טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות
2 באוגוסט 2013
טכניקות להדמית cytoarchitecture רשתית ישירות בסמוך לאלקטרודות בודדות בתוך ממריץ רשתית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשפר את הערכת הבטיחות של תותבות רשתית. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון פניו של עין מוקרעת ומקובעת באופן אופטימלי באמצעות צבעי רקמה, כדי לציין את מיקומו של אלקטרודה מושתלת. בשלב השני, מערך האלקטרודות מוסר ורקמת העין מפורקת לרצועות.
בשלב הבא, הרצועות מיוצבו באגר ולאחר מכן נטמנו בפרפין. בשלב הסופי, האזורים המסומנים שמעניינים את החוקר נחתכים ונאספים על עלויות לצורך צביעה. לבסוף, ניתן להעריך את מצבם הבריאותי של האזורים שהושתלו בסמוך לכל אלקטרודה באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן למזער ארטיפקטים הקשורים לקיבוע והפרדה של שכבות (delamination), בעוד שניתן לעקוב במדויק אחר אזורי רקמה סמוכים לאלקטרודה בדגימות גדולות. ניתן להשתמש בה גם להערכת הבטיחות של שתלים חדשים למחלות עיניים אחרות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו ימצאו אותה מאתגרת, מכיוון שהרשתית נוטה להפרדה של שכבות ונדרשת מיומנות גבוהה בטיפול בדגימות.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה מכיוון שסימון וטיפול ברקמה השבירה הם קשים ללמידה. לפני מחקר זה, לאחר השתלה של מערך אלקטרודות סופראכורואידלי (suprachoroidal), העיניים עובדו באמצעות טכניקה שאינה אופטימלית, כפי שמסומן על ידי הכוכבית. תמונה ראשונה זו מציגה חתך אורתוגונלי מייצג דרך חלל מערך האלקטרודות.
שימו לב שהרשתית מנותקת מרקמת העין החיצונית. דבר זה ניכר במיוחד מתחת לאזור ההשתלה, כפי שמוצג על ידי ראש החץ. שימו לב גם שלא ניתן לקבוע איזה חלק מהרשתית היה סמוך לכל אלקטרודה בודדת של המערך.
בהגדלה גבוהה זו, ניתן לראות מספר ארטיפקטים קבועים הנובעים מהשחרור בשכבות הרשתית כפי שמסומן על ידי ראשי החצים, וכן ניתוק משמעותי משכבת הטורפדו, השכבה המחזירה בעין של חתול. בהגדלה נוספת, ניתן להבחין כי המקטעים החיצוניים של הפוטורספטורים, וכן האפיתל הפיגמנטי, נותרים שלמים, מה שמרמז כי הניתוקים שנצפו קודם לכן הם תוצאה של אפקטים של ארטיפקטים מתהליך העיבוד ולא כתוצאה מטראומה או פתולוגיה in vivo. לפיכך, הטכניקה הבאה יושמה כדי למזער ארטיפקטים אלו הקשורים לקיבוע ולדלמינציה.
לאחר ביצוע גרעין (nucleating) וקיבוע, התחל בהוצאת גלגל עין מושתל מאתנול וגזום בזהירות את עודפי הרקמה, כולל הלחמית וקפסולת הגיד. גזום את העצב האופטי לאורך של שני עד שלושה מילימטרים. מערך האלקטרודות נראה דרך הלובן (sclera) השקוף למחצה.
לאחר מכן, השתמש במכחול בעל קצה דק כדי למרוח בזהירות צבעים היסטולוגיים על הרקמה, במטרה לסמן את האלקטרודות לפי קוד צבעים שהוגדר מראש. יש להקפיד שלא למרוח את הצבע. ניתן להוסיף סימוני צבע נוספים כדי להגדיר נקודות עניין או כדי לסייע ביישור החתכים.
כאן, האלקטרודות שעוררו באופן מקסימלי סומנו בירוק. האלקטרודות הפעילות האחרות סומנו באדום. אלקטרודות החזרה בעלות הקוטר הגדול יותר נצבעו בצהוב, ומדריכים נוספים או סימונים אנטומיים סומנו בצבע כחול.
לאחר חמש דקות של ייבוש באוויר, החזירו את גלגל העין ל-70% ethanol כדי לייבש את הצבע. לאחר מכן, לאחר הסרת עודפי הרקמה מגלגל עין הביקורת שלא הושתלה, כפי שהודגם כעת, השתמשו בשמונה תפרי הניילון ששורשרו במהלך שלב הגרעין והקיבוע כדי ליישר את עיני הביקורת והשתלה כזוג מראה. לאחר מכן, הניחו תבנית סיליקון בעלת ממדים זהים לאלו של מערך האלקטרודות במיקום מראה בעין הביקורת, התואם למיקום המערך בעין המושתלת.
לאחר מכן, סמנו את גלובוס הביקורת כפי שהודגם, כך שלכל אתר אלקטרודה מושתל יהיה זוג ביקורת במיקום בעל דמיון אנטומי. בשלב הבא, הוציאו את מערך ההשתלה מהעין ולאחר מכן הסירו את החלק הקדמי של העין, כולל הקרנית, הקשת והעדשה. לאחר מכן, הסירו את נוזל הזגוגית (vitreous fluid) מכוס העין שנותרה.
כעת יש לבצע דיסקציה של העין המושתלת לפסות רבות בעובי שני מילימטרים. כל פסה צריכה להכיל תת-קבוצה של האזורים המסומנים בתבנית. יש לבחור את כיוון הפסות כך שיסייע בהערכת היבטים שונים של תגובת הרקמה לשתיל; יש לתעד בקפידה את מיקום סימוני התבנית על הדגימות לצורך התייחסות עתידית.
בשלב הבא, הנח את הרצועה כאשר הצד שייחתך ראשון פונה כלפי מטה לתוך שלולית רדודה של אגר מומס. לאחר שהאגר התקשה, חתוך מסביב לדגימה והנח אותה בתוך קסטה לרקמות הנתמכת על ידי רכיבי ספוג. לאחר דיסקציה וטמיעה של עין הביקורת, הנח את הקסטות בפורמין ניטרלי מתוחמצן (neutral buffered formin) ועבד אותן במהלך הלילה באמצעות טכניקת עיבוד פראפין אוטומטית סטנדרטית של 12 שעות.
ביום למחרת, טמנו את הרקמה המעובדת בפראפין, כאשר הצד שייחתך ראשון פונה כלפי מטה. כעת, חתכו את בלוקי הפראפין לחתכים בעובי של five micron. לאחר מכן, העבירו את החתכים מכל אחד מהאזורים הצבועים לעל slides.
על מנת לאתר את אזור ה-DY, יש לבדוק את הנסכיות באופן קבוע תחת מיקרוסקופ. האזורים הסמוכים באופן מיידי לכל נקודה צבועה של הלובן (sclera) יהיו אלו שהיו בקרבה המקסימלית לאלקטרודה התואמת מהמערך. לבסוף, יש לצבוע את החתכים לפי הרצון.
טווח דינמי גבוה. מוצגות תמונות מאקרו של עין של חתול שהוצאה מהמקום (enucleated) עם מערך אלקטרודות סופראכורואידלי (suprachoroidal electrode array) במקומו, לאחר קיבוע באמצעות מקבע דייווידסון (davidson's fixative) ולפני הסרת המערך. הלובנה (sclera) השקופה מאפשרת ויזואליזציה של האלקטרודות הבודדות במערך.
כפי שמתואר באמצעות ראש החץ, האלקטרודות מסומנות באמצעות סכמת צבעים מוגדרת מראש של צבעים. סימונים אלו, הממוקמים במרווחים קבועים מנקודות ציון אנטומיות, משמשים לשמירה על עקביות בין הניסויים. לאחר הסרת מערך האלקטרודות, העין מנותחת ידנית לרצועות דגימה.
ראשי החצים מצביעים על שניים מהאתרים הסמוכים לאלקטרודה על הסקלרה. הקו המקווק מציין את מישור החיתוך בחתך מייצג זה, שהתקבל מחיתוך הדגימה מהאיור הקודם; הצורה הכללית של רצועת הדגימה נשמרה עם מינימום ארטיפקטים של רקמה דיפרנציאלית. שני סימוני הצבע עדיין נראים על הסקלרה, כפי שמוצג על ידי ראשי החצים.
למרות שהצבע הירוק היה עמיד יותר מהאדום, מיקומו של הצבע מצביע על מיקום האלקטרודה. לפיכך, ניתן להעריך את נזקי הרקמה הרטינלית הסמוכה, אם נגרמו כאלה, כתוצאה מהגירוי החשמלי; כפי שנראה בהגדלה זו, השכבות הרטינליות הסמוכות לצבע הירוק שנראה בתמונה הקודמת לא היו מופרדות בפועל, והמורפולוגיה הרטינלית נשמרה כאן. בתמונה ראשונה זו מוצגים צביעות מיוחדות ואימונוהיסטוכימיה מייצגות של חתכי רקמה רטינלית שעובדו על פי הפרוטוקול הנוכחי.
ההמטין צבע את גרעיני התאים בכחול בעוד שהאאוזין צבעה את ציטופלזמת התאים, את הקולגן ואת רקמת התמיכה בגוונים שונים של ורוד. בתמונה זו, ה-luxal fast blue צבע את המיאלין בכחול. צביעת הנגד של ה-crestal violet שימשה לזיהוי תאי הגנגליון על ידי צביעת גופי ה-missile בכחול ובאתר ה-peric, ועל ידי הדגשת תאי הלוויין המקיפים אותם. בחתך זה שעובד ב-mason's trione blue, תמיסת ה-BRIC Scarlet acid fusion צבעה את סיבי השריר באדום בעוד שה-lin blue צבע את הקולגן.
במקרה זה, הלחמית הכחולה בחלק זה נצבעה ב-periodic acid shiff, כאשר רכיבי הגליקופרוטאין של קרומי הבסיס ומרכיבי הרקמה החיבורית מופיעים בצבע סגול, בעוד שגרעיני התאים שנצבעו בצביעת נגד של hemat toin מופיעים בצבע כחול. החיתוך התת-סקלרלי המוצג בתמונה זו טופל ב-pearl's Prussian blue באתר הדימום. היווצרות של hemosiderin מתאי דם אדומים מפורקים ושחרור של קומפלקסים של ברזל יצרו צבע סגול.
הוספת Red neutral צבעה את הליזוזומים באדום בתמונה זו, ובוצעו צביעות ל-glutamine Synthes. אנזים זה, המפרק מוליכים עצביים ונמצא בתאי Mueller, צבע בירוק ומתפשט לשני הכיוונים, עם גופי תאי ה-Mueller בשכבה הגרעינית הפנימית וקצות תאי ה-Mueller היוצרים את הקרום המגביל הפנימי, לצביעה של חלבון ה-neurofilament. חלבון ציטושלטי זה, בעל שרשרת כבדה, סומן בירוק ונמצא בגוף התא ובבלתיות; חלבון ה-neurofilament יוצר קשרי צלב עם neurofilaments אחרים כדי לשמור על מבנה הנוירונים.
ניתן להבחין בתאי הגנגליון ובאקסונים שלהם בשכבת תאי הגנגליון ובשכבת סיבי העצב, בעוד שהאקסונים של התאים האופקיים הממוקמים בגבול החיצוני של השכבה הגרעינית הפנימית ברשתית החתול מופיעים בירוק. בתמונה סופית זו, מוצג חלבון חומצה גליאלית פיברילית (glial fibrillary acidic protein) – חלבון שלד זה מופיע באדום, הוא שגשוג בתאי מילר ובאסטרוציטים במהלך גליוזיס, וניתן לראות אותו מצפה את שכבת סיבי העצב כאשר תאי מילר יוצרים שלוחות דקות מהשכבות הפנימיות אל השכבות החיצוניות של הרשתית. צביעה נגדית עם DPI בכחול מאפשרת ויזואליזציה של שכבות הרשתית.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לדמיין את זרימת העבודה של הדגימה בתלת-ממד ולהתחשב באופן קבוע באוריינטציה של הדגימות לאורך התהליך. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בכל השיטות ההיסטולוגיות על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לבטיחות לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בפיתוח עיניים ביוניות להעריך רמות גירוי בטוחות לטווח ארוך עבור מטופלים עיוורים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את הבטיחות של שתל עין ביונית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקות להדמיה של הארכיטקטורה התאית של הרשתית בסמיכות לאלקטרודות במעבדי גירוי רשתיים. השיטה שואפת לשפר את הערכת הבטיחות של פרוטזות רשתיות על ידי מזעור ארטיפקטים הקשורים לקיבוע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- רפואת עיניים
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- פרוטזות רשתית משמשות להחזרת הראייה בחולים עם מחלות ניווניות של הרשתית.
- הערכת הבטיחות והיעילות של מכשירים אלו היא קריטית עבור יישומים קליניים.
- טכניקות קודמות הובילו להיווצרות ארטיפקטים שהקשו על הערכת בריאות הרקמה.
- יש צורך בשיטות משופרות למעקב מדויק אחר רקמות סמוכות לאלקטרודות.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה הממזערת ארטיפקטים הקשורים לקיבוע ברקמת הרשתית.
- מתן אפשרות להערכה מדויקת של בריאות הרקמה הסמוכה לאלקטרודות מושתלות.
- אספקת שיטה מהימנה להערכת שתלים חדשים למגוון מחלות עיניים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- סימון פני השטח של עיניים מקובעות ללא גרעין באמצעות צבעי רקמה.
- חיתוך רקמת העין לרצועות לצורך ייצוב וטמיעה.
- שימוש במיקרוסקופיה בשדה בהיר ובאימונופלואורסנציה לצורך הערכה.
- תיעוד סימוני הצבע למעקב מדויק אחר רקמה סמוכה לאלקטרודה.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה צמצמה בהצלחה את ההפרדות (delamination) וארטיפקטים של קיבוע.
- בריאות הרקמה הסמוכה לאלקטרודות הוערכה ביעילות.
- הדגמה חזותית של השיטה הקלה את הלמידה עבור משתמשים חדשים.
- סימון עקבי בצבע אפשר השוואות אנטומיות מהימנות.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה משפרת את הערכת הבטיחות של תותבות רשתית.
- היא מספקת מסגרת להערכה של שתלים עיניים אחרים.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על שיטה זו כדי לשפר את תכנון תותבות הרשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
טכניקה זו נותנת מענה לפער קריטי בהערכת בטיחות פרה-קלינית של תותבות רשתית, על ידי מתיתה מיקום מדויק של תגובת הרקמה בסמוך לאלקטרודות בודדות. על ידי מזעור ארטיפקטים של קיבוע ואספקת רזולוציה מרחבית של האינטראקציות בין השתל לרקמה, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של טיפולים בנוירוסטימולציה. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי גילוי מוקדמים, שבהם הבנת תגובות ביולוגיות מקומיות חיונית לקבלת החלטות של go/no-go בתוכניות לפיתוח עיניים ביוניות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות קישור של גרייה ספציפית לאלקטרודה לשינויים מקומיים בארכיטקטורת התאים של הרשתית.
- ערך תפעולי: מספק מערכת סימון בצבע למעקב מרחבי אחר רקמה סמוכה לשתל, ובכך מפחית עמימות בפירוש היסטופתולוגי.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות על ידי הבחנה בין השפעות מושראות מהשתל לבין ארטיפקטים של עיבוד, באמצעות השוואות עם קבוצות ביקורת תואמות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר רצועות רקמה מיוצבות המתאימות לחיתוך ולצביעה, ובכך יוצר דגימות הניתנות לשחזור לצורך אנליזה היסטולוגית בהמשך התהליך.
- פלט כמותי: מאפשר קריאות במיקרוסקופיה בשדה בהיר ובפלואורסצנציה אימונולוגית, המאפשרות הערכה אובייקטיבית של שלמות שכבות הרשתית הסמוכות לאלקטרודות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תכונת השקיפות של הלובן (sclera) מאפשרת מיקום עקבי של האלקטרודות לאורך ניסויים שונים, ותומכת בסריקת בטיחות ניתנת להרחבה של עיצובי שתלים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למודלים פרה-קליניים של ניוון רשתית שבהם יש להעריך את בטיחות השתל לפני מעבר ליישום קליני.
- המשכיות תרגומית: שימוש בעיני ביקורת תואמות להגברת העוצמה הסטטיסטית, בהתאם לתקני תיקוף פרה-קליניים מחמירים עבור התקני נוירופרוטזה.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר זיהוי של נזקים מקומיים (למשל, דלמינציה, שיבוש בשכבות) המשמשים לקביעת ספי בטיחות לגירוי ארוך טווח עבור מטופלים עיוורים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת דגימות המוכנות לבדיקה היסטופתולוגית לאחר השתלת האלקטרודות, ובכך היא מגשרת בין ההתערבות הכירורגית לבין הניתוח המולקולרי בפיתוח טכנולוגיות עצביות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של אינטראקציות בין אלקטרודה לרקמה באמצעות דגימת רקמה בעלת רזולוציה מרחבית ועיבוד הממזער ארטיפקטים.
- סריקה: מייצר פסים טבולים בפראפין עם אזורים מסומנים בצבע, המאפשרים חיתוך וצביעה סטנדרטיים להערכת רקמה ברמת דיוק גבוהה.
- אנליטיקה: מייצר פלטי של brightfield ואימונופלואורסצנציה המאפשרים ניתוח השוואתי של הציטוארכיטקטורה הרטינלית בין אזורים מושתלים לאזורי ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הערכת בטיחות השתל לתקפות פרה-קלינית על ידי שימור המורפולוגיה הרטינלית בסמיכות לאתרי הגירוי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה היסטופתולוגי בר-שימוש חוזר להערכה איטרטיבית של עיצובי תותבות רטינה במספר מחקרים פרה-קליניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי בטיחות של שתלים על ידי מזעור ארטיפקטים הקשורים לקיבוע ומאפשר מיקום מדויק של רקמות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הרקמות באמצעות קידוד בצבעים, ייצוב באגר ועיבוד פראפין אוטומטי, ובכך משפר את השחזוריות בין משתמשים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים מהימנים על תגובות רשתית מקומיות לגירוי חשמלי, ובכך מפחית סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לשתלה באמצעות הערכה היסטופתולוגית מתוקפת של בריאות הרקמה הסמוכה לאלקטרודה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות היסטולוגית ביישום צבעי רקמה וטיפול עדין בעיניים שהוצאו מהמחלול כדי למנוע היפרדות של הרשתית.
- תלוי בציוד עבור טמיעה בפראפין, חיתוך בעובי של five microns, ומיקרוסקופיה של שדה בהיר/אימונופלואורסנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של קודי צבע לצבעים ותיעוד של כיוון הפסים למעקב אנטומי עקבי.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה במינים שונים או בגיאומטריות שתלים שונות מעבר למודל הפליני הסופראכורואידלי.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך במיומנות ידנית בדיסקציה של רקמות ואת האופי גוזל הזמן של עיבוד מקבילי של ביקורת ושתל.
