Name: ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למד שיטת ניתוח להפרדת אפיתל פיגמנט רשתית מרשתית אנושית ליצירת שטחים שטוחים. השיטה מאפשרת ניתוח מורפומטרי מפורט של תאי RPE באמצעות תוכנת REShAPE לחקר מחלות רשתית ניווניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליבת ההיסטולוגיה של המכון הלאומי לעיניים (NEI) על השימוש ב-Zeiss Axio Scan.Z1. אנו מודים גם לתורמים, למשפחותיהם, לרשת הראייה המתקדמת ולמכון עין האריות על נדיבותם. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות NEI IRP (מענק מספר ZIA EY000533-04).

גלובוסים אנושיים של Cadaver התקבלו מרשת הראייה המתקדמת (ברמינגהאם, AL). עבודה המבוצעת על רקמת מטמון פטורה על ידי ועדת הביקורת המוסדית של NIH מוועדת האתיקה של המחקר.
1. משלוח גלובוס עיניים
<ol><li>לאחר ההשבה, שלחו גלובוסים טריים לעיניים במיכל מלא ב-DPBS קר כקרח 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. הערה: עדיף לנתח את העין תוך 24 שעות לאחר האנוקלציה. המורפולוגיה של RPE אינה משתנה במהלך חלון זמן זה.</li>
</ol>2. הכנת תבנית סיליקון
<ol><li>חותכים את 20 מ"מ התחתונים של צינור תחתון עגול בקוטר 25 מ"מ. מניחים אותו בבסיס סירת שקילה מרובעת (81 מ"מ x 81 מ"מ x 25 מ"מ).</li>
	<li>ערבבו את שני המרכיבים של ערכת הסיליקון אלסטומר ביחס של 10:1, תוך שימת לב לא ללכוד אוויר. יוצקים את התערובת לתוך סירת השקילה המכילה את החלק הכדורי של הצינור בעל התחתית העגולה.</li>
	<li>לרפא את הסיליקון בטמפרטורת החדר במשך הלילה. הסר את סירת השקילה ואת הצינור התחתון העגול מתבנית הסיליקון שנרפאה.</li>
</ol>3. דיסקציה RPE
<ol><li>נקו את הסקלרה של גלובוס העיניים הטרי של השרירים ורקמות החיבור. הדקו את העין לתבנית הסיליקון באמצעות מחטי 27 G המושחלות דרך הסקלרה. מלאו את חלל התבנית ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. הערה: שימו לב לא לפרוץ את תא העין. המחטים צריכות לעבור רק דרך הסקלרה.</li>
	<li>השתמש במזרק של 1 מ"ל ובמחט של 21 גרם כדי להזריק ~ 400 μL של תמיסת D-מניטול של 1,700 mOsm לתוך הזגוגית. הכנס את המחט דרך pars plana כדי למנוע ניקוב החדר הקדמי של העין. השאירו את העין בטמפרטורת החדר למשך ~ 45 דקות.</li>
	<li>חותכים את החדר הקדמי ברמה של pars plana באמצעות זוג מספריים עדינים ומלקחיים. מלאו את תא העיניים האחורי ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. תחת הסטריאומיקרוסקופ, למקם את המקולה (הכתם הצהוב על הרשתית).</li>
	<li>אם יש חותך זגוגית ניתוחי, הסר את הזגוגית והחלף אותה ב- DPBS 1x עם Ca 2+ ו- Mg2+. לחלופין, נסו להרים את הזגוגית עם מלקחיים ולחתוך אותה במספריים עדינים.</li>
	<li>לשים לב לשמירה על האזור המקולרי, לחתוך את העין לרביעים: האף, טמפורלי, מעולה, נחות. הסר את המחטים אם הם מפריעים.</li>
	<li>מעבירים את התא האחורי של העין לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. לפני הסרת הרשתית, מסמנים את עלי הכותרת המכילים את המקולה על ידי ביצוע חתך קטן (בצורת V) בשוליים הציליאריים. מרימים וחותכים את כל הזגוגית שמונחת על הרשתית.</li>
	<li>הרימו בעדינות את הרשתית ממספר צדדים בעזרת מרית מעוקלת או זוג מלקחיים כדי לבדוק אם הרשתית התנתקה מה-RPE ולאפשר לנוזל לזרום בין שתי השכבות. הערה: הרשתית עדיין תהיה מחוברת בפריפריה (שוליים צילאריים) ובעצב הראייה.</li>
	<li>חותכים את הרשתית מהשוליים הציליאריים בכל עלי הכותרת, ומבטיחים לא לגרד את ה- RPE. מניחים את הרקמה ב-4% PFA ודוגרים במשך ~1 שעות. יש לכבס 3x עם DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. מעבירים את הרקמה למיכל מלא ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+ ומאחסנים אותה ב-4 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה, הרשתית מחוברת רק בעצב הראייה. זוהי נקודת עצירה בניסוי זה.</li>
	<li>העבירו את הדגימה לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. אגרוף את ראש עצב הראייה עם אגרוף ביופסיה 1.5 מ"מ ולאסוף את הרשתית. אחסן את הרשתית העצבית ב- DPBS 1x עם Ca 2+ ו- Mg2+ ב- 4 °C. הערה: לפני ניקוב ראש עצב הראייה, הקפד לחתוך את עצב הראייה ככל האפשר בצד הסקלרלי. זה יגדיל את הדיוק של האגרוף. ניקוב עצב הראייה לאחר קיבוע השטוח ב-4% PFA מפחית את הנזק לתאי ה-RPE הממוקמים סביב עצב הראייה.</li>
	<li>הסר את הסקלרה מה-RPE/choroid על ידי הרמה עדינה של שכבת ה-RPE/choroid מהפריפריה וחיתוך כלי הדם הכורואידיים ורקמת החיבור שנמצאים בין הסקלרה ל-RPE בעזרת זוג מספריים קפיציים של Vannas. לאחר שה-RPE/choroid מופרד לחלוטין מהסקלרה, אספו את שכבת ה-RPE/choroid. העבירו את הרקמה למיכל מלא ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+ ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי.</li>
</ol>4. מכתים
<ol><li>מעבירים את ה-RPE/choroid לבאר אחת מתוך צלחת של 6 בארות. יש לחסום ולחדור את הדגימה ב-DPBS 1x עם Ca 2+ וב-Mg 2+ עם אלבומין (BSA) מסרום בקר (BSA), 0.5% טווין20 ו-0.5% טריטון X-100 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה של הדגימה עם פלואידין מצומד עם פלואורופור 647 בדילול של 1:250 ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg 2+ עם 1% BSA, 0.5% טווין20 ו-0.5% טריטון X-100 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש לשטוף 3x ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+.</li>
	<li>העבירו את דגימת ה-RPE/choroid למגלשת זכוכית בגודל 50 מ"מ x 75 מ"מ ושטחו אותה. חותכים כל "עלי כותרת" לשניים כדי להפוך את המדגם לחמיא יותר. שימו לב למקולה. ציירו קו מתאר של השטוח בעזרת עט הידרופובי.</li>
	<li>כדי להרוות את ה-lipofuscin autofluorescence, יש להוסיף 500 μL מתמיסת ה-autofluorescence quencher המדוללת ל-1:20 ב-70% אתנול ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף ביסודיות (לפחות 3x) ב-DPBS 1x עם Ca 2+ ו-Mg2+. הסר את ה- DPBS והוסף את מדיום ההרכבה. יש להניח את הכיסוי על הפתח ולאטום בעזרת לק.</li>
	<li>דמיינו את המשטח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (רצוי באמצעות מטרה של 10x או 20x).</li>
</ol>5. ניתוח REShAPE
הערה: מכיוון שהאלגוריתם מבוסס הבינה המלאכותית REShAPE אומן על תמונות 10x ו- 20x, לכן מומלץ מאוד להשתמש במטרה של פי 10 או 20 בעת הדמיה. אם לא, יהיה צורך לשנות את קנה המידה של התמונות בהתאם.
<ol><li>אם התמונות נרכשות עם יותר מערוץ פלואורסצנטי אחד, בודדו את הערוץ המשמש לרכישת גבולות התא. ייצא את התמונות כקובצי TIF בגווני אפור של 16 סיביות. הערה: אין צורך לייצא תמונות שנרכשו עם סיומת הקובץ .czi כקובצי TIF, אך עדיין יש לבודד את הערוץ המכיל את גבולות התא.</li>
	<li>התקן את התוכנה בפלטפורמות x64 או Linux (Centos 7). הערה: ניתן למצוא את התוכנה ואת הוראות ההתקנה בכתובת https://github.com/nih-nei/REShAPE.</li>
	<li>פתח את התוכנה (איור 1).</li>
	<li>בכרטיסייה ספריות, בחר את תיקיות הקלט והפלט. בספריית הקלט, בחר את התיקיה המכילה את התמונות. בספריית הפלט, אפשר לתוכנה לשנות באופן אוטומטי את הנתיב ל"ספריית קלט/מעובד". לחלופין, שנה את ספריית הפלט באופן ידני. הערה: התוכנה תחזור על כל התמונות הכלולות בתיקיית הקלט.</li>
	<li>בכרטיסייה ' אפשרויות סגמנטציה של NN' , בחרו בקביעות הבאות עבור פילוח תמונות:<ol><li>גודל אצווה: הקלד ערך של 20 בתיבת הטקסט כנקודת התחלה טובה, אך הקטן אותו אם למערכת נגמרות יחידות העיבוד הגרפי (GPU). הערה: התמונה המקורית מפוצלת לאריחים קטנים יותר לצורך עיבוד. גודל האצווה מציין כמה אריחים ניתן לעבד בו-זמנית.</li>
		<li>השתמש ב- GPU?: אם למערכת אין מספיק משאבי GPU, סמן את התיבה לא.</li>
		<li>קנה מידה פנימי: באמצעות התפריט הנפתח, שנה את שינוי קנה המידה הפנימי מ'ללא' במקרים שבהם התמונות לא נרכשו עם מטרה של 10x או 20x. לדוגמה, הקטן את קנה המידה של תמונות בגודל 40x למחצית הגודל באמצעות לחצן 1/2. אפשרויות שינוי קנה המידה הזמינות בתפריט הנפתח הן כדלקמן: 5x, 2x, ללא, 1/2, 1/5. הערה: למידת המכונה אומנה עם תמונות פי 10 ו-20x. ייתכן שהוא לא יזהה גבולות תא מתמונות שצולמו בהגדלות אחרות. במקרה זה, תמונות בינאריות יופיעו שחורות לחלוטין.</li>
		<li>Arti Filter: השתמש בכרטיסיית מסנן החפצים כדי להסיר חלקיקים בהירים מאוד (פסולת או חלקים קטנים של הרשתית או רקמת החיבור סביב עצב הראייה) שעשויים להימצא בתמונה ועלולים להפריע לסגמנטציה של גבול התא. לא נעשה שימוש במסנן כברירת מחדל. אפשרויות המסנן המלאכותי בתפריט הנפתח הן כדלקמן: רגיל, חזק וחלש.</li>
	</ol></li>
	<li>בכרטיסייה 'אפשרות תמונה פרושה ', הוסיפו ערך בתיבת המלל כדי לציין את מידת החפיפה בין אריחי התמונה באמצעות התאמת הפרמטר Pad Tiles By . חפיפה של 100 פיקסלים בדרך כלל עובדת היטב.</li>
	<li>בכרטיסייה 'אפשרויות גרפיקת פלט' , כווננו את ההגדרות ליצירת מפת חום:<ol><li>שחזור תמונות אריחים?: אם למערכת אין מספיק משאבים לניתוח תמונות גדולות, סמן את התיבה לא כדי לאפשר לתוכנה להשלים את הניתוח על ידי שמירת אריחים בודדים מבלי לשחזר את התמונה כולה.</li>
		<li>צור תמונות צבע: כדי ליצור מפות חום, בחר הכל מהתפריט הנפתח.</li>
		<li>עבור צביעה, בחר כל אחת מלוחות הצבעים השונים הזמינים בתפריט הנפתח: תרמי, ירוק, Mpl-מאגמה, שלב, אש, סילון, ציאן חם.</li>
		<li>בתיבה 'תבנית תמונה', שמרו את התמונות כ- TIF או PNG באמצעות בחירה באחת מהאפשרויות בכרטיסייה.</li>
		<li>ביחס למגבלות הידניות של השימוש? תכונה, סמן את התיבה לא כדי לאפשר לתוכנה להשתמש בערכי המינימום והמקסימום שזוהו בכל תמונה. סמן את התיבה כן כדי להתאים באופן ידני את טווח הערכים עבור כל מפת חום מטרית של צורה, ולחץ על הלחצן הגדר מגבלות כדי לבחור טווחים עבור הפרמטרים הבודדים על-ידי הוספת ערכים לתיבות הטקסט. לאחר שינוי ערכי העניין, לחץ על שמור. לחץ על טען ברירות מחדל כדי לאפס את כל המגבלות. הערה: השתמש במגבלות ידניות אם יש צורך להשוות מפות חום מתמונות מרובות, למשל בעת השוואת ההשפעות של תרכובות שונות על צורת התא. בדרך זו, נעשה שימוש באותו טווח ערכים. קבוצת הערכים שיש להזין באופן ידני משתנה בהתאם לסוג הדגימה. מומלץ להריץ כמה איטרציות כדי לבחור את הטווח האופטימלי.</li>
	</ol></li>
	<li>בכרטיסיה הגבלות גודל תא עבור ניתוח, בחר סף גודל תא עבור הניתוח:<ol><li>תחת גודל תא תחתון, הוסף בתיבת הטקסט את גודל התא הקטן ביותר שייכלל בניתוח.</li>
		<li>תחת גודל תא עליון, הוסף בתיבת הטקסט את גודל התא הגדול ביותר שייכלל בניתוח. הערה: יחידת גודל התא משתנה מפיקסלים למיקרומטרים בריבוע בהתאם לאפשרות שנבחרה בכרטיסייה המרת יחידה אוטומטית .</li>
	</ol></li>
	<li>בכרטיסייה המרת יחידה אוטומטית , בחר את היחידה המועדפת לניתוח:<ol><li>בהמרת פיקסלים ליחידות אמיתיות?, סמן את התיבה ללא כדי להפעיל את הניתוח ביחידות פיקסלים. סמן את התיבה כן כדי להפעיל את הניתוח במיקרומטרים.</li>
		<li>בתיבה ' אורך סרגל קנה מידה' (פיקסלים), הזינו את ערך הפיקסלים בתיבת המלל.</li>
		<li>בתיבה אורך סרגל קנה מידה (מיקרונים), הזן בתיבת הטקסט את המרחק המתאים במיקרומטרים.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי להתחיל בניתוח, לחץ על Go For It. הערה: התוכנה יכולה גם למדוד את כדאיות התאים כאשר התאים מוכתמים ב-4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ופרופידיום יודיד (לשונית אפשרויות CZI ), אך הדבר אינו חל על משטחי RPE.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig01.jpg"> איור 1: ממשק משתמש גרפי של REShAPE. לממשק המשתמש הגרפי יש כרטיסיות שונות לבחירת ספריות העבודה (הכרטיסייה Directories ), שינוי אפשרויות הפילוח (הכרטיסיות 'אפשרויות סגמנטציה של NN ' ו'אפשרויות תמונה באריחים '), ציון הפרמטרים לניתוח (הגבלות גודל תא לכרטיסיות ניתוח והמרת יחידות אוטומטית ) וליצירת מפת חום (הכרטיסייה 'אפשרויות גרפיקת פלט'). קיצור: GUI = ממשק משתמש גרפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<ol><li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion%3A+Dependence+on+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li>
<li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li>
<li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li>
<li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18(1997).</li>
<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
<li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. -H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li>
<li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

ההפרדה העקבית והיעילה של RPE ורשתיות אנושיות יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול זה. שיטה זו מאפשרת לחקור הבדלים אזוריים בצורת RPE על פני כל הרשתיות האנושיות5. שלב מכריע בפרוטוקול הוא ההפרדה הפיזית של ה-RPE והרשתית. אם שתי הרקמות אינן מנותקות לחלוטין באזורים מסוימים, יש להרים בעדינות את הרשתית, תוך הקפדה שלא לשבור את הרקמות. ניתוח REShAPE של flatmounts גדולים עשוי לדרוש שימוש במערכות עם משאבי RAM ניכרים. במקרה זה, ניתן להשבית את ההרכבה מחדש של התמונה כולה כדי לאפשר לתוכנה לסיים בהצלחה את הניתוח למרות היעדר משאבי עיבוד.
המגבלה העיקרית של השימוש ב- REShAPE כדי לפלח שטוחות RPE אנושיות היא שאלגוריתם הבינה המלאכותית אומן בעיקר על תמונות של RPE המושרה שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים. כתוצאה מכך, הפילוח של שטוחי RPE אנושיים הוא פחות מדויק. תאי RPE מתורמים זקנים מכילים כמות גדולה של ליפופוסצין7, והספקטרום הרחב של האוטופלואורסצנציה שלו מפריע לסגמנטציה של גבול התא. בעתיד, תמונות נוספות של שטוחות RPE ישמשו לשיפור סגמנטציה של גבולות התא בדגימה מסוג זה. למרות מגבלה זו, REShAPE הוכשרה במיוחד לזהות ולפלח גבולות תאי RPE ומתפקדת טוב יותר משיטות קיימות אחרות, כגון וורונוי8 וסגמנטציה של תאי RPE CellProfiler9 .
יתר על כן, בהשוואה לסגמנטציה ידנית 10, REShAPE מספק את היתרון של ניתוח תמונות גדולות במהירות (~ 130,000 פיקסלים x130,000 פיקסלים נבדקו). לסיכום, שיטת דיסקציה זו ניתנת לשחזור וניתן להרחיב אותה בקלות למודלים אחרים של בעלי חיים. בנוסף, התוכנה יכולה לשמש לחקר צורת RPE בעיניים שטוחות או במודלים של תרביות תאים כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים מסוימים. לבסוף, הרבגוניות של REShAPE הופכת אותו לישים באופן נרחב לניתוח של סוגים אחרים של תאי אפיתל.

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והרשתית העצבית קשורים זה בזה בחוזקה בגלל התלות הפיזיולוגית החזקה של הפוטורצפטורים ב-RPE. במהלך הדיסקציה, ההפרדה המכנית של הרשתית העצבית מה-RPE גורמת לקרע של תאי ה-RPE, כאשר החלקים האפיקליים של ה-RPE נותרים מחוברים למקטעים החיצוניים של הפוטורצפטורים ברשתית. היקף ההידבקות ברשתית RPE הוא כה גדול, עד שכמות הפיגמנט שנותרה על הרשתית לאחר ההפרדה משמשת לכימות עוצמת הידבקות הרשתית1. באופן ספציפי, צמתים הדוקים RPE ומבנה האקטין המחבר ביניהם, הממוקמים בצד האפיקלי, מתנתקים במהלך הפרדה מכנית. לכן, צביעת משטחי RPE עבור גבולות התא גורמת לחד-שכבתי מטושטש שבו לתאים רבים יש גבולות חסרים. השפעה זו מחריפה כאשר הרקמה קבועה עם paraformaldehyde (PFA) לפני דיסקציה, כמו חלבונים להיות crosslinked.
מחקרים על מתן תרופות תוך-ורידיות הראו כי זריקות של תמיסות היפרוסמוטיות בתא האחורי גורמות לניתוק רשתית 2,3. בניסויים אלה, 50 μL של פתרונות שונים, החל מ-1,000 mOsm ועד 2,400 mOsm, שהוזרקו באמצע הזגוגית, גרמו לניתוק הרשתית תוך דקות. יש לציין כי גם לאחר חשיפות ארוכות לתמיסות בעלות אוסמולריות גבוהה, הצמתים ההדוקים של RPE הופיעו שלמים בתמונות מיקרוסקופיות של אלקטרונים של ארנב וקוף3. בעקבות אסטרטגיה דומה, הזרקנו לתוך הזגוגית האמצעית תמיסה היפרוסמוטית של D-מניטול כדי לגרום לניתוק יעיל של הרשתית לפני ביצוע דיסקציה של RPE. מכיוון שמניטול D אינו מועבר על ידי RPE4, נשמר ריכוז תוך-ורידי גבוה, היוצר שיפוע אוסמוטי. ההפרדה היעילה של ה-RPE והרשתית על פני כל התא האחורי מבטיחה את שימור הצמתים הסלולריים של ה-RPE ומאפשרת לחקור את המורפומטריה של RPE על כל המשטח השטוח. בנוסף, פיתחנו תוכנה מבוססת בינה מלאכותית (AI) שמזהה ומפלחת גבולות תא RPE המסומנים באופן פלואורסצנטי, מכמתת 30 מדדי צורה שונים ומייצרת מפות חום של כל מדד להדמיה 5,6.

<table><tbody><tr><td>ניקוב ביופסיה 1.5 מ"מ&nbsp;</td><td>אקודרם בע"מ</td><td>P1525</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר</td><td>MP ביומדיקל</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 50 x 75 מ"מ, עובי #1.5&nbsp;</td><td>מעבדות לחקר המוח</td><td>5075-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>מרית מעוקלת</td><td>Katena</td><td>K3-6600</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>Southern ביוטק</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ 50 x 75 x 1.2 מ"מ</td><td>מעבדות לחקר המוח</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 21 גרם x 1-1/2 אינץ'</td><td>בקטון דיקינסון היפודרמי (BD)</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 27 גרם x 1-1/4 אינץ'</td><td>בקטון דיקינסון</td> היפודרמי (BD)<td>305136</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד 16%&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>PAL (Personna)</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תחתונים עגולים 50 מ"ל</td><td>Newegg</td><td>9SIA4SR9M88854</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>סירת משקל מרובעת (81 מ"מ x 81 מ"מ x 25 מ"מ)</td> <td>Sigma</td><td>W2876</td><td></td></tr><tr><td>מערכת כריתת זגוגית כירורגית</td><td>BD Visitrec</td><td>585100</td><td>מזרק אופציונלי</td></tr><tr><td>1 מ"ל</td><td>בקטון דיקינסון (BD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td>מרווה אוטופלואורסצנטי&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Affymetrix</td><td>20605</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים - 3 מ"מ חוד החנית</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15000-10</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והרשתית הן רקמות המחוברות מבחינה תפקודית ומבנית הפועלות יחד כדי לווסת את תפיסת האור והראייה. חלבונים על פני השטח האפיקליים של RPE קשורים קשר הדוק לחלבונים על פני השטח של המקטע החיצוני של הפוטורצפטור, מה שמקשה על הפרדה עקבית בין ה-RPE לבין הפוטורצפטורים/הרשתית. פיתחנו שיטה להפרדה יעילה של הרשתית מה-RPE של עיניים אנושיות כדי ליצור RPE/כורואיד ורשתית שטוחים שלמים לצורך אנליזה תאית נפרדת של הפוטורצפטורים ותאי ה-RPE. הזרקה תוך-גופית של תמיסה בעלת אוסמולריות גבוהה של D-מניטול, סוכר שאינו מועבר על ידי ה-RPE, גרמה להפרדת ה-RPE והרשתית על פני כל התא האחורי מבלי לגרום נזק לצמתים של תאי ה-RPE. לא נצפו טלאי RPE מחוברים לרשתית. תיוג פאלוידין של אקטין הראה שימור צורת RPE ואיפשר ניתוח מורפומטרי של האפיתל כולו. תוכנה מבוססת בינה מלאכותית (AI) פותחה כדי לזהות ולפלח במדויק את גבולות תאי ה-RPE ולכמת 30 מדדי צורה שונים. שיטת דיסקציה זו ניתנת לשחזור וניתן להרחיב אותה בקלות למודלים אחרים של בעלי חיים.

פרוטוקול זה יוצר תמונה חד-מישורית של משטח שטוח, שבו מיקום התא ו-30 מדדי הצורה נמדדים עבור כל תא RPE שזוהה כהלכה (איור 2). תיקיה בשם "מעובד" נוצרת באופן אוטומטי בתוך ספריית הקלט. תיקיה זו מכילה ארבע ספריות משנה, הנקראות "ניתוח", "מקודד צבע", "קבצים משולבים" ו"תמונות מקוטעות", וכמה קבצים זמניים שנוצרו במהלך הניתוח. התיקייה "קבצים משולבים" מכילה גיליון אלקטרוני עם כל מדידות הצורה וגיליון אלקטרוני עם התדרים של ספירות שכנות התאים של כל הקבצים יחד. התיקייה "Analysis" מכילה גיליון אלקטרוני עם כל מדידות הצורה וגיליון אלקטרוני עם התדרים של השכן לתא סופר עבור כל תמונה בנפרד. ספריית "תמונות מקוטעות" מכילה את המסכות הבינאריות הסופיות של גבולות תא RPE; ניתן להשתמש בו כדי להעריך את איכות הסגמנטציה. הספריה "מקודד צבע" מכילה מפות חום עבור כל מדידת צורה כדי להמחיש את תבניות הצורה בכל תמונה. ניתן למצוא את ההגדרות והקיצורים של מדדי הצורה בטבלה 1.
לפעמים RPE flatmounts יכול להכיל שאריות של חתיכות רשתית שלא הוסרו בצורה נקייה, במיוחד סביב עצב הראייה. צביעת פלוידין של הדגימה גורמת לאות חזק המגיע מהרשתית, וזה יכול לגרום לבעיות לסגמנטציה של גבול תא RPE. אריחים מסוימים ייראו שחורים לחלוטין, בעוד שהאריחים שמסביב יציגו סגמנטציה רגילה. עצמים בהירים אחרים שעשויים להיות נוכחים בתמונה יגרמו גם הם ליצירת אריחים שחורים (איור 3). במקרים אלה, בחירה באחת מאפשרויות הסינון (חלש, רגיל, חזק) הזמינות בתפריט הנפתח Arti Filter תמנע היווצרות אריחים שחורים.
REShAPE מצלם תמונות בגווני אפור של 8 סיביות או 16 סיביות כקלט, אך לא תמונות RGB. שימוש בתמונות RGB לניתוח REShAPE יפיק תמונות בינאריות שחורות לחלוטין. במקרה כזה, המרת תמונות RGB לגווני אפור תפיק תמונות בינאריות מפולחות כהלכה (איור 4). במקרים מסוימים שבהם גבולות ה-RPE אינם מזוהים כראוי, לדוגמה, אם הכתם אינו אופטימלי או אם הדגימה ניזוקה משריטה (איור 5A), גושים גדולים של תאים עשויים להיות מזוהים כתא אחד גדול מאוד (איור 5B). במקרה זה, ניתן להוציא עצמים גדולים מהניתוח על-ידי הקטנת סף גודל התא (איור 5C). ניתן להשיג זאת על-ידי הוספת ערך נמוך יותר בתיבת הטקסט גודל תא עליון . עם זאת, זה יגרום לשינוי בטווח של מפת החום. אם חוקר בוחר לעשות זאת, ניתן גם לשמור על טווח מפת החום המקורי (איור 5D) על ידי סימון התיבה כן בתכונה השתמש במגבלות ידניות. לאחר מכן, על החוקר ללחוץ לחיצה ימנית על הלחצן Set Limits ולהכניס את הערכים הרצויים בתיבות הטקסט כדי לציין את המגבלות הידניות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> איור 2: ניתוח מורפומטרי מלא של מונולייר RPE אנושי שלם. (A) תצוגת הגדלה נמוכה של RPE/כורואיד אנושי שלם (מגנטה: phalloidin). (B) תצוגה מוגדלת של תאי RPE מוכתמים בפלוידין. (C) סגמנטציה שנוצרה על-ידי REShAPE של גבולות תא ה-RPE עבור משטח RPE/כורואיד אנושי שלם ו-(D) התצוגה המוגדלת המתאימה. (E) מפת חום שנוצרה על-ידי תוכנה הממחישה את שטח התא של תאי ה-RPE הבודדים בכל השטח האנושי. קנה המידה התרמי בפינה השמאלית העליונה מציג את טווח הערכים שבהם נעשה שימוש. (F) התצוגה המוגדלת המתאימה מציגה תאי RPE בודדים בצבע לפי אזור. פסי קנה מידה = (B,D,F) 50 מיקרומטר, (A,C,E) 5 מ"מ. קיצור: RPE = אפיתל פיגמנט רשתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> איור 3: סינון של ממצאים בהירים. (A) משטח RPE אנושי המוכתם בגבולות התא (מגנטה: פלוידין) יכול להציג אזורים בהירים (מלבנים ירוקים) המפריעים לסגמנטציה. (B) סגמנטציית גבול תא ה-RPE של כל המשטח מכילה שלושה אריחים שחורים לחלוטין (חיצים ירוקים) המתאימים לאזורים בהירים של פלואורסצנציה. (ג,ה) שניים מהאריחים השחורים מתאימים לאזורים המכילים נקודות בהירות, שהן אולי חלק מהפסולת. (D) אחד האריחים השחורים נוצר על ידי פיסת רשתית עצבית סביב עצב הראייה שלא הוסרה כראוי. החלקים של הרשתית העצבית בהירים במידה ניכרת משכבת ה-RPE ומעכבים את פילוח התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> איור 4: דרושה תמונת קלט. תאי RPE המוכתמים בגבולות תא נשמרו כתמונות (A) RGB או כתמונות בגווני אפור (B) של 16 סיביות לצורך ניתוח REShAPE. (C) הפלט של ניתוח התמונה RBG הוא תמונה בינארית שחורה, (D) ואילו הניתוח של התמונה בגווני אפור מייצר תמונה בינארית מקוטעת נכונה של גבולות התא. REShAPE יכול לנתח רק תמונות בגווני אפור של 8 סיביות או 16 סיביות. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> איור 5: תוצאות לא אופטימליות . (A) תמונה של חלק מהחד-שכבתי RPE שבו התאים המוכתמים בפלוידין נשרטו בטעות. (B) מפת חום של תאי RPE הצבועים לפי ממד שטח התא. סף גדול של גודל תא עליון כולל אובייקטים גדולים בניתוח. (C) מפת חום של אזור תא שבה נבחר סף קטן יותר של גודל תא עליון כדי לא לכלול עצמים גדולים בניתוח. (D) מפת חום של אזור תא שבה נבחר סף קטן יותר של גודל תא עליון ונקבעו מגבלות ידניות כדי לשמור על טווח מפת החום ששימש במקור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: פרמטרים של REShAPE. הטבלה מדווחת על ההגדרה של כל פרמטר ועל הקיצורים המשמשים בגיליונות האלקטרוניים הגולמיים (קבצי "_Data.csv") ובמפות החום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

שיטה זו מסייעת להבין הבדלים פנוטיפיים של תאי RP על פני הרשתית האנושית כולה. טכניקת הדיסקציה שפיתח דייוויד אורטולן ניתנת לשחזור ביצירת ניתוק בין RP לרשתית. ותוכנת REShAPE ממש ניכרת בניתוח תמונות גדולות של תושבות שטוחות RP.השיטה ש- Davide פיתחה יכולה לשמש לחקר הבדלים אזוריים בפנוטיפ RP מחולים עם סוגים שונים של מחלות ניווניות ברשתית. כדי להתחיל, לחתוך את 50 מיליליטר צינור חרוטי מעט מתחת לסימן 5 מיליליטר. באמצעות דבק חם, חברו את קצה הצינור לתחתית סירת השקילה.לאחר מכן ערבבו את שני המרכיבים של ערכת האלסטומר מסיליקון ביחס של 10 ל-1 תוך הימנעות מלכידת אוויר. יוצקים את התערובת לתוך סירת השקילה המכילה את החתיכה הכדורית הזו של הצינור התחתון העגול. לרפא את הסיליקון בטמפרטורת החדר במשך הלילה.הסר את סירת השקילה ואת הצינור התחתון העגול מתבנית הסיליקון שנרפאה. ראשית, מלא מזרק של 1 מיליליטר עם 1700 מילימולים של תמיסת D-מניטול והצמד אותו למחט של 21 מדים. הכנס את המחט דרך pars plana כדי למנוע ניקוב החדר הקדמי של העין ולהזריק 400 microliters של התמיסה לתוך הזגוגית.השאירו את העין בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. באמצעות זוג מספריים עדינים ומלקחיים, חותכים לפתוח את החדר הקדמי ברמה של pars plana. מלאו את תא העיניים האחורי ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום.תחת מיקרוסקופ הסטריאו, מקם את המקולה המתוארת ככתם צהוב על הרשתית. חותכים את העין לרבעים, כלומר האף, הזמני, העליון והנחות, תוך הקפדה על שימור האזור המקולרי. הסר את המחטים אם הן מפריעות.מעבירים את הפרפר לחדר האחורי של העין לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה DPBS עם סידן ומגנזיום. לפני הסרת הרשתית, סמן את עלי הכותרת המכילים את המקולה על ידי ביצוע חתך בצורת V בשוליים הציליאריים. מרימים וחותכים את כל הזגוגית שמונחת על הרשתית.חותכים את הרשתית מהשוליים הציליאריים בכל עלי הכותרת ומבטיחים לא לגרד את ה-RPE. מניחים את הרקמה ב-4% PFA ודוגרים במשך שעה. יש לשטוף שלוש פעמים עם DPBS המכיל סידן ומגנזיום.מעבירים את הרקמה למיכל מלא באותו חיץ ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להעביר את הדגימה לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה DPBS עם סידן ומגנזיום. אגרוף את ראש עצב הראייה עם אגרוף ביופסיה של 1.5 מילימטר.לאסוף את הרשתית ולאחסן אותו באותו חיץ ב 4 מעלות צלזיוס. כדי להסיר את הסקלרה מכורואיד RPE, הרם בעדינות את שכבת הכורואיד RPE מהפריפריה. ואז עם זוג מספריים קפיץ Vannas, לחתוך את כלי choroidal ורקמת חיבור כי הם בין sclera ו RPE.לאחר הפרדה מוחלטת מן הסקלרה, לאסוף את שכבת הכורואיד RPE. מעבירים את הרקמה למיכל מלא ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום, ומאחסנים אותה ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את כורואיד ה-RPE לבאר אחת של צלחת בעלת שש בארות.יש לחסום את הדגימה ולחדור אליה למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגירה של הדגימה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם phalloidin מצומד עם 647 fluorophore בדילול של 1 עד 250 במאגר permeabilization. יש לשטוף שלוש פעמים ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום.העבר את דגימת הכורואיד RPE לשקופית זכוכית בגודל 50 x 75 מילימטר ושטח אותה. חותכים כל עלה כותרת לשניים כדי להפוך את הדגימה לחמיא יותר. צייר קווי מתאר של ההר השטוח עם עט הידרופובי.כדי להרוות את ה-lipofuscin autofluorescence, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת ה-autofluorescence quencher, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. יש לשטוף היטב ב-DPBS המכיל סידן ומגנזיום. הסר את ה- DPBS והוסף את מדיום ההרכבה.הניחו כיסוי על התושבת השטוחה ואטמו עם לק. פתח את התוכנה. בכרטיסייה ספריות, בחר את תיקיות הקלט והפלט.בספריית הפלט, אפשר לתוכנה לשנות באופן אוטומטי את הנתיב לספריית הקלט או לתהליך. לחלופין, שנה את ספריית הפלט באופן ידני. כדי ליצור מפות חום, בחר הכל מהתפריט הנפתח בכרטיסייה יצירת תמונות צבע.סמן את התיבה לא בתכונה השתמש במגבלות ידניות כדי לאפשר לתוכנה להשתמש בערכי המינימום והמקסימום שזוהו בכל תמונה. סמן את התיבה כן כדי להתאים באופן ידני את טווח הערכים עבור כל מפת חום מטרית של צורה. לאחר מכן לחץ על הלחצן הגדר מגבלות והוסף ערכים בתיבות הטקסט כדי לבחור טווחים עבור הפרמטרים הבודדים.לאחר שינוי ערכי העניין, לחץ על שמור. לחץ על ברירות מחדל נמוכות כדי לאפס את כל המגבלות. כדי לבחור סף גודל תא בגודל תא נמוך יותר, הוסף את גודל התא הקטן ביותר שייכלל בניתוח.בגודל תא עליון, הוסף את גודל התא הגדול ביותר שייכלל. בהמרת פיקסלים ליחידות אמיתיות, בדוק לא כדי להפעיל את הניתוח ביחידות פיקסלים, בדוק כן כדי להפעיל את הניתוח במיקרומטרים. באורך הפיקסלים של סרגל קנה המידה, הזינו את ערך הפיקסלים בתיבת המלל.באורך של מיקרוני סרגל קנה מידה, הזן את המרחק המתאים במיקרומטרים. כדי להתחיל את הניתוח, לחץ על עבור על זה. פרוטוקול זה יוצר תמונה חד-מישורית של תושבת שטוחה שבה מיקום התא מזוהה על-ידי סגמנטציה שנוצרה על-ידי REShAPE של גבולות תא RPE.כמו כן, 30 מדדי צורה, כולל שטח התא של תאי ה-RPE הבודדים, נמדדים עבור כל תא RPE שזוהה כהלכה. ניתן להסיר אריחים שחורים הנובעים משאריות של רשתית או עצמים בהירים אחרים על-ידי בחירה באחת מאפשרויות הסינון הזמינות בתפריט הנפתח של מסנן RT. שימוש בתמונות RBG לניתוח העיצוב מחדש יפיק תמונות בינאריות שחורות לחלוטין.במקרה כזה, המרת תמונות RGB לגודל אפור תפיק תמונות בינאריות מפולחות כהלכה. אם הכתם אינו אופטימלי או אם הדגימה ניזוקה משריטה, ניתן לזהות גושים גדולים של תאים כתא אחד גדול מאוד. במקרה זה, אובייקטים גדולים ניתן להוציא מן הניתוח על ידי שינוי סף גודל התא.כדי להשיג רקמה שטוחה, RP ו choroid צריך להיות מופרדים מן sclera גם אם צעדים אלה יכולים לקחת זמן רב. בעקבות הדור של RP שטוח הר, ניתן להכתים עבור סמני RPE נוספים, כך שתוכל ללמוד אזורים שונים של monolayer RP. בשיטה זו גילינו חמש אוכלוסיות RP שונות הרגישות באופן דיפרנציאלי למחלות ניווניות שונות ברשתית.

efficient-consistent-generation-retinal-pigment-epitheliumchoroid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מספקים שיטה לשחזור עבור monolayers culturing ומחוברות של העובר תאים אנושיים אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) תאים התערוכה מורפולוגיה, פיזיולוגיה, קוטביות, וחלבון וביטוי גנים דפוסים של רקמת יליד מבוגר. עבודה זו הורחבה במודל חיה של מחלות עיניים שונות.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למד שיטת ניתוח להפרדת אפיתל פיגמנט רשתית מרשתית אנושית ליצירת שטחים שטוחים. השיטה מאפשרת ניתוח מורפומטרי מפורט של תאי RPE באמצעות תוכנת REShAPE לחקר מחלות רשתית ניווניות.

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

גלה סרטונים נוספים