במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע בדיקת היצמדות בתא זרימה בעל לוחות מקבילים (parallel plate flow chamber), תוך שימוש במערכת פיצול פליטה עם מצלמה כפולה כדי להקליט בו-זמנית רצפי תמונות בזמן אמת בשני צבעים. לשם כך, ראשית מבצעים כיול של שתי המצלמות במערך הדימוג. לאחר מכן, מכינים את התאים ואת התשתית הריאקטיבית, ומקימים את תא הזרימה בעל הלוחות המקבילים.

לאחר מכן מכוונים את הגדרות המצלמה לרכישת תמונות בשני צבעים, ומבצעים תיקונים דיגיטליים נדרשים ליישור המצלמה. לאחר מכן נלכדות רצפי תמונות, המדגימים רכישה של תמונות דו-צבעיות ברזולוציה זמנית גבוהה. היתרון של מערכות פיצול פליטה עם שתי מצלמות על פני מערכות עם מצלמה אחת הוא שניתן להקצות זמני חשיפה שונים לכל מצלמה, ושטח הראייה המלא נשמר.

טכניקה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום היצמדות התאים, כגון כיצד מיקום של מולקולות היצמדות על פני השטח של תאים עשוי להשפיע על תהליכים ביולוגיים דינמיים כמו נדידת תאים, דלקת וגרורות סרטניות. הפרוצדורה הבאה דורשת מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-הפוך. זה צריך להיות מצויד במקור אור בעוצמה גבוהה המחובר למוליך אור, קוביית פילטר משולבת ומערכת מצלמה כפולה לפיצול פליטה.

יש לחבר את מערך המיקרוסקופ למחשב המריץ תוכנת דימיון המסוגלת לאסוף ולשלב תמונות שנתפסו על ידי מצלמות CCD מונוכרומטיות. במקרה זה, נעשה שימוש בתוכנת stream picks five למספר מצלמות עם מודול simul picks. התחל בפתיחת stream picks five, ובסרט הפעולות (task ribbon) בחר workspace.

לאחר מכן, בצד ימין של המסך, פתחו את מנהל סביבת העבודה (workspace manager) ובחרו בסביבת עבודה חדשה (new workspace). לאחר מתן שם למצלמה, פעלו לפי הנחיות התוכנה כדי לבחור מרשימה מוכנה מראש תופס (grabber) התואם לדגם המצלמה; סמל מצלמה קטן יופיע בסביבת העבודה כדי לציין שזרם הווידאו מהמצלמה התקבל. כעת ניתן לצפות על המסך באובייקטים המדוממים באמצעות המיקרוסקופ.

חזור על תהליך זה עבור מרחב העבודה של המצלמה השנייה, ולאחר מכן עבור מרחב העבודה הממוזג, חזור על הפעולה פעם נוספת וכל המצלמות יהיו בשימוש. תופיע הודעת שגיאה. הודעה זו היא תקינה; שייך את המצלמות שהוקצו למרחבי עבודה אחת ושתיים אל מרחב העבודה הממוזג בפאנל העגינה הממוקם בצד ימין של מסך הצפייה.

התמונות בסביבת העבודה הראשונה והשנייה יסופרו זו על זו בסביבת העבודה הממוזגת כשתי תמונות בצבעי פסאודו. ההיבט המורכב ביותר של פרוצדורה זו הוא כיול המצלמה. כדי להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בנחית המפעל תוך מעקב קפדני אחר הוראות היצרן.

כדי לכייל את המצלמות במערכת פיצול פליטה בעלת מצלמה כפולה, העבירו אור בשדה בהיר (brightfield) או בניגודיות פאזה לעין של המיקרוסקופ. הניחו על שולחן המיקרוסקופ את רשת הכיול בעלת הציפוי המתכתי שסופקה על ידי היצרן, ויישרו את הרשת על שולחן המיקרוסקופ. הציגו את הרשת ללא בינינג (binning) וללא קנה מידה אוטומטי (auto-scaling), הגדירו פוקוס, ולאחר מכן הזזו, אך אל תסירו, את בית הדיכרואי כדי לכייל את מצלמה אחת.

לאחר מכן, בעזרת חוגת כיוון הפוקוס בפתח seamount 1, התמקדו שוב בתמונה. לאחר מכן, דחפו את בית המראה הדיכרואית לתוך התקן הרכישה בעל הערוץ הכפול עד הסוף, כך שהתמונה תפוצל על ידי המראה הדיכרואית לשתי המצלמות. שחררו את ברגי הקיבוע בגודל 3/64 אינץ' וסובבו את המצלמה השנייה בפתח CM mount 2 עד שהכיוון של הרשת יהיה זהה בשתי התמונות. בעזרת חוגת כיוון הפוקוס בפתח C mount 2, הגבירו את הפוקוס של התמונה ממצלמה 2.

כדי להשלים את הכיוון, השתמשו בכפתור ה-RL בצד ימין של DC two כדי לכוון את מיקומי התמונות המשולבות עד שקו הגבול האנכי של התמונות מיושר בדיוק במרחב העבודה הממוזג. לאחר מכן, השתמשו בכפתור ה-UD כדי לכוון את היישור למעלה-למטה של התמונה השנייה עד שפסי הרשת האופקיים מיושרים כראוי.

אם במהלך יישור המעלה-מטה מתרחשת סיבוב קל של המצלמה, תקנו בעיה זו על ידי שחרור הברגים בגודל 3 5 60 fourth inch עבור מצלמה שתיים וסיבוב עד שהתמונה המוצגת מיושרת כראוי. הכינו תאי סרטן שד BET 20 עבור בדיקת היצמדות בתא זרימה בעל לוחות מקביליים (parallel plate flow chamber adhesion assay) על ידי צביעתם ב-anti CD 24 וב-TECA 4 5 2 תוך שימוש ב-LOR 5 68 וב-4 88 secondaries כפי שמתואר במסמך המצורף; ודאו שאתם מכינים את בקרות הצבע הבודדות המתאימות לאחר הצביעה. העבירו את התאים למכל של תא הזרימה בעל הלוחות המקביליים. חברו שני קטעי צינור נפרדים לפתחי הכניסה והיציאה של תא הזרימה.

צינור אחד יחובר למאגר המכיל את התאים המסומנים התלויים ב-DPBS בתוספת 0.1%PSA. חבר את הצינור השני למשאבת המזרק, שתשאב את הנוזל בקצב זרימה מוגדר. חבר קו ואקום לתא הזרימה ומקם את תא הזרימה מעל צלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר המכילה שכבה אחת של תאי שחלה של המסטר הסיני המבטאים לקטין או תאי cho e.

כוון את תא הזרימה ואת אטם תא הזרימה כדי להבטיח איטום ואקום נאות. שאב נוזל מהמאגר תוך כדי ניטור של מכלול תא הזרימה כדי לוודא שהאיטום תקין. לבסוף, הנח את מכלול תא הזרימה על המיקרוסקופ, הדלק את מקור האור ובדוק ידנית את הגדרות המיקרוסקופ.

ודאו שבית הדיכרואי נמצא בתנוחת העבודה השקועה הנכונה ואינו במצב מעקף (bypass). עברו ידנית למצב פלואורסצנציה ובחרו בקוביית מסנני הפלואורסצנציה הירוק-אדום כדי לקבוע את זמן החשיפה ואת ההגבר (gain) בנפרד. צלמו את התאים באמצעות פלואורסצנציה אדומה במצלמה אחת ופלואורסצנציה ירוקה במצלמה שנייה.

לחץ ידנית על המסנן הדיכרואי לפי הצורך כדי לקבל את התמונות. לאחר מכן, השב תרחיף של תאי BT 20 שצבעו רק ב-red flora. ארבעה נוגדנים מזווגים במאגר המחובר לפתח הכניסה של תא הזרימה בעל הפלטה המקבילה.

השתמש במשאבת מזרקים כדי לבצע פרפוזיה של תאי BT 20 מעל השכבה החד-שכבתית (monolayer) של תאי choi בתא הזרימה בעל הפלטות המקבילות. בהגדרות הצילום החי (live settings) של תוכנת הדימיג', התאם את זמן החשיפה של מצלמה אחת כדי לקבל תמונה בערוץ האדום. התאם את זמן החשיפה של מצלמה שתיים לזמן החשיפה של מצלמה אחת.

אם נצפית תמונה בערוץ הירוק, סימן שישנם ארטיפקטים של דליפה (bleed through). במקרה כזה, שמרו על זמן חשיפה שווה במצלמה אחת ובמצלמה שתיים, והפחיתו את זמן החשיפה עד שארטיפקט הדליפה אינו נראה יותר בערוץ הירוק. במידת הצורך, כווננו את הגבר (gain) של מצלמה אחת כדי לשפר את נראות התמונה בערוץ האדום.

בשלב הבא, הסירו כל שארית של תרחיף תאי BT 20 מהמאגר והחליפו את התרחיף ב-DPBS. השתמשו במשאבת מזרקים כדי לבצע פרפוזיה של התמיסה מעל השכבה החד-שכבתיות (monolayer) של ה-choi עד שתאי BT 20 לא יהיו נראים יותר על השכבה. מלאו מחדש את המאגר בתרחיף של תאי BT 20 שצבעו רק באמצעות נוגדן מצומד ל-green fluoro four.

חזרו על תהליך כיול המצלמה באמצעות בקרת הצבע היחידה הירוקה. הפעם הגדירו את זמן החשיפה במצלמה שתיים כדי לדמות תאים בערוץ הירוק ללא ארטיפקטים של דליפה (bleed through) לערוץ האדום שנאסף על ידי מצלמה אחת. השתמשו בתוכנת הדימיון כדי לצפות בו-זמנית בתמונות שנתפסו משתי מצלמות ה-CCD המונוכרומטיות בתא הזרימה.

מזגו את התמונות שנאספו משתי המצלמות באמצעות מודול ה-simul pics של stream picks. השתמשו בהתאמות תיקון דיגיטליות ב-simul pic או בתוכנה חלופית כדי ליישם יישור מרחבי של התמונות הממוזגות. במידת הצורך, ניתן לתקן את התמונות באמצעות מודול simul PIC לצורך התאמות אופקיות, אנכיות וסיבוביות.

המערכת מוכנה כעת לשימוש לצילום שתי תמונות צבע בו-זמנית. בדיקת הידבקות בתא תזרים של לוחות מקבילים (parallel plate flow chamber adhesion assay) שימשה כדי להדגים את מערכת פיצול הפליטה של מצלמה כפולה המתוארת בסרטון זה. כפי שמוצג כאן, המערכת זיהתה תאי BT 20 שסומנו פלואורסצנטית עם anti-human CD 24 המוצג באדום ו-HECA 4 52, הנקשר למולקולות הקשורות ל-SCOs, המוצג בירוק.

חלק מהתאים המתגלגלים הציגו אותות אדומים אך לא ירוקים. תאים אחרים הציגו אותות ירוקים אך לא אדומים, ותאים נוספים הציגו אותות אדומים וירוקים כאחד. המצלמות שמרו על הרזולוציה האופטית והזמנית כדי לעקוב אחר מאפייני התא בזמן שהתגלגל והתהפך על פני התסביך הריאקטיבי בכיוון הזרימה. איחוד ערוצי הפליטה חשף את ההתפלגות והקו-לוקליזציה של מולקולות CD 24 ו-sated על פני השטח של תאי BT 20 המתגלגלים ונצמדים לשכבות מונושכבה של CHO e.

תמונות אלו מציגות תקרב של תא BT 20 בודד, שבו מולקולות CD 24 ו-sated מצטלבות (co-localize) ומופיעות כנקודות צהובות עד כתומות כאשר ערוצי הפליטה בצבעי פסאודו אדום וירוק ממוזגים. יחד, מידע זה מדגים שמערכת פיצול הפליטה של המצלמה הכפולה בעלת הרזולוציה המרחבית, הזמנית והאופטית הדרושה כדי לחשוף מאפיינים תאיים ומולקולריים ביישומים כגון בדיקות היצמדות בתא תזרים (flow chamber adhesion assays), שבהם תאים נעים במהירות דרך שדה הראייה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ההגדרה והכיול של מערכת פיצול פליטה עם מצלמה כפולה, או דימוי של בדיקת היצמדות בתא זרימה בעל לוחות מקבילים בזמן אמת בשני צבעים. ניתן ליישם שיטה זו על בדיקות in vitro אחרות המשתמשות בפלואורסצנציה לחקר התנהגות תאים.