היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אורוגניטל מכרסמים, מזנכימה סינוס או UGSM מעוברי מכרסמים ותערובות רקמות השתלה לתוך קפסולת הכליה שיכולה ליצור אפיתל ערמונית אנושי. זה מושג על ידי בידוד הסינוס האורוגניטלי מעוברי עכבר או חולדה. לאחר מכן, המזנכימה של הסינוס האורוגניטלי מופרדת מהאפיתל.

לאחר מכן משולבים תרחיפי תאים בודדים של מזנכימה של סינוס אורוגניטלי עם תאי גזע פלוריפוטנטיים. לבסוף, תערובת התאים מושתלת מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אפיתל ערמונית אנושי שנוצר על כליית העכבר באמצעות אימות ביטוי PSA ספציפי לבני אדם.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד הערמונית והתחלת המחלה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון קסנוגרפט של גידולי ערמונית אנושיים ואינדוקציה של קווי תאים גידוליים שבועיים ליצירת גידולים. לאחר המתת חסד של עכבר או חולדה בהריון מתוזמן ובידוד העוברים, הפרד אותם משק מי השפיר, חתוך את חבל הטבור והעביר אותם לצינור של 50 מיליליטר המכיל חנקים קרים כקרח. מאזנים את תמיסת המלח ושומרים על קרח.

הניחו עובר בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר והשתמשו במספריים כדי לחתוך אותו בגובה הבולוס. הסר את הקיבה והמעי הדק ולאחר מכן אתר את השחלות בעובר הנקבי, הנמצאות בקטבים של הכליות או באשך אצל הזכר הממוקם בגובה שלפוחית השתן. תחת טווח דיסקציה.

השתמש במספריים של ונציה כדי לחתוך את דופן הבטן כדי לחשוף את שלפוחית השתן ואת הדופן האחורית של הבטן. שחרר את דרכי המין העליונות מהחיבורים ושחרר את חבל הטבור. חותכים את עצם הערווה ובעזרת מלקחיים עדינים של דומונט.

בצורה בוטה, הפרד אותו מהדופן הקדמית של הסינוס האורוגניטלי. הפרד את הדופן האחורית של הסינוס האורוגניטלי מפי הטבעת וחתך את הסינוס האורוגניטלי עם שלפוחית השתן בקצה התחתון. לאחר מכן הפרד את שלפוחית השתן מהסינוס האורוגניטלי.

אחסן את הסינוס האורוגניטלי וחסום ב-HBSS קר כקרח. מעבירים את הסינוס האורוגניטלי לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 1% טריפסין ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום ודוגרים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה הסר את הטריפסין והוסף 10% FBS ו- DM A MF 12 בינוני כדי לנטרל את העיכול.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים במחט או בקצה דק כדי להקניט בזהירות את השרוול המזנכימלי הדביק מצינור האפיתל. שמירה על צינור האפיתל שלם מפחיתה את הסיכוי לזיהום תאי אפיתל של המזנכימה. זה יכול לגרום להיווצרות בלוטות מכרסמים יחד עם אפיתל הבלוטות האנושי שמקורו בתאי גזע.

העבירו את ה-UGSM לתוך שפופרת חדשה של 50 מיליליטר המכילה מדיום DMM F 12 המכיל 10% FBS 1% סטרפטוקוס עט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות וננו-מולר אחד. R 1 8 81 דגירה על הצינור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך הלילה. למחרת צנטריפוגה את הרקמה ב-200 גרם.השליכו את הסופרנטנט והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את הגלולה.

לאחר הסרת ה-PBS, יש להשהות את הרקמה ב-0.2% קולגנאז ב-D-M-A-M-F 12 ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין במשך שעה, מערבל במרץ את רקמת העיכול שלוש פעמים עד שהיא הופכת לתערובת תאים בודדים הומוגנית ומנטרל את הקולגנאז על ידי הוספת מדיום D-M-A-M-F 12 עם 10% FBS 1% סטרפטוקוס עט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות וננו-מולרית אחת R 1 8 81. שטפו את התאים שלוש פעמים על ידי כדורים ב-200 גרם והשעיית התאים ב-HBSS. לבסוף, החייאה, השעו את התאים המזנכימליים ב- DMM F 12 והשתמשו בציטומטר המו כדי לספור אותם לביצוע ההשתלה.

לאחר הכנת אזור ניתוח סטרילי והרדמת עכבר עירום אתימי זכר עם הזרקת IP של קטמין קסילזין, על פי פרוטוקול הטקסט, בצע צביטה בבוהן כדי לאשר את רמת ההרגעה הכינו את העכבר בניתוח על ידי גילוח אזור הניתוח במידת הצורך, וניקויו עם שלושה מגבונים לסירוגין של 70% אלכוהול ואחריהם תמיסת בטדין. לאחר מריחת משחת עיניים יש לבצע חתך אורכי של סנטימטר אחד בגב ולהמשיך לחתוך את דופן הבטן בחתך אורכי של 0.5 ס"מ. סחטו בעדינות את הכליה מהבטן והשתמשו בטיפות של מי מלח סטריליים כדי לשמור על לחותה.

לאחר מכן, בעזרת מחט מזרק בגודל 27, נקב בעדינות את קפסולת הכליה כדי ליצור אתר הזרקה לתערובת התאים. לאחר מכן מלאו מחט מזרק בגודל 28 ב-10 מיקרוליטר של תערובת תאים והכניסו אותה לאט לאתר הניקוב, תוך חדירה לפרנכימת הכליה. כדי להגיע לאזור מתחת לקפסולה הכליה.

הזרקו 10 מיקרוליטר מתערובת התאים ליצירת בולוס על הכליה מתחת לקפסולת הכליה והוציאו את המחט. החזר את הכליה לחלל הבטן ואבטח את השכבה השרירית של הצפק בארבעה תפרי ניילון. סגרו את העור עם תפרים או סיכות והשתמשו במי מלח סטריליים כדי לנקות את כל הדם מהעור.

מוצגת כאן תמונת אולטרסאונד של קסנוגרפט גדל שמונה שבועות לאחר ההשתלה. האזור המעוגל מייצג את הקסנוגרפט על פני הכליה. תמונות אלה מדגימות צמיחת קסנוגרפט על פני הכליה.

לאחר 12 שבועות, תאי ES אנושיים המושתלים בהיעדר סינוס אורוגניטל, מזנכימה תיצור טרטומה גדולה, ואילו מזנכימה של סינוס אורוגניטלי המושתל לבד לא יצליח ליצור שום מבנה שניתן להבחין בו. מוצג במרכז. לוחות של איור זה הם צביעות אימונוהיסטוכימיות מייצגות של אפיתל ערמונית אנושי שמקורו בתאי גזע לעומת רקמת ערמונית אנושית בוגרת.

כפי שמוצג כאן משמאל, הבלוטות מכילות שכבת אפיתל לומינלית חיובית AR. זה גם PSA חיובי, שכבת תאי אפיתל בסיסית חיובית P 63 וכרומוגרנין נדיר. תאים נוירואנדוקריניים, הבלוטות אינן סרטניות כפי שמוצג על ידי צביעת A-M-A-C-R שלילית על סירוס המארח.

תאי התאורה החיוביים של AR PSA אינם קיימים עוד ומדגימים תלות אופיינית באנדרוגנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בהפרדת המזנכימה של הסינוס האורוגניטלי מהאפיתל. כאפיתל סינוס אורוגניטלי מזהם ייצור בלוטות ועלול לבלבל את התוצאות שלך.