יצירת כימרות של כריות שומן בלוטות לימפה לחקר מקור תאי סטרומה של בלוטות הלימפה

המטרה הכלית של פרוצדורה זו היא ליצור כימרה של רקמת שומן וקשרי לימפה, על מנת להעריך את תרומת הרקמה השומנית להיווצרות הסטרומה של קשרי הלימפה. הדבר מבוצע תחילה על ידי בידוד קשרי לימפה מעכברים רכים ובידוד רקמות שומן מעוברים של עכבר ביום 18.5. קשר הלימפה מוסר מרקמת השומן העוברית ומוחלף בקשר לימפה מעכבר רך.

כימרת רקמת השומן של קשרי הלימפה מורכבת על ידי חיבור מחדש ולאחר מכן תרבית במעבדה (in vitro) של קשר לימפה אחד שלו של רך עם רקמת שומן עוברית אחת. לאחר מכן, הכימרה מושתלה תחת קפסולת הכליה של עכבר מארח. שלושה שבועות לאחר ההשתלה, הכליה נאספת והכימרה נשבה.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את תרומתם של התאים המופקים מרקמת השומן (fat pad) לספלינק של קשרי הלימפה באמצעות ניתוח בציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה של פלואורסצנציה עקיפה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר חיפשנו דרך להעריך האם תאים מרקמת השומן תורמים להיווצרותם של קשרי הלימפה. כדי לבודד קשרי לִימפה מותניים (inguinal) של רך-בטן, לאחר חיתוך הראש, השתמשו במספריים כדי לפתוח את גוף בעל החיים מחלקו העליון של אזור בית החזה ועד לחלקו התחתון של הבטן.

לאחר הסרה זהירה של כל האיברים הפנימיים מחלל הבטן, העבירו את הגוף לפטריה של 90 מילימטר המכילה מצע RF 10. הניחו את הפטריה תחת מנדף סטרילי לתרביות רקמה, ולאחר מכן העבירו את הגוף לפטריה סטרילית חדשה של 90 מילימטר המכילה RF 10 טרי. לאחר מכן, הפרידו בזהירות את הפריטונאום מהעור באזור המפשעה ואתרו את קשרי הלימפה המפשעיים הממוקמים בנקודת המפגש של שלושה כלי דם ברפידת השומן.

הוציאו בזהירות את קשרי הלימפה, תוך וידוא שכל הרקמה השומנית הוסרה. לאחר מכן, העבירו את קשרי הלימפה לפיתרי עם קוטר 50 מילימטר המכיל מצע RF 10 על קרח, כדי לבודד את כריות השומן המפשעיים מעוברים ביום 18.5. לאחר הסרת האיברים הפנימיים כפי שהודגמה הרגע, שטפו את הגופים ב-PBS סטרילי כדי להסיר את כל שאריות הדם.

העבירו את הגופים המנוקים לצ그러ת פטרי נקייה בקוטר 90 מילימטר, ולאחר מכן הסירו את הפריטונאום, אתרו את קשרי הלימפה המפשעיים והוציאו אותם כפי שהודגם כעת. השליכו את הרקמה שהופרדה. הקפידו להסיר את כל קשרי הלימפה כדי למנוע זיהום של כימרת רקמת השומן.

לאחר מכן, הסר את כרית השומן המפקירית (inguinal fat pad) והנח אותה בתוך צלחת פטרי של 50 מילימטר המכילה מצע RF 10 על קרח. להקמת מערכת תרבית האיברים in vitro, גזור תחילה רסס Vulcan under wrap לחתיכות בגודל של 1 עד 1.5 סנטימטר רבוע. לאחר מכן, הרתח את הספוגים למשך שעתיים ואת המסננים למשך 20 דקות במים מזוקקים, והנח להם להתייבש למשך מספר שעות בתוך מנדף תרביות תאים.

לאחר שהחומרים התייבשו, מקמימו ספוג אחד בכל צלחת פטרי בנפח 50 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מצע. טבלו כל ספוג במצע כדי להרטיב את שני צדדיו, ולאחר מכן מקמימו מסנן אחד לכל מערכת תרבית איברים in vitro בממשק נוזל-אוויר. לאחר מכן, חברו בזהירות רפידה שומנית עוברית אחת עם קשרי לימפה אחד שלו בנולד, ישירות על החלק העליון של כל מסנן.

העבירו את צלחות הפטרי לקופסה פלסטית מלבנית עם מים בתחתית וחורים במכסה. הדביקו את המכסה לקופסה בעזרת סרט דביק, תוך השארת החורים פתוחים. לאחר מכן, הניחו את הקופסה באינקובטור לתרביית תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2.

המתינו שעתיים להשגת שיווי משקל בתיבה, ולאחר מכן אטמו את החורים במכסה באמצעות סרט דביק. דגרו את הרקמות למשך יומיים לפחות כדי לאפשר לקשריים הלימפטיים להיקשר לכריות השומן לפני ההעברה תחת הקפסולה של הכליה, שלושה עד ארבעה שבועות לאחר השתלה. בודדו כל כימרה של קשר לימפטי וכרית שומן מתוך כל כליה והוציאו את הקשריים הלימפטיים בניתוח.

לאחר מכן, עבור כל קשר לימפה, השתמשו במספריים קטנים כדי לבצע חתך בודד ברקמה לסיוע בעיכול האנזימטי. לאחר מכן, העבירו כל קשר לימפה בנפרד למבנבנאות 1.5 מיליליטר המכילות 600 µL של תמיצת עיכול (digestion buffer). דגרו את המבנבנאות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C בבלוק תרמי עם ערבוב, ובצעו פיפטינג (pipetting) למעלה ולמטה בכל 10 דקות כדי לסייע בפירוק הרקמה.

לאחר מכן, הוסיפו שש µL של EDTA למבחנות ועבדו את ת сусפנזיית התאים על ידי טריטורציה מספר פעמים כדי להשלים את הדיסוציאציה. לאחר מכן, ניתן לצבוע את התאים בנוגדנים הרצויים ולנתח אותם באמצעות פלוו-ציטומטריה כדי לשמר את הביטוי של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב המשופר או EYFP. קבעו את קשרי הלימפה למשך שלוש עד ארבע שעות.

לאחר מכן, עבור כל קשרי לימפה, הניחו טיפה אחת של תרכובת OCT קרה על פיסת רדיד אלומיניום קטנה. תוך הימנעות מבועות אוויר, הניחו בזהירות קשר לימפה אחד במרכז כל טיפה, ולאחר מכן הניחו את הרדיד על קרח יבש כדי להקפיא את הרקמות. לאחר מכן ניתן לבצע חיתוך, צביעה ואנליזה של קשרי הלימפה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

בידוד זהיר של קשרי הלימפה מאפשר ניתוח נוסף של צאצאיהן של תאים המופקים מרקמה שומנית ותפקידם חיובי ל-EYFP. חתכים בקירור (Cryo sections) וניתוח אימונופלואורסצנטי של קשרי הלימפה מגלים כי תאים המופקים מרקמה שומנית וחיוביים ל-EYFP נודדים אל קשרי הלימפה, שם הם תורמים לרשת תאי הסטורמה של קשרי הלימפה החיוביים ל-GP 38 ול-ER TR seven. ניתוח פלואמטרי (Flow Cytometric analysis) מאשר שחלק משמעותי מתאי הסטורמה של קשרי הלימפה נגזר מתאי פרוגניטור מקומיים של רקמה שומנית החיוביים ל-EYFP, אשר תורמים ל-30% מהfrakציה הפיברובלסטית השלילית ל-CD 45, החיובית ל-G 38 והשלילית ל-CD 31, ול-10% מהfrakציה של תאי אנדותל של דם השלילית ל-CD 45, השלילית ל-GP 38 והחיובית ל-CD 31. עד 80% מהfrakציה הפיברובלסטית השלילית ל-CD 45, החיובית ל-G 38 והשלילית ל-CD 31 יכולים להיגזר מתאי קדם של רקמה שומנית, מה שמעיד על התפקיד המכריע של הרקמה השומנית בתמיכה בצמיחת הסטרומה של קשרי הלימפה. לפיכך, לאחר השליטה בטכניקה זו, חוקר בתחום האורגנוגנזה של איברים לימפואידיים יוכל לחקור את תפקידם של מולקולות שונות המעורבות בבניית הסטרומה הלימפואידית.