ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal
August 14th, 2013
אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר RNA מדגימות כירורגיות רשתית אנושיות לניתוח טרנסקריפטום בניתוק רשתית. באמצעות יומן לשם כך, הריאגנטים והחומרים הדרושים לאיסוף הדגימה הכירורגית מוכנים במעבדה ונשלחים לבית החולים. במהלך ההליך הכירורגי נאספת הדגימה ומוחזרת למעבדה.
לאחר מכן מטוהר ה-RNA באמצעות הליך שיפוע צזיום כלוריד סטנדרטי ומוערכת איכות ה-RNA המטוהר. בסוף. ניתוח ביטוי mRNA מראה כי גם דלקת וגם ניוון קולטני אור מעורבים בניתוק רשתית המסומן על ידי שינויים בביטוי של גנים מרכזיים. בתהליכים אלה שזוהו על ידי ניתוח טרנסקריפטומי, היתרון העיקרי של כתב העת על פני טיהור אורנה קיים כגון GTIN כלור ממיצוי, הידוע גם בשם ole, הוא התוצאה של האורנה אינה מזוהמת ב-DNA.
היישום של טכניקה זו משתרע לקראת טיפולים בהיפרדות רשתית מכיוון שהיא מספקת אמצעים טכניים לפיתוח טיפולים משלימים חדשים. עבור כל דגימה שיש לאסוף, השתמש בפיפטה נטולת RNA כדי למלא צינור תחתון עגול מפוליאתילן סטרילי של חמישה מיליליטר ב-2.4 מיליליטר של תמיסת גינא כלוריד נטולת RNA מולארית. השתמש בגז ארגון כדי למלא את החלק העליון של הצינורות.
לאחר מכן הנח במהירות את הכובע ולחץ בחוזקה כדי להבטיח שהוא אטום. זה ימנע חמצון של גינאה כלוריד במשך מספר שנים של אחסון בארון הניתוחים. לאחר מכן, הניחו כל אחד מחמשת צינורות המיליליטר בצינור תחתון חרוטי מפוליפרופילן סטרילי בנפח 50 מיליליטר.
לאחר הוספת רקמה והברגה של המכסה, הניחו את צינורות 50 מיליליטר במתלה פוליסטירן. לאחר מכן הניחו את המתלה והמעטפות המוכנות יחד עם טפסי משלוח מוכנים בקופסת קרטון בבית החולים. הביאו את קופסת הקרטון מארון הניתוחים לחדר הניתוח.
במהלך הניתוח יש להכניס את דגימת הרשתית לתוך צינור מלא בתמיסת כמות וכלוריד. סגור את הצינור בחוזקה. מערבבים את הצינור בקצרה.
לאחר מכן הנח את הצינור על נדנדת צינור הדם למשך 10 דקות. מלא את טופס המדגם הנלווה עם זיהוי המטופל, תאריך הניתוח וכל הערה נוספת. לאחר מכן כתוב את מספר הזיהוי על השפופרת הממוספרת המתאימה של 50 מיליליטר.
לאחר מכן הנח את הצינור של חמישה מיליליטר עם הדגימה הכירורגית לתוך הצינור של 50 מיליליטר. החלף את טישו הנייר ומכסה את הצינור. לאחר מכן הנח את צינור ה-50 מיליליטר וצורת צריכת הדגימה לתוך המעטפה המרופדת המתאימה ואטום אותה.
לאחר קבלת הדגימה במעבדה, הומוגניזציה של הדגימה בצינור של חמישה מיליליטר עם הומוגנייזר פוליטרון TM בהגדרה המקסימלית למשך דקה אחת תוך הזזת הצינור למעלה ולמטה. לאחר שהדגימה הומוגנית, כדי לחלץ את הפוליסכרידים, הוסף 270 מיקרוליטר של שני אשלגן אצטט מולארי והנח את הצינור על שייקר במצב אופקי. מנערים במרץ במשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה למשך 10 דקות בחום של 6, 500 גרם ב -20 מעלות צלזיוס.
לאחר הסיבוב, השתמש בפיפטה כדי לשאוב בזהירות את החלק המסיס מבלי להפריע לגלולה. העבירו את הסופרנטנט לצינור נטול RNA סטרילי של 14 מיליליטר. ליד הסופרנטנט, הוסיפו 5.3 מיליליטר של 1% ולורל סרקוזין ב-100, טרי מילי-מולארי ו-3.2 גרם צזיום כלוריד.
הסרקוזין ימס את הממברנה והצזיום כלוריד משמש ליצירת שיפוע. מערבבים את הצינור על ידי מערבולת למשך דקה אחת. הוסף 1.8 מיליליטר של צזיום כלוריד EDTA לצינור צנטריפוגה פולימרי סטרילי של 11 מיליליטר.
לאחר מכן, בעזרת פיפטה סטרילית של 10 מיליליטר, שכבו את תמיסת ה-RNA על תמיסת EDTA של צזיום כלוריד על ידי כך שתאפשרו לה לזרום לאורך המשטח הפנימי של הצינור. מניחים את הצינורות בצנטריפוגה. השתמש בצינור שני המכיל את המאגרים ללא רשתית כאיזון במידת הצורך, וסובב במשך 24 שעות ב-225,000 גרם ב-20 מעלות צלזיוס.
למחרת. לאחר הסיבוב תיווצר שכבת שומנים בחלק העליון של הצינור. הדנ"א יהיה באמצע והרנ"א יופעל בתחתית הצינור.
השתמש בפיפטה סטרילית כדי להסיר בזהירות ולהשליך את שכבת השומנים העליונה בעזרת פיפטה סטרילית שנייה. הסר את התמיסה בהדרגה עד לשאיבת ה- DNA הצמיג. השלך את התמיסה וה- DNA.
לאחר מכן בעזרת פיפטה סטרילית שלישית, הסר והשליך את התמיסה שנותרה. הקפד לא להפריע לכדור ה-RNA. כעת בעזרת אזמל מעוקר להבה, חותכים את הצינור כפי שמוצג כאן וזורקים את החלק העליון.
הניחו את החלק הנותר הפוך על גזה סטרילית. הפוך את הצינור והשתמש בפיפטה כדי לשטוף אותו בעדינות עם 160 מיקרוליטר גינאה כלוריד. תן לגלולה להתייבש במשך 10 דקות.
לאחר שהגלולה יבשה, מושעה מחדש ב-150 מיקרוליטר טריס, E-D-T-A-S-D-S. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר של טריס, EDTA ו-30 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי, ואז מערבולת כדי לזרז את ה-RNA. הוסף 900 מיקרוליטר קר כקרח, 100% אתנול.
מערבל את הצינור ומניח אותו על קרח נמס למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור 30 דקות ב -18, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, כדור לבן זעיר עשוי להיות גלוי או לא.
בין אם ניתן לראות את הכדור ובין אם לאו, שאפו בעדינות את הסופרנטנט והשליכו אותו. לאחר מכן כדי להסיר עודפי מלח, הוסיפו 500 מיקרוליטר טמפרטורת החדר, 70% אתנול ומערבולת, צנטריפוגת הצינור, הצינור למשך 20 דקות ב -18, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר חזרה על השטיפה והסיבוב של 70% אתנול, השתמש בפיפטה P 200 כדי להסיר את כל האתנול שנותר.
תן לגלולה להתייבש באוויר במשך 10 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של תערובת מים מטופלים במרץ על ידי מערבולת למשך שתי דקות. לאחר מכן הניחו את הדגימה באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
להשעות לחלוטין את ה-RNA. לבסוף, קבע את ריכוז ה- RNA על ידי ספיגה ב -260 ננומטר ונתח את ה- RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל על פי הפרוטוקול. במסמך הנלווה, כדי לבחון את הטרנסקריפטום של היפרדות רשתית, נעשה שימוש בהליך היומן לשחזור וניתוח RNA רשתית מ-18 חולים עם היפרדות רשתית ו-18 בקרות תואמות גיל שהוכנו באמצעות רשתית לאחר המוות.
RNA טוהר ונותח לאחר מכן באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל ובסיס רטינו כמתואר בדוח זה, המוצגים כאן הם גרפים מכ"מיים המייצגים את הביטוי של הכימו-טקטי המונוציטי M CP גן אחד CCL שניים. החלק הימני של האיור המסומן RD מתאים ל-RNA מחולי היפרדות הרשתית, בעוד שהחלק השמאלי המסומן N הם RNA מבקרות כפי שניתן לראות כאן. היפרדות רשתית גורמת לוויסות מוגבר של CCL 2 כפי שמצוין על ידי ערכי C הגבוהים ברוב דגימות ה-RD מימין בהשוואה לאלו של הבקרות משמאל.
עלייה זו מצביעה על דלקת בחולים עם היפרדות רשתית כפי שניתן לראות כאן. הביטוי של קולטן האור המוט המתמר את הגן GNAT 1 ירד בניגוד ל-CCL 2, הערכים נמוכים עבור דגימות ה-RD מימין, ירידה בביטוי של חרוט הגל הקצר Opsin O PN אחד SW, והגן ההומאו CRX נצפה גם הוא מה שמרמז על ניוון קולטני אור של מוטות וחרוטים בחולים עם ניתוק רשתית באמצעות שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים בביטוי גנים בעקבות היפרדות רשתית. ניתן ליישם אותו גם על פתולוגיה אחרת של הרשתית במודלים של בעלי חיים כגון ניוון רשתית תורשתי.
אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהיא דורשת ידע בחומצת גרעין. Cy.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כעבודה, אשר RNA לאחר ההסמכה הוא מסובך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מתמקד בטיהור RNA מדגימות כירורגיות של רשתית אנושית כדי לנתח את הטרנסקריפטומים במקרים של ניתוק רשתית. משתמשים בנוהל מדורג סטנדרטי של צזיום כלורי כדי להבטיח את איכות ה-RNA לניתוח נוסף.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- ניתוק רשתית יכול להוביל לאובדן ראייה משמעותי.
- הבנת שינויים בביטוי גנים חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- איכות ה-RNA חיונית לניתוח טרנסקריפטומי מדויק.
- שיטות טיהור RNA קיימות עשויות להוביל לזיהום.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לטיהור RNA מדגימות רשתית.
- לנתח ביטוי mRNA הקשור לניתוק רשתית.
- להעריך את המעורבות של דלקת והתנוונות פוטו-קולטנים.
שיטות ששימשו
- איסוף דגימות רשתית במהלך רטינוקטומיה.
- הכנת ריאגנטים וחומרים לחילוץ RNA.
- נוהל מדורג סטנדרטי של צזיום כלורי לטיהור RNA.
- הערכת איכות ה-RNA לניתוח מיקרו-מערך.
תוצאות עיקריות
- זיהוי שינויים עיקריים בביטוי גנים הקשורים לניתוק רשתית.
- ראיות לדלקת והתנוונות פוטו-קולטנים בניתוח הטרנסקריפטומי.
- הוכחה שהשיטה החדשה מונעת זיהום DNA.
- שיפור באיכות ה-RNA המתאים לניתוח מיקרו-מערך.
מסקנות
- שיטת טיהור ה-RNA שפותחה יעילה לדגימות רשתית.
- ניתוח טרנסקריפטומי מספק תובנות לגבי המנגנונים של ניתוק רשתית.
- מחקרים עתידיים יכולים למנף שיטה זו למחקר נוסף במחלות רשתית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
