ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי
28 באוקטובר 2022
אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.
שיטה זו מסייעת להבין הבדלים פנוטיפיים של תאי RP על פני הרשתית האנושית כולה. טכניקת הדיסקציה שפיתח דייוויד אורטולן ניתנת לשחזור ביצירת ניתוק בין RP לרשתית. ותוכנת REShAPE ממש ניכרת בניתוח תמונות גדולות של תושבות שטוחות RP.
השיטה ש- Davide פיתחה יכולה לשמש לחקר הבדלים אזוריים בפנוטיפ RP מחולים עם סוגים שונים של מחלות ניווניות ברשתית. כדי להתחיל, לחתוך את 50 מיליליטר צינור חרוטי מעט מתחת לסימן 5 מיליליטר. באמצעות דבק חם, חברו את קצה הצינור לתחתית סירת השקילה.
לאחר מכן ערבבו את שני המרכיבים של ערכת האלסטומר מסיליקון ביחס של 10 ל-1 תוך הימנעות מלכידת אוויר. יוצקים את התערובת לתוך סירת השקילה המכילה את החתיכה הכדורית הזו של הצינור התחתון העגול. לרפא את הסיליקון בטמפרטורת החדר במשך הלילה.
הסר את סירת השקילה ואת הצינור התחתון העגול מתבנית הסיליקון שנרפאה. ראשית, מלא מזרק של 1 מיליליטר עם 1700 מילימולים של תמיסת D-מניטול והצמד אותו למחט של 21 מדים. הכנס את המחט דרך pars plana כדי למנוע ניקוב החדר הקדמי של העין ולהזריק 400 microliters של התמיסה לתוך הזגוגית.
השאירו את העין בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. באמצעות זוג מספריים עדינים ומלקחיים, חותכים לפתוח את החדר הקדמי ברמה של pars plana. מלאו את תא העיניים האחורי ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום.
תחת מיקרוסקופ הסטריאו, מקם את המקולה המתוארת ככתם צהוב על הרשתית. חותכים את העין לרבעים, כלומר האף, הזמני, העליון והנחות, תוך הקפדה על שימור האזור המקולרי. הסר את המחטים אם הן מפריעות.
מעבירים את הפרפר לחדר האחורי של העין לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה DPBS עם סידן ומגנזיום. לפני הסרת הרשתית, סמן את עלי הכותרת המכילים את המקולה על ידי ביצוע חתך בצורת V בשוליים הציליאריים. מרימים וחותכים את כל הזגוגית שמונחת על הרשתית.
חותכים את הרשתית מהשוליים הציליאריים בכל עלי הכותרת ומבטיחים לא לגרד את ה-RPE. מניחים את הרקמה ב-4% PFA ודוגרים במשך שעה. יש לשטוף שלוש פעמים עם DPBS המכיל סידן ומגנזיום.
מעבירים את הרקמה למיכל מלא באותו חיץ ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להעביר את הדגימה לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה DPBS עם סידן ומגנזיום. אגרוף את ראש עצב הראייה עם אגרוף ביופסיה של 1.5 מילימטר.
לאסוף את הרשתית ולאחסן אותו באותו חיץ ב 4 מעלות צלזיוס. כדי להסיר את הסקלרה מכורואיד RPE, הרם בעדינות את שכבת הכורואיד RPE מהפריפריה. ואז עם זוג מספריים קפיץ Vannas, לחתוך את כלי choroidal ורקמת חיבור כי הם בין sclera ו RPE.
לאחר הפרדה מוחלטת מן הסקלרה, לאסוף את שכבת הכורואיד RPE. מעבירים את הרקמה למיכל מלא ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום, ומאחסנים אותה ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את כורואיד ה-RPE לבאר אחת של צלחת בעלת שש בארות.
יש לחסום את הדגימה ולחדור אליה למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגירה של הדגימה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם phalloidin מצומד עם 647 fluorophore בדילול של 1 עד 250 במאגר permeabilization. יש לשטוף שלוש פעמים ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום.
העבר את דגימת הכורואיד RPE לשקופית זכוכית בגודל 50 x 75 מילימטר ושטח אותה. חותכים כל עלה כותרת לשניים כדי להפוך את הדגימה לחמיא יותר. צייר קווי מתאר של ההר השטוח עם עט הידרופובי.
כדי להרוות את ה-lipofuscin autofluorescence, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת ה-autofluorescence quencher, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. יש לשטוף היטב ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום. הסר את ה- DPBS והוסף את מדיום ההרכבה.
הניחו כיסוי על התושבת השטוחה ואטמו עם לק. פתח את התוכנה. בכרטיסייה ספריות, בחר את תיקיות הקלט והפלט.
בספריית הפלט, אפשר לתוכנה לשנות באופן אוטומטי את הנתיב לספריית הקלט או לתהליך. לחלופין, שנה את ספריית הפלט באופן ידני. כדי ליצור מפות חום, בחר הכל מהתפריט הנפתח בכרטיסייה יצירת תמונות צבע.
סמן את התיבה לא בתכונה השתמש במגבלות ידניות כדי לאפשר לתוכנה להשתמש בערכי המינימום והמקסימום שזוהו בכל תמונה. סמן את התיבה כן כדי להתאים באופן ידני את טווח הערכים עבור כל מפת חום מטרית של צורה. לאחר מכן לחץ על הלחצן הגדר מגבלות והוסף ערכים בתיבות הטקסט כדי לבחור טווחים עבור הפרמטרים הבודדים.
לאחר שינוי ערכי העניין, לחץ על שמור. לחץ על ברירות מחדל נמוכות כדי לאפס את כל המגבלות. כדי לבחור סף גודל תא בגודל תא נמוך יותר, הוסף את גודל התא הקטן ביותר שייכלל בניתוח.
בגודל תא עליון, הוסף את גודל התא הגדול ביותר שייכלל. בהמרת פיקסלים ליחידות אמיתיות, בדוק לא כדי להפעיל את הניתוח ביחידות פיקסלים, בדוק כן כדי להפעיל את הניתוח במיקרומטרים. באורך הפיקסלים של סרגל קנה המידה, הזינו את ערך הפיקסלים בתיבת המלל.
באורך של מיקרוני סרגל קנה מידה, הזן את המרחק המתאים במיקרומטרים. כדי להתחיל את הניתוח, לחץ על עבור על זה. פרוטוקול זה יוצר תמונה חד-מישורית של תושבת שטוחה שבה מיקום התא מזוהה על-ידי סגמנטציה שנוצרה על-ידי REShAPE של גבולות תא RPE.
כמו כן, 30 מדדי צורה, כולל שטח התא של תאי ה-RPE הבודדים, נמדדים עבור כל תא RPE שזוהה כהלכה. ניתן להסיר אריחים שחורים הנובעים משאריות של רשתית או עצמים בהירים אחרים על-ידי בחירה באחת מאפשרויות הסינון הזמינות בתפריט הנפתח של מסנן RT. שימוש בתמונות RBG לניתוח העיצוב מחדש יפיק תמונות בינאריות שחורות לחלוטין.
במקרה כזה, המרת תמונות RGB לגודל אפור תפיק תמונות בינאריות מפולחות כהלכה. אם הכתם אינו אופטימלי או אם הדגימה ניזוקה משריטה, ניתן לזהות גושים גדולים של תאים כתא אחד גדול מאוד. במקרה זה, אובייקטים גדולים ניתן להוציא מן הניתוח על ידי שינוי סף גודל התא.
כדי להשיג רקמה שטוחה, RP ו choroid צריך להיות מופרדים מן sclera גם אם צעדים אלה יכולים לקחת זמן רב. בעקבות הדור של RP שטוח הר, ניתן להכתים עבור סמני RPE נוספים, כך שתוכל ללמוד אזורים שונים של monolayer RP. בשיטה זו גילינו חמש אוכלוסיות RP שונות הרגישות באופן דיפרנציאלי למחלות ניווניות שונות ברשתית.
סקירה כללית
המחקר מציג שיטה חדשה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית האנושית, ומאפשר יצירת מפות שטוחות של RPE/צ'ורואיד שלמים. גישה זו מאפשרת ניתוח היסטולוגי ומורפומטרי, ומשפרת את ההבנה של ההבדלים הפנוטיפיים בתאי RPE ברחבי הרשתית האנושית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- מחקר רשתית
- ניתוח היסטולוגי
- מחקרים מורפומטריים
רקע
- מחלות ניוון רשתית מציגות מאפיינים פנוטיפיים שונים.
- הבנת ההבדלים בתאי RPE היא חיונית לקידום אסטרטגיות טיפוליות.
- שחזור גבוה של טכניקת הניתוק הוא חיוני לתוצאות עקביות.
שיטות ששימשו
- טכניקת ניתוק שפותחה להפרדת RPE מהרשתית
- רשתית אנושית כמערכת ביולוגית
- שימוש בתוכנת REShAPE לניתוח מפות שטוחות של RPE
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של RPE מהרשתית הושגה בשיטה עקבית.
- ניתוח משופר באמצעות תוכנה איפשר הערכות מורפומטריות מפורטות.
- איפשר חקירה של הבדלים אזוריים בפנוטיפ של RPE הקשורים למחלות רשתית שונות.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה אמינה להפקת RPE, אשר חיונית לחקירת בריאות הרשתית.
- הממצאים מקדמים את ההבנה של מנגנוני מחלות רשתית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Consistent generation of RPE/choroid flatmounts from human eyes enables high-fidelity phenotypic analysis critical for early discovery and target validation in retinal disease research. The integration of reproducible tissue separation with quantitative morphometric analysis supports predictive confidence in disease modeling and biomarker identification. This workflow strengthens translational continuity from discovery through preclinical evaluation for retinal therapeutics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of regional RPE phenotypes relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by preserving RPE cell morphology and junctions.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative shape metrics across the epithelium.
- Improves predictive confidence for prioritizing retinal disease targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible flatmounts for downstream cellular assays.
- Delivers quantitative outputs via AI-based segmentation and morphometric analysis.
- Enables scalable preparation of samples for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on RPE morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling analysis of RPE populations sensitive to degeneration.
- Maintains continuity from human tissue discovery to preclinical model validation.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on robust phenotypic data.
- Supports translational biomarker identification through region-specific analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification in retinal disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling region-specific RPE analysis.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible flatmounts with quantitative morphometric outputs.
- Analytics: Provides 30 shape metrics per cell for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects human tissue findings to preclinical model validation for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable workflow adaptable to other species and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tissue preparation and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of retinal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human ocular tissue dissection and handling.
- Needs access to fluorescence imaging and AI-based morphometric analysis software.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and analysis.
- Adaptable to other animal models with protocol optimization.
- Sample integrity and staining quality are critical for accurate segmentation and quantification.
