טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את הערכת בטיחות תותבת הרשתית. זה מושג על ידי תיוג ראשון של פני השטח של עין גרעינית קבועה בצורה אופטימלית עם צבעי רקמה כדי לציין את המיקום של אלקטרודה מושתלת. בשלב השני מסירים את מערך האלקטרודות ומנתחים את רקמת העין לרצועות.

לאחר מכן, הרצועות מיוצבות באגר ולאחר מכן מוטמעות בפרפין. בשלב האחרון, אזורי העניין המסומנים נחתכים ונאספים על שקופיות לצביעה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את בריאות האזורים המושתלים הסמוכים לכל אלקטרודה על ידי מיקרוסקופיה של שדה בהיר ואימונופלואורסצנטי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למזער חפצים הקשורים לקיבוע ודלמינציה בעוד שניתן לעקוב במדויק אחר אזורי רקמה סמוכים לאלקטרודה בדגימות גדולות. זה יכול לשמש גם להערכת הבטיחות של שתלים חדשים למחלות עיניים אחרות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ימצאו אותה מאתגרת מכיוון שרשתית נוטה לדלמינציה ונדרשת רמה גבוהה של מיומנות לטיפול בדגימות.

הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שקשה ללמוד סימון וטיפול ברקמה השברירית. לפני מחקר זה, לאחר השתלה עם מערך אלקטרודות סופרכורואידי, העיניים עובדו בעבר בטכניקה לא אופטימלית כפי שצוין על ידי הכוכב. תמונה ראשונה זו מציגה חתך אורתוגונלי מייצג דרך חלל מערך האלקטרודות.

שימו לב שהרשתית מנותקת מרקמת העין החיצונית. זה בולט במיוחד מתחת לאזור המושתל כפי שמצוין על ידי ראש החץ. שימו לב גם שלא ניתן לקבוע איזה חלק של הרשתית היה צמוד לכל אלקטרודה בודדת של המערך.

בהגדלה גבוהה יותר, ישנם מספר חפצים מבוססי שחרור רגיל בשכבות הרשתית כפי שמצוין על ידי ראשי החץ, כמו גם ניתוק משמעותי משכבת הטורפדו, השכבה הרפלקטיבית בעין החתולית. בהגדלה נוספת, ניתן לראות כי המקטעים החיצוניים של קולטני האור, כמו גם האפיתל הפיגמנטי נשארים שלמים, מה שמרמז על ניתוקים שנצפו בעבר או תופעות לוואי מלאכותיות של העיבוד בניגוד לתוצאה של טראומה או פתולוגיה in vivo. לפיכך, הטכניקה הבאה יושמה כדי למזער את החפצים הקשורים לקיבוע ולדלמינציה.

לאחר גרעין וקיבוע העיניים התחל בהסרת כדור עין מושתל מאתנול וקיצוץ זהיר של עודפי הרקמה, כולל הלחמית והקפסולת של הגיד. חתוך את עצב הראייה לאורך של שניים עד שלושה מילימטרים. מערך האלקטרודות נראה דרך הסקלרה השקופה למחצה.

לאחר מכן השתמש במברשת צבע עדינה כדי למרוח בזהירות צבעים היסטולוגיים על הרקמה כדי לתייג את האלקטרודות בקוד צבע מוגדר מראש. הקפדה לא להכתים את הצבע. ניתן לבצע סימון צבע נוסף כדי להגדיר נקודות עניין או לעזור ליישר חלקים.

כאן, האלקטרודות המעוררות באופן מקסימלי סומנו בירוק. האלקטרודות הפעילות האחרות סומנו באדום. אלקטרודות ההחזרה בקוטר הגדול יותר נצבעו בצהוב, וכל מדריכים נוספים או סימנים אנטומיים סומנו בצבע כחול.

לאחר חמש דקות של ייבוש באוויר, החזירו את הגלובוס לאתנול 70% כדי לייבש את הצבע. לאחר מכן, לאחר חיתוך הרקמה העודפת מכדור עין הבקרה הלא שתולה כפי שהודגם זה עתה, השתמש בשמונת תפרי הניילון המחוברים במהלך שלב הגרעין והקיבוע כדי ליישר את העיניים המושתלות והביקורת כזוג מראה. לאחר מכן הנח תבנית סיליקון עם אותם מידות כמו מערך האלקטרודות על מיקום מראה בבקרה I המתאים למיקום המערך בעין המושתלת.

לאחר מכן סמן את גלובוס הבקרה כפי שהודגם זה עתה כך שלכל אתר אלקטרודה מושתלת יש זוג בקרה במיקום דומה מבחינה אנטומית. לאחר מכן, הסר את מערך השתלים מהעין ולאחר מכן הסר את החלק הקדמי של העין, כולל הקרנית, הקשתית והעדשה. לאחר מכן, יש להסיר את נוזל הזגוגית מכוס העיניים שנותרה.

כעת נתח את העין המושתלת לרצועות מרובות בעובי של שני מילימטרים. כל אחד מהם מכיל תת-קבוצה של האזורים המסומנים בקוביות. יש לבחור את כיוון הרצועות כדי לסייע בהערכת היבטים שונים של תגובת הרקמה לשתל, לתעד בקפידה את מיקום סימני התבנית על הדגימות לעיון עתידי.

לאחר מכן, הניחו את הרצועה כשהצד שיש לחתוך תחילה פונה כלפי מטה לתוך בריכה רדודה של אגר נוזלי. לאחר שהאגר התייצב, חותכים סביב הדגימה ומניחים אותה בקלטת טישו הנתמכת על ידי תוספות קצף. לאחר ניתוח והטמעת עין הביקורת, הניחו את הקלטות בפורמין ניטרלי ועבדו אותן למשך הלילה באמצעות טכניקת עיבוד פרפין אוטומטית סטנדרטית של 12 שעות.

למחרת, הטמיעו את הרקמה המעובדת בפרפין כשהצד ייחתך תחילה כלפי מטה. כעת, חותכים את גושי הפרפין לחמישה חלקי מיקרון. לאחר מכן הרכיבו את החלקים מכל אחד מהאזורים הצבועים על שקופיות.

על מנת לאתר את אזור ה-DY בדוק באופן קבוע את השקופיות תחת מיקרוסקופ. האזורים הסמוכים מיד לכל נקודה צבועה של הסקלרה יהיו אלה שהיו בסמיכות הקרובה ביותר לאלקטרודה המתאימה מהמערך. לבסוף, הכתים את החלקים כרצונך.

טווח דינמי גבוה. צילומי מאקרו של עין חתולית גרעינית עם מערך אלקטרודות סופרכורואידלי באתרם מוצגים לאחר קיבוע עם הקיבוע של דוידסון ולפני הסרת המערך. הסקלרה השקופה מאפשרת הדמיה של האלקטרודות הבודדות במערך.

כפי שמצוין עם ראש החץ, האלקטרודות מסומנות בערכת צבעי צבע מוגדרת מראש. סימוני צבע אלה הממוקמים עם מרווח קבוע מציוני דרך אנטומיים משמשים לשמירה על עקביות לאורך ניסויים. עם הסרת מערך האלקטרודות, העין מנותחת ביד לרצועות דגימה.

ראשי החצים מציינים שניים מהאתרים הסמוכים לאלקטרודה על הסקלרה. הקו המקווקו מציין את מישור החיתוך בקטע מייצג זה שהתקבל מחיתוך הדגימה מהאיור הקודם, הצורה הגסה של רצועת הדגימה נשמרה עם חפצי רקמה דיפרנציאלית מינימליים. שני סימני הצבע עדיין נראים על הסקלרה כפי שמצוין על ידי ראשי החצים.

למרות שהצבע הירוק היה גמיש יותר מהאדום, מיקום הצבע מציין את מיקום האלקטרודה. לכן, ניתן להעריך את הנזק, אם בכלל, שנגרם על ידי גירוי חשמלי כפי שניתן לראות בהגדלה זו, שכבות הרשתית הסמוכות לצבע הירוק שנראה בתמונה הקודמת לא נותקו עובדתית, ומורפולוגיה של הרשתית נשמרה כאן. צביעה מיוחדת מייצגת ואימונוהיסטוכימיה של קטעי רקמת רשתית המעובדים על פי הפרוטוקול הנוכחי מוצגים בתמונה ראשונה זו.

המטין צבע את גרעיני התא בכחול ואילו ה-eoin צבע את הציטופלזמה של התא, הקולגן והרקמה התומכת, גוונים שונים של ורוד בתמונה זו, הכחול המהיר הלוקסאלי הכתים את המיאלין בכחול. הכתם הנגדי הסגול שימש לזיהוי תאי הגנגליון על ידי צביעת גופי הטילים בתוך הכחול הפריק ועל ידי הדגשת תאי הלוויין שמסביב. בחלק המטופל בטריון כחול של בנאי זה, תמיסת היתוך חומצה ארגמן של BRIC צבעה את סיבי השריר באדום ואילו הכחול הכחול הכתים את הקולגן.

במקרה זה, הסקלרה הכחולה עבור קטע זה המוכתמת על ידי חומצה תקופתית מרכיבי הגליקופרוטאין של קרום הבסיס ורכיבי רקמת החיבור נראים סגולים בעוד שגרעיני התאים הנגדיים של hemat toin נראים כחולים. החלק התת-סקלרלי המוצג בתמונה זו טופל בכחול פרוסי של פנינה באתר הדימום. היווצרות המוסידרין מתאי דם אדומים מושפלים ושחרור קומפלקסים של ברזל יצרו צבע סגול.

התוספת של אדום ניטרלי הכתימה את הליזוזומים באדום בתמונה זו, אנטי גלוטמין סינתזה היה מוכתם. אנזים משפיל נוירוטרנסמיטר זה שנמצא בתאי מולר בירוק משתרע לשני הכיוונים כאשר גופי תאי מולר בתוך השכבה הגרעינית הפנימית והזנת קצה תאי מולר יוצרים את הממברנה המגבילה הפנימית לצביעה של חלבון הנוירופילמנט. חלבון שלד ציטו-שרשרת כבד זה סומן כירוק שנמצא בסומה התאית ומעבד את חלבון הנוירופילמנט עם נוירופילמנטים אחרים כדי לשמור על מבנה הנוירונים.

ניתן לראות תאי גנגליון והאקסונים שלהם בשכבות תאי הגנגליון וסיבי העצב ואילו האקסונים של התאים האופקיים הממוקמים בגבול החיצוני של השכבה הגרעינית הפנימית ברשתית החתולית נראים ירוקים. בתמונה סופית זו, חלבון חומצי סיבי גליה מוצג חלבון שלד ציטולוגי זה באדום, מתרבה בתאי מולר ובאסטרוציטים במהלך גליוזיס וניתן לראות אותו מצפה את שכבת סיבי העצב בתאי מולר היוצרים שלוחות דקות דרך שכבות הרשתית הפנימיות לחיצוניות. צביעה נגדית עם DPI בכחול מאפשרת הדמיה של שכבות הרשתית.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לדמיין זרימת עבודה לדוגמה בתלת מימד ולשקול באופן קבוע את כיוון הדגימות לאורך ההליך. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בכל השיטות ההיסטולוגיות על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לבטיחות לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בהתפתחות עיניים ביוניות להעריך את רמות הגירוי הבטוחות לטווח ארוך עבור חולים עיוורים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את הבטיחות של שתל עין ביוני