הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה של גרסאות חומצה מיקולית: שיטה להפרדת שומנים בדופן התא המיקובקטריאלי על בסיס קוטביות

דופן התא המיקובקטריאלי מכילה גרסאות שונות של חומצות מיקוליות - חומצות שומן ארוכות שרשרת עם שרשראות אלפא משומרות. קיימים הבדלים מבניים בשרשראות הבטא שלהם, וכתוצאה מכך השינויים בקוטביות של חומצות מיקוליות שונות.

כדי להפריד את הגרסאות באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה, או TLC - טכניקת כרומטוגרפיה נוזלית - קח ליפידים של דופן התא מיקובקטריאלי בממס האורגני הרצוי. זהה את השומנים ליד בסיס צלחת TLC המצופה מראש בשכבה דקה של חומר סופג, המתפקד כשלב הנייח.

הנח את הצלחת בתוך צנצנת המכילה ממס אורגני - השלב הנייד - וודא שמפלס הנוזל נמצא מתחת לכתמי הדגימה כדי למנוע דיפוזיה מוקדמת של החומצות המיקוליות.

במהלך הריצה, השלב הנייד עולה דרך הנקבוביות הזעירות של השכבה הסופחת על הצלחת באמצעות פעולה נימית. בסופו של דבר, החומצות המיקוליות מתמוססות בממס ונעות כלפי מעלה.

גרסאות נוספות של חומצה מיקולית קוטביות נספגות באופן זמני על ידי הפאזה הנייחת הקוטבית באמצעות כוחות בין-מולקולריים, מה שמעכב את תנועתם כלפי מעלה. פחות חומצות מיקוליות קוטביות נשארות בשלב הנייד הלא קוטבי ונודדות הלאה.

ההבדלים בנדידה מביאים לכך שגרסאות של חומצה מיקולית נפרדות לרצועות בדידות.

בסיום, רססו את הצלחת המיובשת בכתם חומצה פוספומוליבדית. מחממים את הצלחת כדי להפחית את הכתם בנוכחות השומנים, ומעניקים צבע ירוק כהה לרצועות.

כדי לנתח את הדגימות על ידי TLC, כסו קיר אחד של תא TLC בפיסת נייר פילטר. הוסף וזלין בפינות החדר כדי לאטום את החדר. שפכו את תערובת הממס על נייר המסנן, והוסיפו את הנפח הנותר של הממס לתחתית תא ה-TLC. סגור את תא ה- TLC למשך 20 דקות לפחות כדי להרוות אותו

בינתיים, ממיסים את השומנים בצינור הזכוכית ב-200 עד 1,000 מיקרוליטר כלורופורם, והשתמשו בצינור זכוכית נימי כדי למרוח 10 מיקרוליטר של תרחיף השומן-כלורופורם ישירות על צלחת ה-TLC. לאחר שאפשרת לדגימה להתייבש במשך חמש דקות, הכנס את הצלחת לתא ה-TLC הרווי, ואפשר לשלב הנייד לעבור דרך ה-TLC.

כאשר הממס מגיע לסנטימטר אחד מהקצה העליון של הצלחת, הניחו את הצלחת תחת שטף למינרי עד לייבוש מוחלט של הסיליקה. לאחר מכן, רססו את הצלחת המיובשת ב-15 עד 20 מיליליטר של 10% חומצה מוליבדטופוספורית הידרט באתנול, עד שהצלחת צהובה בהירה, וחממו את הצלחת במשך שתיים עד חמש דקות בחום של 120 מעלות צלזיוס.