Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

פרוטוקול זה מתאר דה-סלולריזציה של כליות חולדות Sprague Dawley על ידי זלוף קדמי של חומרי ניקוי דרך כלי הדם, ויוצר מטריצות חוץ-תאיות של כליות המשמשות כתבניות לאכלוס מחדש עם תאי אפיתל כליה אנושיים. רסלולריזציה ושימוש בבדיקת זלוף רזזורין לניטור הצמיחה מבוצעים בתוך ביו-ריאקטורים זלוף שתוכננו במיוחד.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאכלס מחדש פיגומי מטריצה חוץ-תאיים של כליות מכרסמים תלת מימדיים בתאי אפיתל כליה אנושיים. זה מושג על ידי דה-סלולריזציה ראשונה, כליה של חולדת האו עם סדרה של תמיסות דטרגנט המוחדרות דרך עורק הכליה במשך תקופה של 26 שעות. לאחר מכן הכליה עוברת עיקור ופיגומי המטריצה החוץ-תאיים של הכליה מוזרקים עם 40 מיליון תאי אפיתל צינורי קליפת כליה אנושית או RCTE תחת זלוף עורקי אנטגרדי רציף בתוך מערכת כור Biore שתוכננה בהתאמה אישית.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את יכולתם של תאי RCTE לאכלס מחדש את פיגום הכליה על ידי בדיקת ER וזלוף וניתוח אימונוהיסטוכימי. טכניקת תרבית תאים תלת מימדית זו מאפשרת לחוקרים לאכלס מחדש מטריצה חוץ-תאית של איבר שלם. תאי פיגום מופקדים בתוך החלל הפריטובולרי בתוך המטריצה החוץ-תאית כדי לאפשר גורמי חקירה וקשירה המשפיעים על צמיחת התאים, התמיינות והתבגרותם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אלטרנטיביות כמו ייצור פיגומי פולימר סינתטיים, הוא שהמטריצה החוץ-תאית הכלייתית מאפשרת הידבקות, התפשטות והתבגרות של התאים המועברים בתוך רשת מורכבת של חלבונים מבניים טבעיים, גורמי גדילה ורכיבים ביולוגיים אחרים. התחל את הליך הדה-סלולריזציה על ידי חיבור צנתר עורק הכליה של כל כליה מופשרת לקצה צינור מעגל הזלוף במורד הזרם מהמשאבה, וודא שלא נלכדו בועות אוויר בצנתר. אם קיימות בועות אוויר בצנתר, השתמש במיקרו פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב את הבועות החוצה ולמלא את הקטטר בנוזל.

תלו את הכליה לאורך הדופן הפנימית של ריקה של חמישה ליטר כך שעורק הכליה לא יתעקם או יתפתל, והתאם את כונן המשאבה לחמישה מיליליטר לדקה. לאחר מכן לחץ על התחל לאחר אישור שכל כליה מחלחלת על ידי התבוננות בטפטוף של תמיסות מתחתית האיבר בתוספת כל כליה עם התמיסות המתאימות כפי שצוין בתרשים הזרימה בסוף הזלוף לאחסן את הכליות המפורקות ב-PBS בצינור חרוטי של 50 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס או מקסימום שתיים. לאחר הרכבת מעגל הזלוף, אנו מסירים את מכסה הבורג האדום על ראש הביוריאקטור ופיפטה 50 מיליליטר של 0.1% לחומצה אצטית, תמיסת אתנול 4% למאגר הבינוני דרך הפתח.

בעזרת מחסנית משאבה גדולה, חבר את קטע צינור המשאבה הפריסטלטית לראש המשאבה. לאחר מכן התאם את קצב הזרימה לחמישה מיליליטר לדקה. לחץ על התחל ואפשר למעגל להתניע כאשר הנוזל ממלא את קו השפע ומגיע ליציאה הפתוחה שנותרה של זין העצירה התלת-כיווני.

השתמש בתקע פיתוי זכר כדי לחבר את היציאה. אפשר למעגל לפעול במלואו עד שלא נצפה אוויר בצינורות מעגל הזילוף או בחלק הפנימי של הכניסה. מקבל פיתוי מוציא בועות ממעגל הזלוף על ידי הגדלה זמנית של קצב הזרימה של המשאבה.

כאשר המערכת מוכנה במלואה, עצור את כונן המשאבה ואתה מעקר מלקחיים בגודל שישה אינץ'. כדי לחבר בזהירות את קצה הפיתוי הנשי של קטטר עורק הכליה לכניסה הגברית, קבל פיתוי על המשטח הפנימי של ראש הביוריאקטור, וודא שהחיבור הדוק ושלא נשאר אוויר בקטטר. אפשר לכליה להיתלות בעדינות מצנתר עורק הכליה כך שעורק הכליה לא יתפתל או יתעקם.

לאחר מכן הדק את המהדק המתכתי המחזיק את ראש הביוריאקטור וגופו יחד כך שמאגר הביוריאקטור אטום היטב וסגור את מכסה הבורג. כעת יש לעקר את הכליות עם זלוף בטמפרטורת החדר של תמיסת אתנול לכל חומצה אצטית בחמישה מיליליטר לדקה. לאחר שעה, עצור את המשאבה ופתח את מכסה הבורג האדום.

באמצעות מזיק סטרילי, הפיפטה שלך שואבת בזהירות את כל התמיסה ממאגר הביוריאקטור. לאחר מכן פיפטה 50 מיליליטר PBS טרי למאגר הביוריאקטור. סגור את מכסה הבורג והפעל את המשאבה לשלוש זלוף רצוף של שעה בטמפרטורת החדר בחמישה מיליליטר לדקה.

לאחר שטיפת ה- PBS הסופית, שאפו את מי המלח מהמאגר והוסיפו 50 מיליליטר מדיום למאגר עם מכסה בורג סגור. העבר את הביוריאקטור עם מעגל הזלוף המצורף לחממה בעלת קיבולת גדולה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן חבר את מעגל הזלוף של הביוריאקטור למשאבה והחדיר את הכליות בארבעה מיליליטר לדקה למשך שעה אחת לפחות לפני הזריעה.

כדי לתאית, הכליות אוספות מספר מספיק של צלוחיות תרבית לריכוז הישיבה הרצוי. לאחר מכן, לאחר שאיבת מדיום התרבות מכל בקבוק, השתמש ב -10 מיליליטר של האנזים המפרק התאים המתאים כדי להרים את תאי האפיתל הצינוריים של קליפת הכליה מהבקבוק ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, התחל לבדוק את הצלוחיות במיקרוסקופ ניגודיות פנים כל שתי דקות עד שנצפה ניתוק קיפול.

לאחר מכן, לאחר נטילת כמות קטנה של תאים לספירה, יש לדלל את תרחיף התאים הקשור בנפח שווה של מדיום טרום רפואי ולצנטריפוגה את התאים resus. השעו את הגלולה בנפח מתאים של מדיום תרבית כדי להשיג ריכוז סופי של פעמיים פי 10 לתאים השביעיים למיליליטר. העבירו שני מיליליטר ממתלה הישיבה, צלחת תרבות של 35 מילימטר, ואז ציירו את נפח שני המיליליטר למזרק סטרילי של חמישה מיליליטר.

העבר את הביוריאקטור הזלוף לארון בטיחות ביולוגי וסובב את שסתום זין העצירה כדי לסגור את הזרימה ליציאת הישיבה. הסר את תלוש הפיתוי הגברי, חבר מזין העצירה וחבר את המזרק. לאחר מכן העבירו במהירות את מעגל הזלוף בחזרה לחממה והשתמשו במחסנית המשאבה הגדולה כדי להדק את קטע צינור המשאבה הפריסטלטית לראש המשאבה כדי להושיב את התאים.

סגור את יציאת שסתום זין העצירה המצביעה לכיוון המשאבה והזריק לאט את התאים לפיגום הכליה. לאחר מכן סובב את שסתום תא העצירה כדי לסגור את הזרימה מהמזרק ולהפעיל את המשאבה במהירות של 25 מיליליטר לדקה. לאחר 15 דקות, הורד את קצב זרימת המשאבה לארבעה מיליליטר לדקה, והחלף את המדיום למחרת וכל יומיים לאחר מכן.

כדי להעריך את הכדאיות וההתפשטות של התאים, החלף באופן אספטי את מדיום התרבית עם 10 מיליליטר של תמיסת עבודה של זרין לזלוף של ארבעה מיליליטר לדקה של פיגומי הכליה לאחר שעה בדיוק, אסוף את תמיסת הזארין המותנית והמופחתת חלקית ובצע זלוף נוסף של ארבעה מיליליטר לדקה. עם 100 מיליליטר של תרבית טרייה, כליות בינוניות שופעות ברצף במים ותמיסות ניקוי מדוללות הפכו שקופות יותר בהדרגה במשך תקופה של 26 שעות על ידי זלוף חומרי הניקוי הסופי, רשת כלי הדם של הכליות ובמיוחד, כלי הדם בין הלוברים מוצגים באופן בולט בפיגום הנטול תאים. האיבר כולו מנוקה מתאים מקומיים ומשאיר מאחור את רשת קרום הבסיס השלמה של צינורות גלומרולי ותעלות איסוף ואת המטריצה החוץ-תאית של כלי דם נטולי תאים.

בנוסף לכלי הדם הגדולים יותר, ממברנות הבסיס המיקרו-וסקולריות בתוך הגלומרולי שומרות גם על שלמותן המבנית. תאי RCTE שנזרעו לתוך פיגום הכליה כפי שהודגם זה עתה ביתם בעיקר לאזורים בקליפת המוח של פיגום הכליה, שם הם מאכלסים מחדש את צינורות הפרג הגלומרולריים. תאים מעטים מוטמעים בתוך הגלומרולי ביום הראשון לאחר הזריעה, וביום השביעי, הגלומרולים כמעט נטולי תאים בעוד שרוב התאים הללו תופסים את האזורים בקליפת המוח של המטריצה החוץ-תאית הכלייתית.

לאחר שבעה ימים של תרבית זלוף קדמית, צינורות קו RCTE רבים נמצאים בצינורות המדולריים והפפילריים החיצוניים ואוספים ברווזים לאחר אכלוס מחדש של תאי RCTE ושבוע אחד של תרבית זלוף. עם זאת, השקיפות שנצפתה לאחר דה-סלולריזציה הולכת לאיבוד והכליה המאוכזבת נראית אטומה וקרובה יותר במראה למצבה המקורי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו או ניתוח אימונוכימי של מצע תרבית מותנה כדי לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד משתנים המצבים המטבוליים או הפנוטיפיים של תאים אלה בתוך המטריצה החוץ-תאית הכלייתית?

היכולת לפתח פיגומים חוץ-תאיים ולהוסיף בחזרה מכירות תורמים למטריצה מאפשרת לחוקרים לתאר צמיחה והתבגרות בתלת מימד בתוך פיגומי מטריצת אקסו כלייתית טבעיים. המטרה הסופית היא להשתמש בטכנולוגיה זו ככלי להבנה טובה יותר של מנגנוני התיקון וההתחדשות של הכליות.