ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal
14 באוגוסט 2013
אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לטהר RNA מדגימות כירורגיות של רשתית אנושית לצורך ניתוח טרנסקריפטום בהיפרדציה של הרשתית. תוך שימוש ביומן לביצוע פעולה זו, מוכנים במעבדה הרכיבים והחומרים הדרושים לאיסוף הדגימה הכירורגית ונשלחים לבית החולים. במהלך ההליך הכירורגי, הדגימה נאספת ומוחזרת למעבדה.
לאחר מכן מטהרים את ה-RNA באמצעות הליך סטנדרטי של מדרג צסיום כלוריד, ונבדקת איכות ה-RNA המטוהר. לבסוף, ניתוח של ביטוי mRNA מראה כי הן דלקת והן ניוון של פוטורצפטורים מעורבים בהיפרדות רשתית, כפי שמעידים שינויים בביטוי של גנים מרכזיים. בתהליכים אלו, שזוהו באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי, היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות טהרת RNA קיימות, כגון GTIN chlor מההפקה, הידועה גם כ-ole, הוא שה-RNA המתקבל אינו מזוהם ב-DNA.
היישום של טכניקה זו נשען על טיפולים בהיפרדות רשתית, שכן היא מספקת אמצעים טכניים לפיתוח טיפולים עזר חדשניים. עבור כל דגימה שנדרשת לאיסוף, השתמשו בפיפטה נקייה מ-RNA כדי למלא מבחנה סטרילית בעלת תחתית עגולה מפוליאתילן בנפח חמישה מיליליטר עם 2.4 milliliters של תמיסת guanine chloride בריכוז six molar נקייה מ-RNA. השתמשו בגז ארגון כדי למלא את חלקם העליון של המבחנות.
לאחר מכן, סגרו במהירות את הפקק תוך לחיצה חזקה כדי להבטיח איטום מלא. פעולה זו תמנע את חמצון ה-guine chloride במהלך שנות אחסון במספר שנים בארון הניתוח. בשלב הבא, העבירו כל אחד מהמבחנות בנפח 5 milliliter לתוך מבחנה סטרילית מפוליפרופילן בעלת תחתית קונית בנפח 50 milliliter.
לאחר הוספת הרקמה והברגת המכסה, הניחו את המבחנות בנפח 50 milliliter במעמד פוליסטירן. לאחר מכן, הניחו את המעמד ואת המעטפות המוכנות, יחד עם טפסי המשלוח המוכנים, בתוך קופסת קרטון בבית החולים. העבירו את קופסת הקרטון מארון הניתוח לחדר הניתוח.
במהלך הניתוח, העבר את דגימת הרשתית לשפופרת מלאה בפתרון chloride בכמות של quantity. סגור את השפופרת היטב. ערבב את השפופרת לזמן קצר.
לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מכשיר לערבוב מבחנות דם (blood tube rocker) למשך 10 דקות. מלאו את טופס הדגימה הנלווה עם זיהוי המטופל, תאריך הניתוח והערות נוספות. לאחר מכן, כתבו את מספר הזיהוי על מבחנת ה-50 milliliter המתאימה והמסומנת במספר.
לאחר מכן, הכניסו את המבחנה בנפח 5 מיליליטר המכילה את הדגימה הכירורגית לתוך המבחנה בנפח 50 מיליליטר. החזירו את נייר הספיגה וסגרו את המבחנה עם הפקק. לאחר מכן, הכניסו את המבחנה בנפח 50 מיליליטר ואת טופס קבלת הדגימה למעטפה המרופדת המתאימה וחתמו אותה.
לאחר קבלת הדגימה במעבדה, הומוגניזו את הדגימה בתוך מבחנת ה-5 ml באמצעות הומוגנייזר poly tron TM בהגדרה המקסימלית למשך דקה אחת, תוך כדי תנועת המבחנה מעלה ומטה. לאחר הומוגניזציית הדגימה, כדי למצות את הפוליסכרידים, הוסיפו 270 µL של אשלגן אצטט בריכוז 2 M והניחו את המבחנה על שייקר במצב אופקי. נערה בעוצמה למשך 10 דקות, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-6,500 G בטמפרטורה של 20 °C.
לאחר הסבוב, השתמש בפיפטה כדי לשאוב בזהירות את הפראקציה המסיסה מבלי להפריע למשקע. העבר את הנוזל העליון למבחנה סטרילית של 14 מיליליטר הנטולת RNA. אל הנוזל העליון, הוסף 5.3 מיליליטר של 1% Laurel Sarcosine ב-100 millimolar Tris, ו-3.2 גרם של cesium chloride.
הסרקוזין ימיס את הממברנה והצסיום כלוריד משמש ליצירת גרדיאנט. ערבבו את המבחנה באמצעות וורטקס למשך דקה אחת. הוסיפו 1.8 milliliters של צסיום כלוריד EDTA למבחנת צנטריפוגה פולימרית סטרילית של 11 milliliters.
לאחר מכן, באמצעות פיפט פסטור סטרילית של 10 מיליליטר, שכבדו את תמיסת ה-RNA על גבי תמיסת cesium chloride EDTA על ידי הזרמתה לאורך הדופן הפנימית של המבחנה. הניחו את המבחנות בצנטריפוגה. במידת הצורך, השתמשו במבחנה שנייה המכילה את התמיסות ללא רטינה לצורך איזון, וסובבו במשך 24 שעות ב-225, 000 G בטמפרטורה של 20 °C.
למחרת. בעקבות הסבוב, תיווצר שכבת ליפידים בחלקו העליון של המבחנה. ה-DNA יהיה במרכז וה-RNA ישקע למשקע בתחתית המבחנה.
השתמשו בפיפט פסטור סטרילי כדי להסיר בזהירות את שכבת השומן העליונה ולשלוף אותה באמצעות פיפט פסטור סטרילי שני. הסירו את התמיסה בהדרגה עד לשאיבת ה-DNA הצמיגי. השליכו את התמיסה ואת ה-DNA.
לאחר מכן, באמצעות פסטור-פיפט סטרילי שלישי, יש להסיר ולהשליך את שארית התמיסה, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע ה-RNA. כעת, באמצעות סכין מנתחים שעברה עיקור בלהבה, חתוך את המבחנה כפי שמוצג כאן והשלך את החלק העליון.
הנח את החלק הנותר הפוך על גזה סטרילית. הפוך את המבחנה והשתמש בפיפט כדי לשטוף אותה בעדינות עם 160 µl של guine chloride. הנח למשקע להתייבש במשך 10 דקות.
ברגע שהמשקע יבש, יש לתלו אותו מחדש ב-150 microliters של Tris-EDTA-SDS. לאחר מכן, יש להוסיף 150 microliters של Tris-EDTA ו-30 microliters של סודיום אצטט בריכוז 3 molar, ולאחר מכן לערבב ב-vortex כדי להשקיע את ה-RNA. יש להוסיף 900 microliters של 100% ethanol קר מאוד.
ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס והניחו אותה על קרח נמס למשך 30 דקות. לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-18,000 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבוב, ייתכן שייראה משקע לבן זעיר, אך לא תמיד הוא יהיה נראה לעין.
בין אם ניתן לראות את המשקע ובין אם לאו, יש לשאוב בעדינות את הנוזל העליון (supernatant) ולהשליכו. לאחר מכן, כדי להסיר עודפי מלח, יש להוסיף 500 µL של 70% ethanol בטמפרטורת החדר ולערבב ב-vortex; יש לצנטריפוג את המבחנה למשך 20 דקות ב-18,000 G בטמפרטורה של 4 °C. לאחר חזרה על שלב השטיפה ב-70% ethanol והצנטריפוגה, יש להשתמש בפיפט P200 כדי להסיר את שאריות ה-ethanol.
השאירו את המשקע להתייבש באוויר למשך 10 דקות. השהו שוב את המשקע ב-50 µL של מים שעברו טיפול ב-dey וערבבו בעוצמה באמצעות וורטקס למשך שתי דקות. לאחר מכן, מקמו את הדגימה במקלח מים בטמפרטורה של 45 °C למשך 15 דקות.
לריסוספנזיה מלאה של ה-RNA. לבסוף, קבע את ריכוז ה-RNA באמצעות בליעה באורך גל של 260 nanometers ובצע אנליזה של ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל בהתאם לפרוטוקול. במסמך המצורף, כדי לבחון את התסריפטום של היפרדות רשתית, נעשה שימוש בנוהל המופיע בכתב העת כדי להפיק ולנתח RNA רשתי מ-18 מטופלים עם היפרדות רשתית ו-18 ביקורות תואמות גיל שהוכנו מרשתית לאחר המוות.
לאחר מכן, ה-RNA טוהר ונחקר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל ו-rettino base כפי שמתואר בדוח זה. מוצגים כאן גרפים רדאריים המייצגים את הביטוי של הגן CCL two, המקודד לכימוקין של מונוציטים MCP-1. החלק הימני של האיור, המסומן ב-RD, מתייחס ל-RNA ממטופלים עם היפרדות רשתית, בעוד שהחלק השמאלי, המסומן ב-N, מתייחס ל-RNA מקבוצות הביקורת, כפי שניתן לראות כאן. היפרדות רשתית מובילה לעלייה בביטוי של CCL two, כפי שמעידים ערכי ה-C הגבוהים ברוב דגימות ה-RD מימין בהשוואה לאלו של הביקורות משמאל.
עלייה זו מעידה על דלקת בחולים עם היפרדות רשתית, כפי שניתן לראות כאן. ביטוי הגן GNAT1, המעביר אותות בפוטורצפטורים מסוג rod, פחת בניגוד ל-CCL2; הערכים נמוכים עבור דגימות ה-RD מצד ימין. כמו כן, נצפתה ירידה בביטוי האופסין של קונוסים לאורכי גל קצרים, OPN1SW, ובגן ההומאו CRX, דבר המרמז על דגנרציה של פוטורצפטורים מסוג rods ו-cones בחולים עם היפרדות רשתית. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שינויים בביטוי גנים בעקבות היפרדות רשתית. ניתן ליישמה גם עבור פתולוגיות רשתיות אחרות במודלים של בעלי חיים, כגון דגנרציות רשתיות תורשתיות.
אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים כיוון שהיא דורשת ידע בחומצות גרעיניות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כשלב הכנה, שכן תהליך ה-RNA לאחר האישור הוא מורכב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בטיהור RNA מדגימות כירורגיות של רשתית אנושית על מנת לנתח את התעתק השליח (transcriptome) במקרים של היפרדות רשתית. נעשה שימוש בפרוצדורת מדרג צסיום כלוריד סטנדרטית כדי להבטיח את איכות ה-RNA לצורך ניתוחים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- היפרדות רשתית עלולה להוביל לאובדן ראייה משמעותי.
- הבנת השינויים בביטוי גנים היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- איכות ה-RNA חיונית לביצוע ניתוח טרנסקריפטומי מדויק.
- שיטות קיימות לטיהור RNA עלולות להוביל לזיהום.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לטיהור RNA מדגימות רשתית.
- ניתוח ביטוי mRNA הקשור להיפרדות רשתית.
- הערכת המעורבות של דלקת וניוון פוטורצפטורים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף דגימות רשתית במהלך כריתת רשתית (retinectomy).
- הכנת ריאגנטים וחומרים להפקת RNA.
- פרוצדורת מדרג צסיום כלוריד סטנדרטית לטיהור RNA.
- הערכת איכות ה-RNA לצורך אנליזת מיקרומערך (microarray).
תוצאים עיקריים
- זיהוי שינויים מרכזיים בביטוי גנים הקשורים להיפרדות רשתית.
- ראיות לדלקת ולניוון של פוטורצפטורים בניתוח הטרנסקריפטומי.
- הדגמה כי השיטה החדשה מונעת זיהום ב-DNA.
- שיפור באיכות ה-RNA באופן המתאים לניתוח microarray.
מסקנות
- שיטת טיהור ה-RNA שפותחה יעילה עבור דגימות רשתית.
- ניתוח טרנסקריפטומי מספק תובנות לגבי המנגנונים של היפרדות רשתית.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו למחקר נוסף במחלות רשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
היפרדות רשתית מעוררת דלקת וניוון של הפוטורצפטורים בו-זמנית, ובכך יוצרת סביבה פתופיזיולוגית מורכבת המקשה על פיתוח טיפולים. שיטת jouRNAl מאפשרת פרופיל טרנסקריפטומי ברמת דיוק גבוהה של דגימות רשתית אנושיות שהוצאו בניתוח, ובכך מספקת מקור בר-הרחבה של רקמה רלוונטית למחלה לצורך תיקוף של מטרות טיפוליות. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור חתימות מולקולריות לפנוטיפים קליניים, ובכך מספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח בקווי ייצור בתחום האופתלמולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי סימולטני של מסלולים דלקתיים וניווניים ברקמת רשתית אנושית.
- ערך תפעולי: הופך דגימות כירורגיות שנזרקו למערכות ביולוגיות מתוקפות, ובכך מפחית את ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים להערכה מוקדמת של מטרות טיפוליות.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתוני ביטוי ממקור אנושי של CCL2, GNAT1, OPN1SW, ו-CRX כסמנים ביולוגיים להתקדמות של RD.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק RNA נקי מ-DNA המתאים ל-microarray ול-RT-PCR, ובכך מבטיח את ספציפיות הבדיקה עבור קריאות של ביטוי גנים.
- ערך תפעולי: פרוטוקול סטנדרטי של מדרג צסיום כלוריד מבטיח הדירות בין סדרות ואתרים שונים, מה שמאפשר קמפיינים של סריקה בקנה מידה רחב.
- מוכנות לבדיקה: איכות ה-RNA המבודד תוקפה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ובבדיקת בליעה, מה שתומך בהערכה אמינה של תרכובות בסריקות פנוטיפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין השלב הגילוי לעבודה הפרה-קלינית באמצעות שימוש בדגימות רשתית אנושיות כדי לתקף ממצאים במודלים של בעלי חיים לניוון רשתית תורשתי.
- הלימה של סמנים ביולוגיים: מזהה את העלייה בביטוי של CCL2 ואת הירידה בביטוי של גנים של פוטורספטורים כחתימות ניתנות לתרגום לניטור טיפולי.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת תובנה מכניסטית לגבי התקדמות RD, ובכך מסייעת לתכנון ניסויים קליניים המבוססים על סטרטיפיקציה של סמנים ביולוגיים.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
שיטת jouRNAl משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות מוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מבוססת רקמות אנושיות לפני אופטימיזציית המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מסלולי דלקת וניוון באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי של דגימות רשתית אנושיות.
- סריקה: מספקת תוצרי RNA כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לפרופיל ביטוי גנים בייצור המוני (high-throughput).
- אנליטיקה: מייצרת מדדים מדידים (למשל, upregulation של CCL2, downregulation של GNAT1) המאפשרים השוואה בין תנאים ותעדוף מטרות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין נתוני דגימות אנושיות לרצף פרה-קליני על ידי אפשור ניתוח השוואתי במערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להפקת RNA מרקמות כירורגיות, הישימה על פני פתולוגיות של הרשתית ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות טרנסקריפטומיקה ישירה של רקמה אנושית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות טיהור בקיסר חלוריד (cesium chloride), תוך מזעור השונות בין סדרות במחקרים רב-מרכזיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go באמצעות אספקת ראיות מולקולריות ממקור אנושי, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות בתחום האופתלמולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם לסיכון, בהתבסס על חתימות מקבילות של דלקת וניוון בדגימות שהופקו מחולים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומצות גרעיניות ובטכניקות של אולטרה-צנטריפוגציה במדרג (gradient ultracentrifugation).
- תלוי בגישה לקיסריום כלוריד, לאולטרה-צנטריפוגות ולתשתית מעבדתית נקייה מ-RNase.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין היחידות הכירורגיות, הפתולוגיות והביולוגיה המולקולרית לצורך מעקב אחר הדגימות.
- התאמה לסוגי רקמות אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של שלבי ההומוגניזציה והליזיס.
- מגבלה מעשית: תנובת ה-RNA תלויה בהעברה מהירה של הדגימות ובמניעת חשיפה ל-RNase במהלך האיסוף הכירורגי.
