה הרנלית (קפסולת הכליה) של עכבר מאכיל.
תוצאים עיקריים
- היווצרות מוצלחת של אפיתל ערמונית אנושי על כליה של עכבר.
- תיקוף באמצעות ביטוי של PSA הספציפי לבני אדם.
- הדגמה של הפוטנציאל של UGSM במחקר של הערמונית.
- תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של התחלה של סרטן הערמונית.
מסקנות
- UGSM יכול להשרות ביעילות היווצרות של אפיתל ערמונית אנושי.
- מודל זה מהווה כלי בעל ערך למחקר של סרטן הערמונית.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון את המנגנונים העומדים בבסיס התהליך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לצורך הקריטי במערכות מודל ממקור אנושי שאינן חשופות להורמונים (hormone-naïve) במחקר של סרטן הערמונית, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של גורמי פגיעוּת גנטית. באמצעות ניצול מזנכימה של הסינוס העורוגניטלי של מכרסמים כדי להשרות אפיתל של ערמונית אנושית מתאי גזע, היא מספקת פלטפורמה חזויה לתיקוף מטרות ולחקירת מסלולים. גישה זו תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי האצת הבדיקות הפונקציונליות של גנים מועמדים לקרינוגנזה לפני זיהוי המולקולות המובילות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות בחינת ההשלכות הפונקציונליות של גנים מועמדים לרגישות לסרטןה פרוסטטה בהקשר של אפיתל אנושי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות יצירה תלויה בטסטוסטרון של אפיתל פרוסטטה אנושי תקין, תוך הבהרת תלות באותות קולטן אנדרוגן.
- ערך ניבוי: מאיץ את הערכתם של שילובי גנים הנחשבים ככאלה המקדמים או מונעים קרצינוגנזה בהשוואה למודלים טרנסגניים מסורתיים של מכרסמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות לבדיקה: יוצר מבנים אפיתליאליים של פרוסטטה אנושית שעברו תיקוף, המתאימים לסריקת תרכובות להמשך וניתוח סממנים ביולוגיים.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של ביטוי PSA ספציפי לאדם כמדד תפקודי להבדלה אפיתליאלית ולתגובה לאנדרוגנים.
- שחזוריות: בידוד סטנדרטי של UGSM והשתלה בקפסולה הכלית תומכים בעקביות בין מעבדות ביצירת המודל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: יוצר אפיתליום של ערמונית אנושית שאינו חשוף להורמונים, אשר משחזר את השושלות הבזאליות והלומינליות, ובכך מאפשר לחקור אירועים מוקדמים של קרצינוגנזה.
- המשכיות תרגומית: מספק גשר ממניפולציה גנטית של תאי גזע לתוצאות פנוטיפיות ברמת הרקמה במארח עם מערכת חיסונית מוחלשת.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר הערכה של שינויים גנטיים תחת תנאים מבוקרים התלויים באנדרוגן לפני התחייבות לתוכניות פרה-קליניות יקרות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות לגבי גורמים גנטיים במערכת אפיתליאלית רלוונטית לבני אדם, ובכך תומכת בקבלת החלטות של go/no-go לפני פיתוח בדיקות ומאמצים לזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבירור נתיבים ובהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנים כגון אינטראקציות סטרומליות-אפיתליאליות בהיווצרות רקמת ערמונית.
- סריקה: מייצרת מבנים אפיתליאליים סטנדרטיים שניתן להשתמש בהם להערכת השפעות של תרכובות על דיפרנציאציה ותגובה הורמונלית.
- אנליזה: מייצרת סממנים ביולוגיים כמותיים הספציפיים לבני אדם (למשל, PSA) ותוצרי קריאה אימונוהיסטוכימיים לאימות שושלת תאים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברצף מהפרעה גנטית לתוצאות היסטולוגיות במערכת הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקת מטרות גנטיות מרובות או שילובים שלהן במודל עקבי של אפיתליום ערמונית אנושי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במודלים של קרצינוגנזה של ערמונית באמצעות השראת סטרומה מוגדרת.
- ערך תפעולי: מקדם הדירות באמצעות נהלים סטנדרטיים לבידוד UGSM ולהשתלה בקפסולה הכלית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור חזרה מהירה של היפותזות גנטיות במערכת המבוססת על תאים אנושיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס לתעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תיקוף פונקציונלי בהקשר אפיתלי המגיב להורמונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח עוברי של מכרסמים והפרדת רקמות כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של UGSM.
- תלוי במודלים של מאחסנים עם מערכת חיסונית מוחלשת להשתלה בקפסולה הכלית ולהישרדות של השתל הזנוגראפי.
- מחייב תשתית כירורגית סטרילית וטיפול לאחר ניתוח להבטחת הישרדות חיית המאחסן.
- כולל עיבוד רקמות לאורך מספר ימים, הכולל דיסוציאציה אנזימטית ושלבי תרבית ליצירת סספנסיות של תאים בודדים.
- מוגבל בשל ההסתמכות הנוכחית על השתלות זנוגראפיות in vivo, עם פוטנציאל עתידי ליצירת בלוטות in vitro או שימוש ב-iPSC.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Isolation of the Urogenital Sinus from Mouse or Rat Embryos
2:52
Separation of the Urogenital Sinus Mesenchyme
5:13
Transplantation of Tissue Recombinant Underneath the Renal Capsule
6:57
Representative Tissue Transplantation Results
8:21
Conclusion
