יצירת כימרות של כריות שומן בלוטות לימפה לחקר מקור תאי סטרומה של בלוטות הלימפה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור כימרה של כרית שומן בבלוטות הלימפה כדי להעריך את התרומה של רקמת השומן להיווצרות סטרומה של בלוטות הלימפה. זה מושג תחילה על ידי בידוד בלוטות לימפה מעכברים שזה עתה נולדו וכריות שומן מעוברי עכברים ביום 18.5. בלוטת הלימפה מוסרת מכרית השומן העוברי ומוחלפת בבלוטת הלימפה שזה עתה נולדה.

כימרה של כרית השומן של בלוטות הלימפה מורכבת על ידי שיוך מחדש ולאחר מכן תרבית של בלוטת לימפה אחת שזה עתה נולד עם כרית שומן עוברית אחת במבחנה. לאחר מכן הכימרה מושתלת מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח. שלושה שבועות לאחר ההשתלה, הכליה נקצרת והכימרה נשלפת.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את תרומתם של התאים שמקורם בכרית השומן לסטרומה של בלוטות הלימפה על ידי ניתוח מיקרוסקופי זרימה ציטומטרי ואימונופלואורסצנטי. אז לראשונה עלה לנו הרעיון לשיטה הזו כשחיפשנו דרך להעריך אם תאים מכרית השומן אנו תורמים להיווצרות בלוטות הלימפה כדי לבודד בלוטות לימפה מפשעתיות שזה עתה נולדו. לאחר חיתוך הראש השתמש במספריים כדי לפתוח את גוף החיה מהחלק העליון של אזור בית החזה לתחתית הבטן.

לאחר הוצאת כל הקרביים בזהירות מחלל הבטן, הניחו את הגוף בצלחת פטרי בגודל 90 מילימטר המכילה מדיה RF 10. מניחים את המנה במכסה מנוע סטרילי לתרבית רקמות ולאחר מכן מעבירים את הגוף לצלחת פטרי סטרילית חדשה בגודל 90 מילימטר המכילה RF 10 טרי. לאחר מכן נתק בזהירות את הצפק מהעור באזור המפשעתי ואתר את בלוטות הלימפה המפשעתיות הממוקמות בצומת של שלושה כלי דם בכרית השומן.

הסר בזהירות את בלוטות הלימפה, וודא שכל רקמת השומן מוסרת. לאחר מכן הניחו את בלוטות הלימפה בצלחת פטרי בגודל 50 מילימטר המכילה מדיה RF 10 על קרח כדי לבודד את רפידות השומן המפשעתי מעוברי יום 18.5. לאחר הסרת הקרביים כפי שהודגם זה עתה, שטפו את הגופות ב-PBS סטרילי כדי לחסל את כל עקבות הדם.

העבירו את הגופים הנקיים לצלחת פטרי טרייה של 90 מילימטר ואז נתקו את הצפק, מקמו את בלוטת הלימפה המפשעתית והסירו אותה כפי שהודגם זה עתה. השליכו את הרקמה המבודדת. הקפד להסיר את כל בלוטת הלימפה כדי למנוע זיהום של כימרה של כרית השומן.

לאחר מכן הסר את כרית השומן המפשעתי והנח אותה בצלחת פטרי בגודל 50 מילימטר המכילה מדיה RF 10 על קרח. כדי להקים את מערכת תרבית האיברים במבחנה, תחילה חתכו מעט וולקן מתחת לעטיפה לחתיכות של סנטימטר וחצי רבוע. לאחר מכן מרתיחים את הספוגים במשך שעתיים ואת המסננים במשך 20 דקות במים מזוקקים ונותנים להם להתייבש מספר שעות במכסה תאים.

לאחר שהחומרים יבשים, הניחו ספוג אחד כל אחד בצלחת פטרי בגודל 50 מילימטר המכילה שני מיליליטר מדיה. טבלו כל ספוג במדיה כדי להרטיב את שני הצדדים, ולאחר מכן הניחו מסנן אחד לכל מערכת תרבית איברים במבחנה בממשק האוויר הנוזלי. לאחר מכן, שייכו בזהירות כרית שומן עוברית אחת לבלוטת לימפה אחת שזה עתה נולדה ישירות על החלק העליון של כל מסנן.

מעבירים את כלי הפטרי לקופסת פלסטיק מלבנית עם מים בתחתית וחורים במכסה. הדביקו את המכסה לקופסה והשאירו את החורים פתוחים. לאחר מכן הנח את הקופסה בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2.

הניחו לקופסה להתייצב למשך שעתיים ואז אטמו את החורים במכסה בעזרת סרט. דגרו על הרקמות למשך יומיים לפחות כדי לאפשר לבלוטות הלימפה להיצמד לרפידות השומן לפני ההעברה מתחת לקפסולת הכליה, שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ההשתלה. בודד כל כימרה של כרית שומן בבלוטות הלימפה בתוך כל כליה ונתח את בלוטות הלימפה.

לאחר מכן, עבור כל בלוטת לימפה, השתמש במספריים קטנים כדי לבצע חתך בודד ברקמה כדי לסייע בעיכול האנזימטי. לאחר מכן, הניחו בלוטת לימפה אחת כל אחת לתוך צינורות אינאור בודדים של 1.5 מיליליטר המכילים 600 מיקרוליטר של מאגר עיכול. דגרו את הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על גוש תרמי מעורר, תוך פיפטינג למעלה ולמטה כל 10 דקות כדי לעזור לנתק את הרקמה.

לאחר מכן הוסף שישה מיקרוליטרים של EDTA לצינורות וטרטר את תרחיף התא כמה פעמים כדי לסיים את הדיסוציאציה. לאחר מכן ניתן לצבוע את התאים בנוגדנים הרצויים ולנתח אותם על ידי זרימה ציטומטרית כדי לשמר את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב המשופר או ביטוי EYFP. תקן את בלוטות הלימפה למשך שלוש עד ארבע שעות.

לאחר מכן עבור כל בלוטת לימפה, הניחו טיפה אחת של תרכובת OCT קרה על חתיכה קטנה של נייר אלומיניום. הימנע מבועות אוויר, הנח בזהירות בלוטת לימפה אחת באמצע כל טיפה ולאחר מכן הניח את נייר הכסף על קרח יבש כדי להקפיא את הרקמות. לאחר מכן ניתן לחתוך את בלוטות הלימפה, לצבוע אותן ולנתח אותן במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

P בידוד זהיר של בלוטת הלימפה מאפשר ניתוח נוסף של הצאצאים של תאים שמקורם בשומן חיובי EYFP. קטעי קריו וניתוח אימונופלורסנט של בלוטת הלימפה מגלים כי תאים שמקורם בשומן חיובי EYFP נודדים לבלוטת הלימפה, שם הם תורמים לזרימת רשת תאי הסטרומה של GP 38 חיובי E RTR שבע בלוטות לימפה חיוביות ניתוח ציטומטרי מאשר כי חלק חשוב מתאי הסטרומה של בלוטות הלימפה נובע מתאי אב של רקמת שומן חיובית EYFP מקומית התורמים ל-30% מ-CD 45 שלילי G 38 חיובי CD 31 FIBROBLASTIC שלילי שבר, ו-10% מ-CD 45 שלילי GP 38 שלילי CD 31 מקטע תאי אנדותל דם חיוביים עד 80% מ-CD 45, שלילי G 38 חיובי CD 31 מקטע פיברובלסטי שלילי ניתן להפיק מתאי מבשר רקמת שומן המדגימים את התפקיד המכריע שממלאת רקמת השומן בשמירה על צמיחת סטרומה של בלוטות הלימפה. אז פעם שלט בטכניקה זו עם חוקר בתחום אורגנוגנזה לימפואידית כדי לחקור את תפקידן של מולקולות שונות המעורבות בטראומה של לימפואידים.