Name: אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למדו את שיטת OLIMP לניתוח גליקנים בדפנות תאים צמחיים באמצעות MALDI-TOF MS. השיטה מאפשרת זיהוי וכימות יחסי של אוליגוסכרידים מדוגמים מינימליים ליישומים ביוטכנולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי OO0G01 להעניק Biosciences לאנרגיה של המכון.

השיטה OLIMP מודגמת על hemicellulose הגדולות להציג את קירות התא של צמחים dicot, xyloglucan, באמצעות endoglucanase כמו glycosylhydrolase. השיטה הוכיחה עם שתילים ארבידופסיס כולו כמקור רקמות הצמח. חומר מטריקס ו אנזימים תאיים ניתן להחליף בהתאם לניתוח המבוקש באמצעות ההליך אותו. 1. קיר בידוד נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Five קציר 5 ימים שתילים הישן ארבידופסיס כולו או כמות שווה של החומר הרצוי ולהעביר אותם לתוך צינור התגובה 1.5mL. ודא כי חומר ממוקם בתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שני כדורי מתכת 3mm אל הצינור תגובה על גבי המדגם Snap-להקפיא בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את המדגם קפואים באמצעות כדור הטחנה (02:30 דק ', 25Hz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL אתנול מימית 70% מהמדגם. הסר את כדורי מתכת באמצעות מגנט. וורטקס ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם בסל"ד 14,000 עבור 10min כדי גלולה שאריות אלכוהול מסיס המכיל את החומר דופן התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של פתרון כלורופורם / מתנול (01:01 v / v). וורטקס ביסודיות כדי resuspend גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם בסל"ד 14,000 עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הדגימה באמצעות concentrator. </li></ol> 2. Solubilization של אוליגוסכרידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור solubilization את פוליסכריד בפרט בצורה של אוליגוסכרידים שלה resuspend גלולה יבש 25μl של המאגר המתאים. עבור formate אמוניום endoglucanase 50mm, pH4.5, משמש. הוסף 0.2U של endoglucanase. ההשעיה וורטקס נוזל ספין למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם עבור 16h ב 37 ° C באינקובטור, רועד בכל 300rpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממס של לעכל (מים) באמצעות concentrator. </li></ol> 3. MALDI-TOF ניתוח של אוליגוסכרידים שוחרר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BioRex MSZ בתמורה 501 קטיון חרוזים שרף משמשים כדי להסיר מלחים האנזים מן המדגם מעוכל. מצבם חרוזים ידי הצבת aliquot בעמודה ריקה כביסה החרוזים עם כמויות של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5-10 חרוזים BioRex המדגם מתעכל מיובשים. ואז להוסיף מים 10μl, עבור כמויות קטנות יותר של חומר 5μl המים עשויים לשמש. לטבול את החרוזים בפתרון על ידי לחיצה קצרה מסובב את הצינור. דגירה לפחות 10min בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 2μl מטריקס (2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB), 10mg/ml במים) לצלחת יעד MALDI. להתאדות המטריצה ​​ממס תחת ואקום המוביל גבישים כימיים הומוגני מטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 2μl הפתרון מדגם desalted על גבי מטריצת הגבישים בצלחת היעד. אם אתה רוצה לזהות מספר גדול של דגימות רק לשמור על תצפית לכל היותר 3min. הפעם מסגרת מבטיח כי הדוגמה הראשונה הבחינו לא יבש עדיין. חכו 2min נוסף כדי להבטיח ערבוב יסודי של מטריקס מחדש מומס ומולקולות מדגם oligosaccharide במדגם הבחין האחרון. לאחר מכן יבש את הצלחת למקד תחת ואקום. תמהיל המדגם / מטריצה ​​צריך להתגבש תוך פחות 1min כדי לאפשר התגבשות הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת לתוך היעד ספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר במצב reflectron חיובי עם מתח מואץ של 20000V ו עיכוב של 350 ננומטר, את טווח המוני שנבחר צריך להיות 500-3000 דא (עשוי להשתנות תלוי oligomers צפוי). התחל ירי הלייזר ולאסוף 100-200 ספקטרה לפי המדגם, אשר נערך כדי ליצור ספקטרום נציג הממוצע (איור 2 א). יונים המייצג אוליגוסכרידים ספציפי ניתן לזהות על ידי המסה שלהם על יחס תשלום (m / z). עוצמות יון (גובה שיא) של כל היונים של עניין יש להוסיף עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של כל oligosaccharide במדגם (2B איור). </li></ol> 4. בניתוח OLIMP באתרו OLIMP יכול לשמש גם ישירות על רקמת השמטת כל צעד בהכנת הקיר. כדוגמה מולבן hypocotyls של ארבידופסיס כמקור רקמות הצמח משמשים. שוב, endoglucanase משמש כדי לקבוע את המבנה של xyloglucan hemicelluloses. אנזימים וחומרים רקמה ניתן להחליף בהתאם לניתוח המבוקש באמצעות ההליך אותו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שתיל מולבן ולמקם אותו לצלחת MALDI ריק היעד ולתת הנבט יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, מומס formate אמוניום 50mm, pH4.5) על הנבט יבש במיקום הרצוי. ודא כי ירידה אנזים נוגע חלקית את הצלחת היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת היעד MALDI בכלי סגור עם לחות להרוות להימנע כי הירידה אנזים מתייבש. דגירה את הצלחת בחדר עבור 16 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הצלחת היעד MALDI עם רקמות הצמח לבין ירידה אנזים תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5μl מטריקס (DHB: 10 מ"ג / ליטר) על גבי כל מקום אנזים יבשים. תן לזה לעמוד 2min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הצלחת היעד MALDI תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות עם MALDI-TOF. מניחים צלחת עם רקמת היעד ואת המקום אנזים / מטריקס (ים) לתוך הספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר במצב reflectron חיובי עם מתח מואץ של 20000V ו עיכוב של 350 ננומטר, את טווח המוני שנבחר צריך להיות 500-3000 דא (עשוי להשתנות תלוי oligomers צפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ירי הלייזר על גבי המטריצה ​​/ מדגם גבישים הבא לרקמה. הקפד לא לפגוע ברקמה עצמה, במקרה כזה את זמן הטיסה של מולקולות יהיה משם. איסוף סביב 20-50 ספקטרה לכל נקודה, אשר מופקים כדי ליצור ספקטרום נציג הממוצע (איור 3). יונים המייצג אוליגוסכרידים ספציפי ניתן לזהות על ידי המסה שלהם על יחס תשלום (m / z). עוצמות יון (יון גובה) ניתן לדווח על כל עניין יונים יש להוסיף עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של כל אוליגוסכרידים במדגם. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה לניתוח OLIMP של xyloglucan hemicelluloses נוכח שתילים ארבידופסיס מוצג באיור 2. בשל הבדלי המסה של יונים לבין האנזים מאופיין היטב ידוע (endoglucanase) סגוליות היונים ניתן להקצות מבנים oligosaccharide ספציפי (איור 2 א). ברור, איזומרים מבניים לא ניתן להבחין. הנחת היסוד לקביעת השפע היחסי של אוליגוסכרידים שונים (תרשים 2B) הוא מפרט המסה שלהם גורם לתגובה דומה מאוד עבור אוליגוסכרידים אלה. כפי שמוצג כאן, כימות OLIMP ניתנת לשחזור מאוד. עם זאת, יש לציין כי חוסנו של השיטה תלויה מאוד האות יחס רעש של יוני oligosaccharide שונים. לדוגמה זיהום עם מלחים או כמויות נמוכות של אוליגוסכרידים יכול להקטין את היחס. ניתוח OLIMP על הרקמה עצמה (בניתוח באתרו) מאפשר לימוד של אזורים קטנים מאוד מוגדרים כולל הכנת המדגם מעט מאוד. בדוגמה המוצגת כאן (איור 3) לא איכותי (יונים זהה) אך הבדלים כמותיים (וריאציה ב בעוצמות יון) נצפו בין הצילומים ואת השורש של רקמות הנבט ארבידופסיס. צירופים של שיטת-OLIMP יכול ובכך להוביל "הדמיה" רקמה. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה של הליך OLIMP באמצעות שתילים ארבידופסיס כולו כמקור צמח. ראשית, הרקמה macerated קיר התא חומר מוכן (תמונה שונה מן Fujino et al. 10). ואז אוליגוסכרידים של פוליסכריד קיר מסוים משתחררים באמצעות hydrolase ספציפיים. לבסוף, שכיחותם היחסית של אוליגוסכרידים מסיסים נקבעים באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. השפע היחסי של אוליגוסכרידים xyloglucan ב שתילים מולבן מ ארבידופסיס כפי שנקבע על ידי OLIMP. א) נציג xyloglucan oligosaccharide מסה ספקטרום; יון מייצג מבנה oligosaccharide ספציפי, איזומרים מבניים לא ניתן להבחין. ב) בר תרשים מקבילים להגדרה של שפע oligosaccharide יחסית. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. בניתוח OLIMP באתרו באמצעות שתילים מולבן של ארבידופסיס כדוגמה. אגל כל אנזים / עיכול (מעגלים צבעוניים) ניתן לנתח באופן עצמאי ספקטרה המונית המקביל ניתן להשיג ולנתח. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. הספקטרום OLIMP של xylan hemicellulose מתקבל על ידי לעכל חומר Miscanthus עלה עם xylanase (Megazyme).

<ol><li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li>
<li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li>
<li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xyloglucan-specific+endo-beta-1%2C4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus%3A+expression+cloning+in+yeast%2C+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li>
<li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa%3A+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation%3A+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+%22%5BJournal%5D)">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1%2C2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li>
<li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li>
<li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils%2C+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li>
<li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li>
<li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan%2C+a+major+primary+cell+wall+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li>
<li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+liquid+chromatography%2C+capillary+electrophoresis%2C+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן OLIMP מאפשר ניתוח רגיש מאוד ומהירה של פולימרים נוכח מטריצות תאיים. OLIMP משלב את שחרור האנזימטית של oligomers עם ניתוח MALDI-TOF הבאים. הדור של הספקטרום MALDI-TOF לוקח פחות מדקה, ולכן OLIMP מתאים למגוון רחב של יישומים, כולל תפוקה גבוהה מחקרים כגון מסכי מוטציה. OLIMP אינו מוגבל סוכרים צמח אך עלולה להיות מיושם על מגוון רחב של פולימרים, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים hydrolytic ספציפיים. עם זאת, מגבלה של OLIMP הוא שפע מוחלט של הפולימר לא ניתן להשיג. כפי שהוזכר קודם לכן OLIMP ניתן להשתמש כדי ללמוד את המבנה של מגוון רחב של סוכרים המצויים המטריצה ​​תאיים של מגוון המינים. כדוגמה, איור 4 מייצג ספקטרום OLIMP של hemicellulose העיקרי מינים הדשא, xylan. כאן, דופן התא חומר הנגזר הדשא Miscanthus ממוזג היה מתעכל באמצעות xylanase.

<table><tbody><tr><td>2,5-דיהידרוקסיבנזואית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL במים</td></tr><tr><td>שרף BioRex MSZ 501(D)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>אנדוגלוקנאז</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Xylanase M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>כדורי מתכת בקוטר 3 מ"מ</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>טחנה פעימה (Beat mill)</td><td>Retsch</td><td>טחנת ערבול MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>לוחית מטרה ל-MALDI</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>סועג ואקום</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

אוליגו פרופיל המוניים (olimp) של סוכרים תאית

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

מגע ישיר של תאים בסביבה מתווכת באורגניזמים רבים על ידי מטריקס תאיים. היבט אחד משותף של מטריצות תאיים היא שהם מכילים סוכר moieties מורכבים בצורה של גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו / או סוכרים. דוגמאות כוללות את תאי מטריקס של בני אדם ותאי בעלי חיים המורכב בעיקר חלבונים proteoglycans או סיבי פוליסכריד המבוסס קירות התא של צמחים ופטריות, ואת proteoglycan / glycolipid קירות התא של חיידקים מבוסס. כל glycostructures אלו ממלאים תפקידים חיוניים בתא אל התא תקשורת התא אל הסביבה איתות. דוגמה יוצאת דופן של מטריצה ​​מורכבת תאיים קיים קירות בתאי צמח גבוה יותר. הקיר שלהם מורכב רובו ככולו של סוכרים, עד 75% ממשקלה היבש, והוא מורכב biopolymers הנפוץ ביותר כיום על פני כדור הארץ. לכן, המחקר נערך כיצד לנצל את החומרים האלה בצורה הטובה ביותר משאב פחמן ניטרלי מתחדשת להחליף פטרוכימיה שמקורם בדלק מחצבי. האתגר העיקרי לגיור דלק נשאר סרבנות קירות השפלה אנזימטית או כימי בשל glycostructures ייחודי נוכח biocomposite ייחודי זה. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של תא צמח glycostructures הקיר. שיטה זו המוניים אוליגו Profiling (OLIMP) מבוססת על שחרורו האנזימטית של אוליגוסכרידים מחומרים הקיר בהנחיית glycosylhydrolases ספציפיים ניתוח בדיעבד של תערובות oligosaccharide solubilized באמצעות מטריצה ​​בעזרת לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS ) 1 (איור 1). OLIMP דורש קירות רק 5000 תאים לניתוח מלא, ניתן לבצע על הרקמה עצמה 2, ניתנת תפוקה גבוהה ניתוחים 3. אמנם הסכום המוחלט של אוליגוסכרידים solubilized לא ניתן לקבוע על ידי OLIMP השפע היחסי של יונים oligosaccharide השונים ניתן התחום מן הספקטרום המונית נותן תובנות לגבי דפוס, החלפה של פוליסכריד הילידים נוכח הקיר. OLIMP ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון רחב של פולימרים הקיר, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים ספציפיים 4. לדוגמה, לניתוח של פולימרים הנמצאים בתא אנזימים צמחיים הקיר זמינים לנתח את xyloglucan hemicelluloses באמצעות xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylan באמצעות Endo-β-(1-4), xylanase 6,7 , או סוכרים pectic באמצעות שילוב של polygalacturonase לבין methylesterase 8. יתר על כן, באמצעות אותם עקרונות של OLIMP glycosylhydrolase ואפילו פעילויות glycosyltransferase ניתן לנטר נקבע 9.

הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

מגע ישיר של תאים עם הסביבה מתווך באורגניזמים רבים על ידי מטריצה חוץ-תאית. היבט נפוץ אחד של מטריצות חוץ-תאיות הוא...

פרופיל מסת האוליגומרים או ניסוי ה-Olympic המוצג כאן מאפשרים להשיג תובנות מהירות לגבי מבנה הפולימרים במטריצה החוץ-תאית או בדופן התא של אורגניזם. במקרה זה, דופנות תא מוכנות משתילי צמחים על ידי הסרה ראשונית של רכיבים תאיים באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, פולימר הדופן המטרה מעוכב עם הידרולאזה ספציפית הממיסה רכיבי דופן מסוימים בצורה של אוליגומרים.גישה חלופית היא לעיקר את דופן התא באמצעות האנזים ב-C two ישירות על הרקמה. השפעיות היחסית של הליגננים ששוחררו נקבעת באמצעות MALDI-mass spectrometry וניתוח סטטיסטי. שלום, אני מרקוס פולי ממכון למדעי הביולוגיה של אנרגיה כאן באוניברסיטת קליפורניה בברקלי.שלום, אני מרקוס רי. ואני אשה גילר. גם אנחנו ממכון למדעי הביו-אנרגיה (Energy Biosciences Institute). אורגניזמים מוקפים במטריצות חוץ-תאיות שבהתאם לאורגניזם מורכבות מרשתות פולימרים מורכבות.דרך מהירה ורגישה להערכת המטריצה החוץ-תאית היא שיטה שאנו מכנים פרופיל מסה אולי (oli mass profiling), או בקיצור oleum, אותה נדגים לכם היום. ניתן לבצע הליך זה גם ישירות על רקמת הצמח. אז בואו נתחיל.התחילו את הפרוצדורה על ידי בידוד המטריצה החוץ-תאית או דופן התא של רקמות צמחים. קצרו חמישה שתילים של arabidopsis או כמות שווה של חומר צמחי אחר והעבירו אותם לפראגרפ תגובה של 1.5 מיליליטר. ודאו שהחומר ממוקם בתחתית הפראגרף.הוסיפו שני כדורי מתכת בקוטר שלושה מילימטרים לנבובת התגובה והקפיאו באופן מיידי בחנקן נוזלי. לאחר מכן, גרסו את הדגימה הקפואה באמצעות טחנת כדורים למשך 2.5 דקות בתדר של 25 hertz. לאחר גריסת החומר, הוסיפו לדגימה מיליליטר אחד של ethanol מימי בריכוז 70%.הסיר את כדורי המתכת באמצעות מגנט ובצע ערבוב רב-מבזק (vortex) יסודי. טיפול זה ממיס את מרבית החלבונים ואת אברוני התא. סנטריפוג את הדגימה במהירות של 14,000 RPM למשך 10 דקות כדי לשקיע את השאריות הבלתי ממיסות באלכוהול, המייצגות את חומר דופן התא. שאב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע למשקע.הוסיפו 1 mL של תמיסת כלורופורם-מתנול למשקע שנותר במבחנה וערבבו היטב באמצעות וורטקס. כדי להחזיר את המשקע לתרחיף, סובבו בצנטריפוגה; תמציות הכלורופורם-מתנול ממיסות תרכובות הידרופוביות כגון ליפידים. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, הסירו את הנוזל העליון ויבשו את המשקע לחלוטין באמצעות צנטריפוגת ואקום. פעולה זו משלימה את בידוד חומר דופן התא, שניתן כעת לעבד לצורך הפקת ליגננים ספציפיים.הדוגמה המוצגת כאן היא המסה של Xlo glucan, ההמיצלולוז העיקרי הנמצא בדפנות התאים של צמחים דו-פסיגיים כגון Arabidopsis. Xlo glucan הוא פולימר המורכב משלד גלוקאן המוחלף באופן נרחב בשאריות סוכר אחרות. להמסת פולימר זה, נעשה שימוש ב-endo glucan פטרייתי להמסת המיצלולוז. השעה מחדש את משקע דופן התא המבודד והיבש ב-25 µL של ammonium formate בריכוז 50 mM ב-pH 4.5 והוסף 0.2 units של endo gluconate. ערבב את התוך suspension בעזרת וורטקס וסנטריפוז את הנוזל עד להשקעה.הניחו את המבחנה במיקסר והנחו לדפנות להתעכל במשך 16 שעות ב-37 degrees Celsius עם ניעור. ב-300 RPM. כאשר עיכול דופן התא המבודדת הושלם, הסירו את הממס באמצעות צנטריפוגת ואקום והמשיכו לניתוח האוליגוסכרידים ששוחררו באמצעות ספקטרומטריית מסות; מלחים ואנזים מוסרים מהדגימה המעוכלת באמצעות חרוזי שרף להחלפת קטיונים מ-Biox MSD 5 0 1.ראשית יש להכין את החרוצים על ידי הנחת הכמות הדרושה בעמודה ריקה ושטיפת החרוצים בכמויות רבות של מים. יש להוסיף חמישה עד 10 חרוצי biox cation שהוכנו לדגימה שעברה עיכול וייבוש. לאחר מכן, יש להוסיף 10 µl מים עבור כמויות קטנות יותר של חומר.ניתן להשתמש בחמישה מיקרוליטרים של מים. טבול את החרוזים בתמיסה על ידי צנטריפוגה קצרה של המבחנה, והדגר למשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר בזמן שהעיכול מדגרי עם החרוזים. טפטף שני מיקרוליטרים של מטריצת DHB על גבי לוח מטרות MALDI.יש לאדות את ממס המטריצה תחת ואקום עד להיווצרות גבישים כימיים של המטריצה, ולאחר מכן להניח שתי מיקרוליטרים של תמיסת ה-Desalted Digest על גבי גבישי המטריצה בלוח המטרה. יש לאדות שוב תחת ואקום את הממס של נקודת המטריצה של הדגימה.חשוב לשמור על משך זמן מתאים לערבוב של נוזל מטריצת הדגימה לפני הגביש, כפי שמתואר בפירוט בפרוטוקול הכתוב המצורף. לאחר שהדגימה התייבשה, מקמו את פלטת היעד בתוך ספקטרומטר מסות MALDI. הגדירו את המכשיר למצב חיובי עם מתח האצה של 20,000 וולט והשהיה של 350 ננומטרים.טווח המסה שנבחר עבור רצועות חצי-צלולוז אלו הוא 500 עד 3000 Daltons. יש לשנות את טווח המסה בהתאם לגודל הרצועות הצפויות. התחילו את ירי הלייזר ואספו 100 עד 200 ספקטרומים לכל דגימה, אשר יאוחדו ליצירת ספקטרום ממוצע מייצג.זהו ספקטרום ה-oly של המי-צלולוז. שיטת ה-oly המוצגת בסרטון זה יכולה לשמש גם ישירות על רקמת הצמח, ללא צורך בשלבי הכנת דופן התא. הליך אנליזה זה in situ מוצג על נבטי arabidopsis שגודלו בחושך.מניחים את הדגימה ישירות על פלטת מטרה ומייבשים באוויר עד שהשתיל על הפלטה יבש. מוסיפים 0.5 µL של תערובת בופר האנזימים המתאימה במיקומים הרצויים. יש לוודא שטיפת האנזים נוגעת באופן חלקי הן ברקמה והן בפלטת המטרה.הנח את פלטת מטרות ה-maldi בתוך מיכל סגור עם לחות רוויה כדי למנוע התייבשות של טיפות האנזים. דגור את הפלטה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C. עם סיום תקופת הדגירה, ייבש את נקודות האנזים תחת ואקום והוסף 0.5 µL של מטריקת DHB נוזלית מעל כל נקודת אנזים מיובשת.לאחר מכן, ייבשו את פלטת היעד של ה-MALDI תחת ואקום. כדי לנתח את שני הדגימות של ה-NC, הכניסו את פלטת היעד, כולל דגימת הרקמה ונקודות המטריקס של האנזים, לתוך ספקטרומטר מסות רב-חלקי כדי להקליט ספקטרום מסות, תוך שימוש באותן הגדרות ששימשו עבור דגימת דופן התא המבודדת.התחילו בהקרנת הלייזר על המטריצה. דגמו גבישים הסמוכים לרקמה. ודאו שאינכם פוגעים ברקמה עצמה, שכן במקרה כזה, זמן המעוף של המולקולות יהיה שגוי.אספו כ-20 עד 50 ספקטרומים לכל נקודה ורכזו אותם כדי ליצור ספקטרום ממוצע מייצג. זהו ספקטרום ממוצע מייצג של האוליגוסכרידים הגזורים מה-HemosIL glucan שנמצא ב-AOPs. עצילי השתילים, עוצמות היונים או גובה היונים של כל היונים הרלוונטיים מסוכמים עד ל-100%, מה שמעניק את השפע היחסי של האוליגוסכרידים השונים.התוצאה של שיטת ה-NC two OMP נותנת תוצאות דומות. ניתן לנתח באופן עצמאי כל טיפת עיכול אנזימטי המסומנת בעיגול צבעוני, ולהפיק ולנתח את ספקטרומי המסות המתאימים. ניתן לבצע Oola גם על פולימרים אחרים של המטריקס החוך-תאי אם קיים אנזים הידרוליזה מתאים.כדוגמה, זהו ספקטרום oola של ה-hemo cellulose cylin הנמצא בגידול הביו-אנרגיה. Ms.Canus השיגה את הנתונים המוצגים בעוד שחומר מעלה mecampus עוכר עם xin. להקצאת מבנים לאיונים, אנא עיינו בפרוטוקול המצורף.הדגמנו בפניכם כעת את הליך ניתוח מסתות האוליגומרים (oligo mar mass profiling) במטריקות חוץ-תאיות. כאשר מבצעים הליך זה, חשוב לזכור כי ניתן להשיג את התוצאות הטובות ביותר כאשר מתקבלות תוצאות מטריצה הומוגניות עבור ניתוח ה-OV MS. וזהו זה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים.

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

מקור: הו, י. ואחרים. ניתוח אינטראקציות בין אנדוביוטיקה למיקרוביום המעי האנושי באמצעות מערכות תסיסה במבחנה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) להערכת פירוק אקסופוליסכרידים (EPS) על ידי מיקרוביום צואה אנושי. קטעי EPS בסופרנטנטים של תסיסה מופרדים לפי גודל וקוטביות באמצעות TLC, ואז מוצגים כרצועות צבעוניות לאחר צביעה ספציפית לפחמימות.

ביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה להערכת פירוק אקסופוליסכריד חיידקי

על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

אנו מציגים שיטה מודולרית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של אקסופוליסכרידים מיקרוביאליים בקנה מידה קטן. שיטה זו משלבת בחירה מוקדמת מהירה לניתוח הכמות הכוללת של פוליסכרידים המופרשים עם טביעת אצבע מפורטת של פחמימות כדי לאפשר סינון מהיר של זני חיידקים שבודדו לאחרונה או אוספי זנים שלמים.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקות הספציפיות המשמשות לאפיון מבני של רצפי גליקוזיל מפחיתים (RE) ואזור פנימי של הטרוקסילנים על ידי תיוג ה-RE עם 2 אמינובנזמיד לפני הידרוליזה אנזימטית (אנדוקסילאנאז) ולאחר מכן ניתוח של האוליגוסכרידים המתקבלים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

מאמר זה מתאר מתודולוגיה להכין דגימות רקמות וכלי דם לצורך ניתוח MS המאפשרת (1) ניתוח של הרכב החלבון ECM, (2) זיהוי של אתרי glycosylation, ו (3) אפיון ההלחנה של צורות glycan. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM ברקמות אחרות.

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

פרוטוקול זה מתאר עיבוד תמונה מבוסס iSCAT וגישת מעקב אחר חלקיקים בודדים, המאפשרת חקירה סימולטנית של המסה המולקולרית וההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולות המקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים. הוראות שלב אחר שלב להכנת דגימה, המרה המונית לניגודיות, רכישת סרטים ועיבוד לאחר עיבוד מסופקות לצד הוראות למניעת מלכודות פוטנציאליות.

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחרור O-גליקנים ממוצין, והתפלה, פרמתילציה וניתוח לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

פרופיל של מוצין O-גליקנים פרמתילציה באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה

למדו את שיטת OLIMP לניתוח גליקנים בדפנות תאים צמחיים באמצעות MALDI-TOF MS. השיטה מאפשרת זיהוי וכימות יחסי של אוליגוסכרידים מדוגמים מינימליים ליישומים ביוטכנולוגיים.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

גלה סרטונים נוספים