במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע בדיקת הידבקות של תא זרימת צלחת מקבילה באמצעות מערכת פיצול פליטת מצלמה כפולה כדי להקליט בו זמנית רצפי תמונות בזמן אמת בשני צבעים. לשם כך, שתי המצלמות במערך ההדמיה מיושרות תחילה. לאחר מכן, מכינים את התאים והמצע התגובתי ומגדירים את תא זרימת הצלחת המקביל.

לאחר מכן הגדרות המצלמה מכוילות לרכישת תמונות בשני צבעים וכל התיקונים הדיגיטליים הדרושים מתבצעים ליישור המצלמה. לאחר מכן נלכדים רצפי תמונות, המדגימים רכישה של תמונות בצבע כפול ברזולוציה זמנית גבוהה. היתרון של מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה על פני מערכות מצלמה בודדות הוא שניתן להקצות זמני חשיפה שונים לכל מצלמה ושדה הראייה המלא נשמר.

טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הידבקות התאים, כגון כיצד לוקליזציה של מולקולות הידבקות על פני התאים עשויה להשפיע על תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון נדידת תאים, דלקת וגרורות סרטניות. ההליך הבא דורש מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי הפוך. זה צריך להיות מצויד במקור אור בעוצמה גבוהה יחד עם מוביל אור, קוביית פילטר משולבת ומערכת מצלמות לפיצול פליטת מצלמה כפולה.

יש לחבר את מערך המיקרוסקופ למחשב המפעיל תוכנת הדמיה המסוגלת לאסוף ולשלב תמונות שצולמו על ידי מצלמות CCD מונוכרום. כאן, נעשה שימוש בחמש תוכנות מרובות מצלמות עם מודול בחירת הסימול. התחל על-ידי פתיחת בחירת זרם חמש ברצועת הכלים של המשימה, בחר סביבת עבודה.

לאחר מכן, בקצה השמאלי של המסך, פתח את מנהל סביבת העבודה ובחר סביבת עבודה חדשה. לאחר מתן שם למצלמה, עקוב אחר הנחיות התוכנה כדי לבחור מתוך רשימה מאוכלסת מראש, דגם מצלמה תואם תופסת, סמל מצלמה קטן יופיע בסביבת העבודה כדי לציין שהזנת המצלמה התקבלה. כעת ניתן לצפות באובייקטים שצולמו במיקרוסקופ על המסך.

חזור על תהליך זה עבור סביבת העבודה השנייה של המצלמה, ולאחר מכן עבור סביבת העבודה הממוזגת, חזור על כך פעם נוספת וכל המצלמות נמצאות בשימוש. תופיע הודעת שגיאה. הודעה זו היא מצלמות רגילות שהוקצו מסביבת העבודה הראשונה והשנייה לסביבת העבודה הממוזגת בלוח העגינה הממוקם בצד ימין של מסך הצפייה.

התמונות בסביבת העבודה הראשונה והשנייה יוצבו בסביבת העבודה הממוזגת כשתי תמונות פסאודו-צבעוניות. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא יישור המצלמה. כדי להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בשקופית היצרן תוך הקפדה על הוראות היצרן.

כדי ליישר את המצלמות במערכת פיצול פליטת המצלמה הכפולה, שלח אור שדה בהיר או ניגודיות פאזה לעינית המיקרוסקופ. הנח את רשת הכיול המצופה מתכתית שסופקה על ידי היצרן על שלב המיקרוסקופ ורבע את הרשת על שלב המיקרוסקופ. הצג את הרשת ללא binning וללא קנה מידה אוטומטי והביא אותה למיקוד ואז העקר, אך אל תסיר את המארז הדיכרואי כדי ליישר את המצלמה הראשונה.

לאחר מכן באמצעות חוגת כוונון המיקוד ביציאת הר הים הראשונה, מקד את התמונה שוב. לאחר מכן, דחף את המארז הדיכרואי לתוך התקן הרכישה הדו-ערוצי, כך שהתמונה תפוצל על ידי הדיכרואיקון לשתי המצלמות. שחרר את ברגי הסט 3 5 60 אינץ' רביעי וסובב את המצלמה השנייה ביציאת תושבת CM נקבה שתיים עד שכיוון הרשת זהה בשתי התמונות באמצעות חוגת כוונון המיקוד ביציאת C mount שתיים, הבא את התמונה מהמצלמה השנייה למיקוד.

כדי לסיים את היישור, השתמש בכפתור RL בצד ימין של DC 2 כדי לכוונן את מיקומי התמונה המשולבים עד להרמה הנכונה. הגבול האנכי של התמונות מיושר במדויק בסביבת העבודה הממוזגת. לאחר מכן השתמש בכפתור UD כדי לכוונן את היישור למעלה למטה של התמונה השנייה עד שפסי הרשת האופקיים מיושרים כהלכה.

אם במהלך היישור למעלה למטה מתרחש סיבוב קל של המצלמה, תקן בעיה זו על ידי שחרור הברגים 3 5 60 אינץ' רביעי עבור מצלמה 2 וסיבוב עד שהתמונה המוצגת מיושרת כהלכה. הכן תאי סרטן שד BET 20 לבדיקת הידבקות תא זרימת צלחת מקבילה על ידי צביעתם באנטי CD 24 ו- TECA 4 5 2 באמצעות LOR 5 68 ו- 4 88 משניים כמתואר במסמך הנלווה, הקפד להכין את בקרות הצבע הבודד המתאימות לאחר צביעת תאי חלוקה למאגר של תא זרימת הצלחת המקביל. חבר שני אורכים נפרדים של צינורות ליציאות הכניסה והיציאה של תא הזרימה.

צינור אחד יתחבר למאגר המכיל את התאים המסומנים התלויים ב-DPBS פלוס המכיל 0.1% PSA. חבר את הצינור השני למשאבת המזרק, שתמשוך נוזלים בקצב זרימה מוגדר. חבר קו ואקום לתא הזרימה ומקם את תא הזרימה מעל צלחת תרבית רקמה בגודל 35 מילימטר המכילה שכבה אחת של תאי שחלה של אוגר סיני המבטאים לקטין או תאי cho

כוונן את תא הזרימה ואת אטם תא הזרימה כדי להבטיח איטום ואקום נאות. משוך נוזלים מהמאגר תוך ניטור מכלול תא הזרימה לאיטום תקין. לבסוף, הנח את מכלול תא הזרימה על כוח המיקרוסקופ על מקור האור והגדרת המיקרוסקופ על ידי בדיקה ידנית.

ודא שהמארז הדיכרואי נמצא במצב הפעלה מדוכא נכון ואינו במצב מעקף. עבור ידנית למצב פלואורסצנטי ובחר את קוביית מסנן הקרינה האדומה הירוקה כדי לקבוע את זמן החשיפה ולהרוויח בנפרד. דמיינו את התאים באמצעות פלואורסצנטיות אדומה במצלמה 1 ופלואורסצנטיות ירוקה במצלמה 2.

לחץ ידנית על הדיכרואיקון לפי הצורך כדי להשיג את התמונות. לאחר מכן הפקידו תרחיף של תאי BT 20 מוכתמים בפלורה אדומה בלבד. ארבעה נוגדנים מצומדים במאגר המחוברים ליציאת הכניסה של תא זרימת הלוח המקביל.

השתמש במשאבת המזרק כדי להחדיר תאי BT 20 מעל שכבת הצ'וי בתא זרימת הצלחת המקביל. בהגדרות החיות של תוכנת ההדמיה, התאם את זמן החשיפה של המצלמה הראשונה כדי לקבל תמונה בערוץ האדום. התאם את זמן החשיפה של מצלמה שתיים לזמן החשיפה של מצלמה ראשונה.

אם נצפית תמונה בערוץ הירוק, יש גלישה דרך חפצים. אם זה קורה, שמור על זמן החשיפה שווה ערך במצלמה הראשונה ובמצלמה השנייה וצמצם את זמן החשיפה עד שהחפץ לא נראה עוד בערוץ הירוק. התאם את הרווח של המצלמה הראשונה כדי לשפר את נראות התמונה בערוץ האדום במידת הצורך.

לאחר מכן, הסר את כל מתלה תאי BT 20 שנותר מהמאגר והחלף את המתלה ב-DPBS. השתמש במשאבת המזרק כדי להחדיר את התמיסה מעל חד-שכבת הצ'וי עד שתאי BT 20 כבר לא נראים על החד-שכבה. מלאו מחדש את המאגר בתרחיף של תאי BT 20 המוכתמים בנוגדנים מצומדים פלואורו ארבעה ירוקים בלבד.

חזור על תהליך כיול המצלמה באמצעות פקדי הצבע היחיד הירוק. הפעם הגדר את זמן החשיפה עם מצלמה שתיים כדי לצלם תאים בערוץ הירוק מבלי לדמם דרך חפצים בערוץ האדום שנאסף על ידי מצלמה אחת. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי להציג בו-זמנית תמונות שצולמו משתי מצלמות CCD מונוכרום בתא הזרימה. ניסוי.

מזג את התמונות שנאספו משתי המצלמות באמצעות מודול תמונות הסימול של בחירת הזרם. השתמש בהתאמות תיקון דיגיטלי בתמונה מדומה או בתוכנה חלופית כדי ליישר את התמונות הממוזגות מרחבית. במידת הצורך, ניתן לתקן תמונות באמצעות מודול PIC סימול להתאמות אופקיות, אנכיות וסיבוביות.

המערכת מוכנה כעת לשימוש לצילום שתי תמונות צבעוניות בו זמנית. נעשה שימוש בבדיקת הידבקות של תא זרימת צלחת מקבילה כדי להדגים את מערכת פיצול פליטת המצלמה הכפולה המתוארת בסרטון זה. כפי שמוצג כאן, המערכת זיהתה תאי BT 20 שסומנו באופן פלואורסצנטי עם CD 24 אנטי-אנושי המוצג באדום ו-HECA 4 52, שנקשר למולקולות הקשורות ל-SCOs המוצגות בירוק.

חלק מהתאים המתגלגלים הראו אותות אדומים אך לא ירוקים. אחרים הראו אותות ירוקים אך לא אותות אדומים, ותאים אחרים הראו אותות אדומים וירוקים כאחד. הנה. המצלמות שמרו על הרזולוציה האופטית והזמנית כדי לעקוב אחר תכונות התא על תא נופל ומעל הקצה כשהוא מתגלגל על המצע הריאקטיבי בכיוון הזרימה, תעלות פליטה ממוזגות חשפו את ההתפלגות והקולוקליזציה של CD 24 ומולקולות רוויות על פני תאי BT 20 המתגלגלים ונצמדים ל-CHO e Monolayers.

תמונות אלה מציגות זום של תא BT 20 בודד שבו CD 24 ומולקולות רוויות מתמקמות יחד ומופיעות ככתמים צהובים עד כתומים כאשר ערוצי הפליטה הפסאודו-צבעוניים האדומים והירוקים מתמזגים. ביחד. מידע זה מדגים כי למערכת פיצול פליטת המצלמה הכפולה יש את הרזולוציה המרחבית, הזמנית והאופטית הדרושה כדי לחשוף תכונות תאיות ומולקולריות ביישומים כגון מבחני הידבקות תא זרימה שבהם תאים נעים במהירות דרך שדה הראייה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר ולכייל מערכת פיצול פליטת מצלמה כפולה או הדמיה של בדיקת הידבקות תא זרימת צלחת מקבילה בזמן אמת בשני צבעים. ניתן ליישם שיטה זו על מבחני מבחנה אחרים המשתמשים בפלואורסצנטיות כדי לחקור את התנהגות התא.