אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

פרופיל המסה של האוליגו או הניסוי האולימפי המוצג כאן מאפשר לקבל תובנות מהירות לגבי מבנה הפולימרים במטריצה החוץ-תאית או בדופן התא של אורגניזם. במקרה שלפנינו, דפנות התאים מוכנות משתילי צמחים על ידי הסרה תחילה של רכיבים סלולריים עם 70% אתנול. פולימר דופן המטרה מתעכל לאחר מכן עם תחרה הידרו ספציפית המסיסה רכיבי דופן מסוימים בצורה של כל הרצועות.

גישה חלופית היא לעכל את דופן התא עם האנזים ב-C 2 ישירות על הרקמה. השפע היחסי של רצועות השחרור נקבע על ידי MALDI לספקטרומטריית מסה וניתוח סטטיסטי. היי, אני מרקוס פולי מהמכון למדעי האנרגיה כאן באוניברסיטת קליפורניה בברקלי.

היי, אני מרקוס ר.ואני אשה גילר. גם מהמכון למדעי האנרגיה. אורגניזמים מוקפים במטריצות חוץ-תאיות התלויות באורגניזם מורכבות מרשתות פולימרים מורכבות.

דרך מהירה ורגישה להעריך את המטריצה החוץ-תאית היא שיטה שאנו מכנים אוליאום קצר פרופיל מסה אולי, אותה נראה לכם היום. ניתן לבצע הליך זה גם ישירות על רקמת הצמח. אז בואו נתחיל.

התחל הליך זה על ידי בידוד המטריצה החוץ-תאית או דופן התא של רקמות הצמח. קצרו חמישה שתילי ארבידופסיס או כמות שווה ערך של חומר צמחי אחר והעבירו אותם לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. וודא שהחומר ממוקם בתחתית הצינור.

הוסף שני כדורי מתכת של שלושה מילימטר לצינור התגובה והקפיא בחנקן נוזלי. לאחר מכן טוחנים את הדגימה הקפואה בעזרת טחנת כדורים למשך 2.5 דקות בחום של 25 הרץ. לאחר טחינת החומר, הוסף לדגימה מיליליטר אחד של אתנול מימי 70%.

הסר את כדורי המתכת באמצעות מגנט ומערבולת ביסודיות. טיפול זה ממיס את רוב החלבונים ואברוני התא בצנטריפוגה של הדגימה ב-14,000 סל"ד למשך 10 דקות כדי לגלול את שאריות האלכוהול הבלתי מסיסות. מייצג את חומר דופן התא שאף בזהירות את הסופרנטנט, הקפד לא להפריע לגלולה.

הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מתנול כלורופורם לגלולה שנותרה במערבולת הצינור ביסודיות. כדי להשעות מחדש את הגלולה והצנטריפוגה, הכלורופורם מתנול מחלץ תרכובות הידרופוביות כגון שומנים. לאחר צנטריפוגה, הסר את החטף וייבש את הגלולה לחלוטין באמצעות צנטריפוגת ואקום, זה משלים את הבידוד של חומר דופן התא, שכעת ניתן לטפל בו מניב רצועות ספציפיות.

הדוגמה המודגמת כאן היא המסה של Xlo glucan, תאית ההמי העיקרית הקיימת בדפנות התא של צמחי דיקוט כגון Arabidopsis Xlo glucan הוא פולימר המורכב מעמוד שדרה גלוקן המוחלף בכבדות בשאריות סוכר אחרות לצורך המסה של פולימר זה. אנדוגלוקן פטרייתי משמש להמסת תאית המי זו Resus להשעות את גלולת דופן התא המבודדת היבשה ב-25 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי אמוניום פורמט pH 4.5 ולהוסיף 0.2 יחידות אנדו גלוקונאט. מערבל את המתלה וסובב את הנוזל כלפי מטה.

הכניסו את הצינור למיקסר ותנו לקירות להתעכל במשך 16 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס בניעור. ב-300 סל"ד. לאחר השלמת העיכול של דופן התא המבודד, הסר את הממס באמצעות צנטריפוגת ואקום והמשך לנתח את האוליגוסכרידים המשוחררים על ידי ספקטרומטריית מסה, מלחים ואנזים מוסרים מהדגימה המעוכלת באמצעות חרוזי שרף חילופי הקטיונים מבית Biox MSD 5 0 1.

החרוזים מותנים תחילה על ידי הנחת הכמות הדרושה בעמודה ריקה ושטיפת החרוזים בכמויות גדולות של מים. הוסף חמישה עד 10 חרוזי קטיון ביוקס מותנים לדגימה המעוכלת והמיובשת. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מים לכמויות נמוכות יותר של חומר.

מותר להשתמש בחמישה מיקרוליטרים של מים. טבלו את החרוזים בתמיסה על ידי סיבוב קצר של הצינור למשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר בזמן שהעיכול דוגר עם החרוזים. אתר שני מיקרוליטרים של מטריצת DHB על לוחית יעד Mal D.

אידוי ממס המטריצה תחת ואקום, מה שמוביל לגבישים כימיים מטריציים, איתרו כעת שני מיקרוליטרים של תמיסת העיכול המומלח. על גבי גבישי המטריצה על לוחית המטרה. הממס של נקודת מטריצת הדגימה מתאדה שוב בוואקום.

חשוב לשמור על משך זמן מתאים לערבוב נוזל מטריצת הדגימה לפני ההתגבשות כמתואר בפירוט בפרוטוקול הכתוב הנלווה. לאחר שהדגימה התייבשה, הנח את לוחית המטרה לתוך ספקטרומטר מלדי למסה. הגדר את המכונה למצב חיובי עם מתח מאיץ של 20, 000 וולט ועיכוב של 350 ננומטר.

טווח המסה שנבחר עבור רצועות תאית המי אלה הוא 500 עד 3000 דלטונים. יש לשנות את טווח המסה בהתאם לגודל הרצועות הצפויות. התחל לירות את הלייזר ואסוף 100 עד 200 ספקטרום לדגימה, אשר מורכבים כדי ליצור ספקטרום ממוצע מייצג.

זהו ספקטרום ה-Hemi cellulose oly. ניתן להשתמש בשיטת oly המודגמת בסרטון זה גם ישירות על רקמת הצמח, תוך השמטת כל שלבי הכנת הקיר. הליך ניתוח זה באתרו מודגם על שתילי ארבידופסיס שגדלו כהים.

הדגימה מונחת ישירות על צלחת מטרה ומייבשת באוויר לשתיל היבש בצלחת. הוסף 0.5 מיקרוליטר מתערובת חיץ האנזים המתאימה במיקומים הרצויים. ודא שטיפת האנזים נוגעת חלקית ברקמה ובצלחת המטרה.

הנח את לוחית המטרה של מאלדי בכלי סגור עם לחות רוויה כדי למנוע התייבשות מטיפות האנזים. דגרו את הצלחת למשך 16 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. בתום תקופת הדגירה יש לייבש את נקודת האנזים בוואקום ולהוסיף 0.5 מיקרוליטר של מטריצת ה-DHB הנוזלית על גבי כל נקודת אנזים מיובשת.

לאחר מכן יבש את לוחית המטרה של MALDI בוואקום. לנתח את ה-NC שתי דגימות. הנח את לוחית המטרה, כולל כתמי מטריצת האנזים של דגימת הרקמה לתוך ספקטרום מסה של ספקטרומטר מסה, תוך שימוש באותן הגדרות כמו עבור דגימת דופן התא המבודדת.

התחל לירות את הלייזר על המטריצה. דגימת גבישים ליד הרקמה. הקפידו לא לפגוע ברקמה עצמה שכן במקרה כזה, זמן מעוף המולקולות יהיה כבוי.

אסוף כ-20 עד 50 ספקטרום לכל נקודה והרכיב אותם כדי ליצור ספקטרום ממוצע מייצג. זהו ספקטרום ממוצע מייצג של האוליגוסכרידים שמקורם בגלוקן HemosIL הקיים ב-AOPs. השתילים, עוצמות היונים או גובה היונים של כל היונים המעניינים מתווספים עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של האוליגוסכרידים השונים.

התוצאה של שיטת NC two OMP נותנת תוצאות דומות. ניתן לנתח כל טיפת עיכול אנזימים המסומנת בעיגול צבעוני באופן עצמאי ולקבל ולנתח את ספקטרום המסה המתאים. ניתן לבצע Oola גם על פולימרים אחרים של המטריצה החוץ-תאית אם קיים אנזים הידרוליזה מתאים.

כדוגמה, זהו ספקטרום אולה של צילין תאית המו הקיים בגידול הביו-אנרגיה. גב' קאנוס כדי להשיג את הנתונים שהוצגו בזמן שחומר מעלה מקמפוס עוכל עם השין. להקצאת מבנים ליונים, עיין בפרוטוקול הנלווה.

זה עתה הראינו לכם את ההליך של פרופיל מסה של אוליגו מאר במדדים תאיים אקסו. פולימרים, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שניתן להשיג את התוצאות הטובות ביותר כאשר מתקבלות תוצאות מטריצה הומוגניות עבור ניתוח OV MS. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים.