בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולעכל דפנות תא חיידקים כדי לקבוע את הזהויות והשברים היחסיים של נוירופפטידים שונים. באמצעות ניתוח UPLC, זה מושג על ידי ליזוף דגימות חיידקים תחילה על ידי הרתחה בנתרן אקול סולפט. לאחר שטיפת SDS, השלב השני הוא לעכל דגימות עם פרונאז E כדי לטהר את הממברנה החיצונית מחיידקים גראם שליליים.

לאחר מכן, הדגימות מתעכלות עם מיז כדי להמיס את הפפטידוגליקן לנוירופפטידים בודדים. השלב האחרון הוא הפחתת הנוירופפטידים והתאמת ה-pH לנקודה האיזואלקטרית של הנוירופפטיד. בסופו של דבר, UPLC משמש להפרדת נוירופפטידים לפי גודל והידרופוביות, מה שמקל על כימות מאפיינים חשובים של דופן התא, כגון מידת קישור צולב ואורך גדיל גליקן ממוצע.

שיטה זו יכולה לעזור לחשוף את התשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון הקשרים בין מורפוגנזה, ארכיטקטורת דופן התא, הפעלת מערכת החיסון ופתוגנזה. למרות ששיטה זו פותחה לטיהור פפטידיל גליקן גרם שלילי, ניתן ליישם אותה גם על חיידקים גרם חיוביים בתוספת כמה אנזימים וטיפולים כימיים כדי לגדל את תרביות החיידקים בחזרה לדלל תרביות לילה אחד עד 100 ל-250 מיליליטר של מדיה טרייה ולגדול לצפיפות האופטית הרצויה ב-600 ננומטר בזמן שתרביות מדוללות גדלות. הקימו אמבט מים רותחים על פלטה חמה בכוס ליטר אחד.

לאחר שהמים רותחים, הכניסו שישה מיליליטר של 6% נתרן דיל סולפט או SDS לתוך צינורות פוליפרופילן של 50 מיליליטר. הוסף מוט ערבוב קטן אחד לכל צינור והדק היטב את מכסי הצינור. מניחים את הצינורות באמבט המים הרותחים ומערבבים בחום של 500 סל"ד על הפלטה החמה.

קצרו את תרבויות 250 מיליליטר על ידי סיבוב ב -5, 000 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את הכדורים בשלושה מיליליטר של מדיה או במי מלח חוצץ פוספט אחד. הכניסו לאט את תרחיפי התאים לתוך צינורות 50 מיליליטר עם SDS רותח של 6% כדי להכין את התאים בזמן שהצינורות שקועים באמבט המים הרותחים וסגרו מחדש את המכסים לאצבעות חזקות.

מכסים את אמבט המים הרותחים ומאפשרים לתאים לרתוח במשך שלוש שעות, בודקים את מפלס המים מעת לעת וממלאים מחדש את אמבט המים במידת הצורך. לאחר שלוש שעות מכבים את האש על הפלטה החמה וממשיכים לערבב למשך הלילה בחום של 500 סל"ד. אם SDS שקע בצינורות של 50 מיליליטר למשך הלילה, הגדר את אמבט המים לרתיחה למשך שעה עד שעתיים נוספות.

מוצג כאן כיצד תרבית נורמלית צריכה להיראות לאחר ליזה בן לילה. ב-SDS, שימו לב לשקיפות בניגוד לאטימות שמתאמת עם משקעים. הכן את מאגר ה-e הנוטה והפעל את E הנוטה ב-60 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך 30 דקות לפחות.

השתמש באולטרה-צנטריפוגה המוגדרת ב-400, 000 פעמים G כדי לסובב דגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לגלול את מולקולות הפפטול גליקן הגדולות או מולקולות המאקרו PG ובכך לטהר אותן מרכיבים תאיים אחרים. הסר את הסופרנטנט בזהירות ולאחר מכן השהה מחדש כל כדור בטמפרטורת החדר. נפח השעיית החייאת מים אולטרה-טהורים תלוי בנפח צינורות האולטרה-צנטריפוגה המשמשים.

השתמש בנפח הממלא את הצינורות לפחות באמצע הדרך, אך אינו עולה על הנפח המרבי של הצינורות. חזור על הצנטריפוגה והשטיפה עד שהמים לא יוצרים בועות במהלך השעיית Resus, מה שמצביע על כך שה-SDS הוסר במלואו בשלב זה. Resus משהה את הדגימות ב-900 מיקרוליטר של מאגר tris HCL ומעביר לשני צינורות מיליליטר שננעצו בעבר עם חורים בחלק העליון.

בעזרת מחט קטנה מוסיפים 100 מיקרוליטר של פרונאז E פעיל לכל דגימה לפני הדגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. עצרו את הפרעות העיכול המועדות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 6% SDS לכל דגימה והרתיחו את הדגימות בבלוק החום של 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כמו קודם, השתמש באולטרה-צנטריפוגה המוגדרת על 400, 000 פעמים G כדי לסובב את הדגימות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף במים טהורים במיוחד בטמפרטורת החדר עד להסרת ה-SDS במלואו בשלב שטיפת הצנטריפוגה האחרון, להחיות את הדגימות ב-200 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט 50 מילי-מולרי.

ניתן לכוונן נפח זה בהתאם לכמות הגליקן של פפטו בדגימה ועשוי להיות תלוי במין. אם הדגימה מכילה יותר פפ גליקן, הגדל את נפח המתלה. אם בדגימה יש מעט פפטיד גליקן.

צמצם את נפח מתלי ה-resus למינימום של 50 מיקרוליטר. העבירו את הדגימות לצינורות של 1.5 מיליליטר והוסיפו מיליגרם אחד למיליליטר כדי לתת ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם למיליליטר. דגירה במשך שש עד שמונה שעות או לילה בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס.

להכנת דגימות ל-UPLC, הפעל גוש חום ל-100 מעלות צלזיוס. הרתיחו את הדגימות ללא SDS למשך חמש דקות כדי לעצור את דגימות הצנטריפוגות לעיכול הנוזל למשך 10 דקות ב-16,000 פעמים. G בטמפרטורת החדר.

הנוירופפטידים נמצאים כעת בסופרנטנט. העבירו את הסופרנטנט לצינורות זכוכית בגודל 13 על 100 מילימטר. נסה להחזיר כמה שיותר סופרנטנט, להתקרב מאוד לחיך מבלי להפריע לו.

התאם את ה-pH על ידי הוספת מאגר בוראט של 500 מילי-מולרי לדגימה לריכוז סופי של 100 מילי-מולרי בוראט קידוח שמונה מאגר תואם לחומר ההפחתה. נתרן בורו הידריד הוסף מספר גרגירים של נתרן בורו הידריד כדי להפחית כל דגימה ולתת לתגובה להמשיך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, התאם את הדגימות ל-pH 6 כפי שנמדד עם נייר מחוון pH עם חומצה אורתו-זרחתית במרווחים של 20 מיקרוליטר, הדגימה צריכה לבעבע בתגובה לתוספת של חומצה אורתו-זרחתית.

הדגימה בדרך כלל מפסיקה לבעבע כאשר מגיעים ל-pH של שש. לאחר מכן המשך להתאים את הדגימות בין pH שלוש לארבע עם חומצה אורתו-זרחתית באמצעות שתי מרווחים של מיקרוליטר. סנן את הדגימה דרך מזרק 0.22 מיקרון.

מסננים ישירות לבקבוקון A-U-P-L-C. אם משקעים השתנו בדגימות לאחר שהועברו לבקבוקוני UPLC, חממו את הבקבוקונים במספר מעברים דרך להבה. הכנס את בקבוקון ה-UPLC לתוך הדגימה האוטומטית והזריק 10 מיקרוליטר מכל דגימה למכשיר A-U-P-L-C.

מצויד בעמודת UPLC שלב הפוך C 18 וגלאי ספיגה המוגדר לניטור. דגימות של 202 עד 208 ננומטר מוזרקות ברצף. הגדר את הזרימה ל-0.25 מיליליטר לדקה והשתמש בשיפוע ליניארי במשך 25 דקות כדי להשיג 100% ממס B ו-E רציף של נוירופפטידים תוך 30 דקות.

אם תשמש ספקטרומטריית מסה לאפיון נוירופפטידים לאחר UPLC, לאסוף שברים משיא העניין בקולט שברים, להעביר את השברים לצינור של 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לייבש את השברים באמצעות מאייד צנטריפוגלי, יש להתפלח שברים לפני ניתוח MS. בתוצאה הטיפוסית הזו של UPLC. גילוי באמצעות ספיגת UV ב-202 עד 208 ננומטר כפונקציה של זמן קובע זמן שימור נוירופפטידים מסוים.

נצפתה רזולוציה ברורה בין רוב מיני הנוירופפטידים ועוצמת האות החזקה על פני הספקטרום, המאפשרת ניתוח של מידת אורך גדיל הגליקן הממוצע הצולב וזהות הנוירופפטידים וריכוזיהם. דוגמה לכרומטוגרמה המשקפת משקעים C של נוירופפטידים מוצגת כאן. לא נרמזו פסגות וכתוצאה מכך היעדר נתונים על הרכב ה-PG.

היעדר פסגות ניכרות מניתוח UPLC יכול להתרחש כתוצאה מריכוז סופר של הדגימה או התאמה שגויה של ה-pH להרבה מתחת לנקודה האיזואלקטרית של הנוירופפטידים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים, אם כי קדחתניים היא ביצעה כראוי בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו ספקטרומטריית מסה כדי לזהות באופן חיובי מיני נוירופפטידים על סמך מסה לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור את התפקוד הביוכימי של אנזימי דופן התא העיקריים ואת אופן הפעולה של מעכבים כימיים במגוון רחב של מינים ומוטנטים.