הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לדמות מספר מיני חלבונים בו-זמנית בדיוק ננומטרי בתאים מקובעים או חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי כיוונון מיקום המצלמה והאופטיקה עד לתמונה ממוקדת מהמיקרוסקופ המוקרנת על שבב המצלמה. השלב השני הוא סידור קרני הלייזר כך שיהיו מיושרות ישירות אל הדגימה שעל בסיס המיקרוסקופ.

בשלב הבא, מדאירה את דגימת התאים שהוכנה ונבחר תא המבטא את החלבונים הרצויים. השלב האחרון הוא הדמיית התא באמצעות מיקרוסקופיית לוקליזציה בהפעלת פוטו-פלואורסצנציה על ידי הארת הדגימה בלייזרים, ולאחר מכן ניתוב הפלואורסצנציה של התא אל שבב המצלמה לרכישת סט נתונים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית לוקליזציה בהפעלת פוטו-פלואורסצנציה משמשת להצגת לוקליזציה של מיני חלבונים מרובים בקנה מידה מרחבי ננומטרי בתאים מקובעים או חיים, הן בשדה רחב והן בעת שימוש בפלואורסצנציית החזרה פנימית מלאה לבידוד אזור דק של הדגימה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקאלית או מיקרוסקופיה אלקטרונית, הוא היכולת לדגם מספר חלבונים בו-זמנית ברזולוציה ננומטרית בתאים מקובעים או חיים. השלבים הבאים מתייחסים למערכת מספור כפי שמוצגת כאן, שהיא סכימה של מערך ה-F Om הרב-צבעי המופיע כאיור 1 בפרוטוקול הטקסט הנלווה; כדי לכייל את המיקרוסקופ, התחל בהנחת סרגל כיול או דגימה רדיאלית עלבמת המיקרוסקופ, כאשר עדשה אובייקטיבית של 10x מותקנת והמנורה מכוונת לאור תמסורת. מרכז את הקו האנכי במרכז שדה הראייה.

בשלב הבא, כווננו את המיקרוסקופ לתאורה קוהירנטית על ידי סגירת מפתח השדה והבטה דרך העיניות במישור האנכי. אם קצוות מפתח השדה אינם בפוקוס, כווננו את גובה הקונדנסור עד שגם מפתח השדה וגם ה-redle יהיו בפוקוס. לאחר מכן, כווננו את המיקום הלטראלי של מפתח השדה עד שיהיה ממורכז ביחס לשדה הראייה, וסגרו את מפתח השדה עד שרק רשת המרכז ב-redle תהיה מוארת.

בפעם הראשונה שמרכיבים את הרכיבים הללו, יש להתאים את אורכי המסלול של כל ערוץ כך שיהיו שווים. כדי לבצע זאת, יש להניח את הדגימה על שבב המצלמה, לכוונן את מראות שבעה ותשע ולסגור את מפתח הגילוי כדי למנוע חפיפה מרחבית בין שני הערוצים. לאחר מכן, יש למקד את תמונת הרדיקל בערוץ האור המוחזר ולבדוק אם היא ממוקדת גם בערוץ האור המועבר.

אם התמונה בערוץ האור המועבר אינה ממוקדת, הזז את מראה תשע עד שהתמונה של הרדיקל תהיה ממוקדת בו-זמנית בשני הערוצים. התחל ביישור הלייזרים על ידי הסרת עדשה אחת מנתיב הלייזר וחסימת קרני ההפעלה והקריאה. לאחר מכן, הנח כרטיס לבן צמוד למראה ארבע, פתח את תריס המיקרוסקופ ובצע מיקוד עד שתמונת הרדיקל תוקרן על הכרטיס לפני מראה ארבע.

בשלב הבא, שחררו את חסימת קרן הקריאה וכוונו את מראה 1 כך שקרן לייזר הקריאה תהיה במרכז סימון הצלב של תמונת הרדיקל על מראה 4. לאחר המרכוז, השליכו את תמונת הרדיקל על מראה 5 וכוונו את מראה 4 עד שהקרן תהיה ממורכזת על סימון הצלב של התמונה במראה 5. קרן הקריאה צריכה להיות כעת ממורכזת הן ב-M 4 והן ב-M 5.

לאחר מכן, חסמו את קרן הקריאה על ידי סגירת תריס מספר אחת. לאחר מכן, השליכו את תמונת הרדיקל אל מראה מספר שלוש. הסירו את מרחיב הקרן מנתיב הלייזר ושחררו את החסימה של לייזר ההפעלה.

כעת כווננו את מראה שתיים כך שקרן ההפעלה תהיה ממורכזת על קווי הצלב של תמונת הרדיקל שעל מראה שלוש. לאחר המרכז, החזירו את מרחיב הקרן בין מראות שתיים ושלוש וכווננו את מיקומו של מרחיב הקרן עד שהקרן תהיה ממורכזת על קווי הצלב של תמונת הרדיקל. ממראה שלוש, השליכו את תמונת הרדיקל על מראה חמש ובצעו פוקוס.

באמצעות כפתור המיקוד של המיקרוסקופ, כווננו את הזווית של המראה הדיכרואית מספר אחת עד שקרת ההפעלה תהיה ממורכזת על תמונת ה-redle. לאחר מכן, חסמו את לייזר ההפעלה על ידי סגירת תריס שתיים, כאשר אין עדשה אובייקטיבית במקומה ותריס המיקרוסקופ פתוח. פתחו את תריס הקריאה, תריס אחת, והקרינו את הלייזר דרך המפתח האחורי של המיקרוסקופ.

כווננו את מראה חמש עד שהקרן יוצאת מהמיקרוסקופ, כך שהקרן תצא מהמיקרוסקופ בצורה אנכית כאשר עדשה אחת והעדשה האובייקטיבית נמצאות בחזרה במקומן. הניחו על הבמה דגימה המכילה 100 µM של bromine B כאשר לייזר ההפעלה חסום. הקרינו את לייזר הקריאה דרך עדשה אובייקטיבית 60x אל תוך הצבע.

כאשר הגברת הכפלה האלקטרונית מבוטלת, שלחו תמונה זו למצלמה. לאחר מכן, התמקדו עם העדשה לאובייקט הדגימה.

פתחו את הצמצם מספיק כדי לאפשר דימוי של פרופיל הקרן המלא. לאחר מכן, הזיזו את הצמצם הצידה כך שמרכז פרופיל הקרן והצמצם יהיו קונצנטריים. באמצעות תוכנת המצלמה, בחרו את אזור העניין (region of interest) כדי לאפשר את אזור הקריאה הקטן ביותר של המצלמה המכיל את שני הערוצים, ורשמו קואורדינטות אלו.

בשלב זה, רשמו תמונת snapshot בודדת שתייצג את פרופיל קרן הקריאה. לאחר מכן, חסמו את לייזר הקריאה על ידי סגירת תריס one ופתיחת תריס two. כדי להתחיל למדוד את פרופיל קרן ההפעלה, הקרינו את לייזר ההפעלה על הדגימה; במידת הצורך, השתמשו בהגבר הכפלה אלקטרוני של פחות מ-100 וכוונו את המראה הדיכרואית הראשונה עד שהקרן תהיה ממורכזת בכל שדה ראייה.

לאחר מכן, רשמו צילום של פרופיל קרן ההפעלה כדי להתחיל ברכישת תמונות F palm רב-צבעיות. כבו את כל תאורת החדר. לאחר מכן, השליכו את אור מנורת הכספית באמצעות תושבת ההטיה (flip mount) על התאים שעברו טרנספקציה, והחליפו את קוביית המסנן לקובייה המכילה את אורך גל העירור המתאים למצב של טרום-מפסק פוטוני.

לאחר בחירת תא, הורידו את מעמד ההטיה (flip mount) כדי לאפשר ללייזרים לעבור אל תוך המיקרוסקופ, ושנו את מגדל המסננים למסנן המכיל את המראה הדיכרואית המתאימה לדימוי, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, התיקו תמונה זו למצלמה כדי להבדיל בין תאים שעברו טרנספקציה לבין פלורסצנציית רקע, וכדי לוודא שהמולקולות ניתנות להפעלה פוטוכימית. האירו את הדגימה למשך זמן קצר בעזרת הספק נמוך של פחות מ-10 µW מלייזר ההפעלה.

בשלב הבא, הכינו את תוכנת המצלמה לרכישת סדרות קינטיקה על ידי הגדרת הגבר הכפלה אלקטרונית של 200 ומספר פריימים רצוי שבין 5 ל-10,000. הגדירו גם את זמן החשיפה לבין 10 ל-30 מילישניות. לאחר מכן, חסמו את קרן ההפעלה, פתחו את קרן הקריאה, והקרינו את תמונת התא המואר אל המצלמה.

בחרו מישור מוקד קרוב לממברנה התאית התחתונה על ידי הזזת המוקד כלפי מטה עד שהמולקולות הבודדות אינן נראות עוד. לאחר מכן, הזיזו את המוקד בהדרגה כלפי מעלה עד שהמולקולות הופכות לנראות לראשונה. כעת, שחררו את חסימת קרן ההפעלה והאירו את הדגימה בעוצמה של פחות מ-one watt per squared centimeter.

התחילו ברכישת נתונים אלו באמצעות תוכנת המצלמה תוך שמירה על צפיפות של 0.1 עד מולקולה אחת גלויה הניתנת לצילום למיקרון רבוע, וזאת על ידי התאמה דינמית של מסנן הצפיפות הניטרלית הממוקם לפני לייזר ההפעלה. לצורך דימות פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה, התקינו את מראה 5 ועדשה 1 על במה אחת הניתנת להזזה (translation stage) כדי שניתן יהיה להזיזה לצדדים ממש מאחורי הכניסה למיקרוסקופ. בעוד מראה 5 ועדשה 1 מוזזות, קרני הלייזר היוצאות מהעדשה האובייקטיבית כלפי מעלה דרך הדגימה יטו בהדרגה לצד אחד; המשיכו להזיז את הבמה עד שזווית קרני הלייזר תגיע ל-90 מעלות מהאנך.

בשלב זה, קרן הלייזר היוצאת תיעלם, וקרן הלייזר הנכנסת תוחזר מהמפתח בנתיב אנטי-מקבי לקרן הנכנסת ותוסט הצידה. יש לצפות בהפחתה ברקע כאשר הדגימה נכנסת למצב של פלואורסצנציית החזרה פנימית מלאה. עם סיום רכישת התמונות, סגרו מיד את תריס המיקרוסקופ וחסמו את שתי הקרניים. בטלו את הגברת הכפלה האלקטרונית.

הגדירו את המצלמה להקלטת פריים אחד והגדירו את אזור הקריאה של המצלמה לגודלו המקסימלי. לבסוף, חסמו ערוץ אחד על ידי הנחת כרטיס מעל F three או F four עם מסנן מעביר אורך גל ארוך (long pass filter) המותקן על נורת המיקרוסקופ. האירו את הדגימה והקרינו תמונה זו אל המצלמה.

הקליטו תמונת מצב (snapshot) של התא כדי לייצג את התא השלם באור תמסור (transmitted light). מוצג כאן דוגמה לרכישת F palm בשני צבעים של תא NIH 3T3 המבטא הן DENDRA 2 Hemagglutinin והן PAM Cherry actin. הערוץ התמסורי משמאל מכיל אורכי גל ארוכים יותר מהערוץ המוחזר מימין.

מוצגים כאן תצלומיות מרכישה של F OM בשני צבעים, לאחר הפחתת רקע והמרה לצורך הצמדה של הערוצים השמאלי והימני. ניתן לזהות ולמקד מולקולות בודדות. חלק מהמולקולות נראות בהירות יותר בערוץ המועבר, וחלקן מראות התפלגות אחידה יותר של פליטה בין שני הערוצים.

דבר זה מצביע על ההבדל בספקטראי הפליטה בין PAM cherry ל-DENDRA two בהתאמה, ומשמש בניתוח לזיהוי שני המינים הללו. ההיסטוגרמה המוצגת כאן מצביעה על יחס של עוצמת הערוץ האדום המועבר חלקי העוצמה הכוללת עבור כל המולקולות הממוקמות לאחר החלת סביליות. הפיקסלים נראים לבנים בתמונה השמאלית התחתונה ומופיעים באדום בתמונה הממוזגת הסופית המוצגת בימין למטה, בעוד שאלו שבסביבה הירוקה מוצגים כלבנים בתמונה הימנית העליונה ומופיעים בירוק בתמונה הממוזגת הסופית המוצגת בימין למטה.

רמות הסף הנבחרות בעת הרינדור משפיעות במידה רבה על רמת הרעש ועל המראה של הקולוקליזציה. מוצגות כאן שלוש אפשרויות שונות לרינדור הגורמות לדרגות שונות של דילול צבע (bleed through); רמות הסף השמרניות ביותר מוצגות בשתיים התחתונות. היסטוגרמות של Color F palm alpha מפורשות בצורה הטובה ביותר כאשר ישנם שני שיאים ניתנים להבחנה בתמונה.

בעוד שההיסטוגרמה משמאל היא מועמדת טובה להמשך ניתוח, התמונות שיתקבלו משתי ההיסטוגרמות האחרות יהיו קשות הרבה יותר לפירוש לאחר ביצוע הליך זה. ניתן לבצע שיטות כגון מיקרוסקופיית החזרה פנימית מלאה (Total Internal Reflection microscopy) ודימוי תאים חיים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו חלבונים מאורגנים בקנה מידה ננומטרי בממברנות של תאים חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים מיקרוסקופ FAR משלכם ולהשתמש בו כדי לרכוש נתונים.

אל תשכחו שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשלים הדרכת בטיחות לפני הניסיון לבצע הליך זה.