Name: FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד כיול חיישנים ביולוגיים משולבי FRET לפרופיל מטבולי לא פולשני. השיטה מאפשרת ניטור בזמן אמת של רמות גלוקוז וגלוטמין תוך תאיים לשיפור בקרת ביופרוססים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופ &#39;וולף פרומר (מכון קרנגי למדע, אוניברסיטת סטנפורד) לחביבות לתת לנו גלוקוז סריג פלסמיד וד&quot;ר Uwe Ludewig (אוניברסיטת הוהנהיים) לחביבות אספקת גלוטמין סריג לבנות בוקטור ביטוי צמח pUTKan. א.ב. ממומן על ידי תכנית studentships עדיפות BBSRC ממוקדת. CK וKP שניהם נתמכים על ידי מלגות RCUK בBiopharmaceuticals עיבוד. CK גם מבקש להודות ביולוגי Lonza לתמיכה הכספית שלהם. המרכז לביולוגיה וחדשנות סינתטיות נתמך בנדיבות על ידי EPSRC.

1. תחיית שורת תאים ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיות תאי CHO ב9 מיליליטר בינוני CD-CHO בתוספת 8 מ&quot;מ L-גלוטמין ו10 תוסף מיליליטר / L hypoxanthine 100x / תימידין (מדיום גידול שלם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 5 דקות 100 XG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10 מיליליטר של מדיום גידול שלם טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם 1 מ&quot;ל ולקבוע את ריכוז תאי קיימא על ידי מיקרוסקופ אור בשיטת הרחקת צבע הכחולה trypan בhemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום תרבות בצפיפות זריעה של 3 x 10 5 תאים / מיליליטר ב125 מיליליטר לנער צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התרבות בחממה על 37 מעלות צלזיוס, אווירת humidified של 5% CO 2, על פלטפורמה רועדת מסלולית מסתובבת ב120 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת כל 3-4 ימים במדיום גידול המלא בצפיפות זריעה של 2 x 10 5 תאים / מיליליטר. </li></ol> 2. Transfection של הקו הסלולרי עם פלסמיד Containing ג&#39;ין Biosensor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים בתנאים המתאימים (37 ° C CO, 5% 2) 12-24 שעה לפני transfection כדי להבטיח את התאים באופן פעיל בחלוקה בזמן של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות שיטת הדרת צבע הכחולה trypan, ואז להכין עבודה נפח 20 מיליליטר של תרבית תאים ב125 מיליליטר ללחוץ את הבקבוק בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת transfection מתאימה לשורת התאים בשימוש. פלסמיד דנ&quot;א יחס ריאגנטים transfection יהיה תלוי בקו הסלולרי וקטורית. מומלץ כי זה מותאם על ידי בדיקת טווח של יחסים בטווח שצוינו על ידי היצרן לפני ביצוע transfections הסופי. כמו כן לשמור על תרבות ביקורת שלילית לפחות אחד המכילה את התאים, אך לא ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 4 ימים במצב סטטי ולאחר מכן להעביר לשאקיפלטפורמת ng מסתובבת ב125 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת פלסמיד לריכוז מתאים כפי שנקבע על ידי עקומה להרוג. במחקר זה, Zeocin התווסף לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם / מיליליטר לבחירה של תאי transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת במרווח זמן מתאים לשורת התאים, והוסיף אנטיביוטיקה בכל פעם, עד שתאים ובשליטתם מתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בבארות המחוברות ביותר כדי להתקדם לטלטול תרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים בנק תא על ידי הקפאת התאים בבקבוקונים המכילים קריוגני 10 7 תאי קיימא ב 1 מיליליטר של תערובת הקפאה. בעבודה זו, זה מורכב מ92.5% מדיום גידול ו7.5% sulfoxide דימתיל. </li></ol> 3. אצווה ועקומת גדילה תאי הפד אצווה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר הוראות לתחזוקת תא שמעל להקים תרביות תאים שלושה עותקים של תאי CHO transfected ב250 מיליליטר לנער צלוחיות עם נפח עבודה של 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור cultuמיל בחממה humidified תא על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, על פלטפורמה רועדת מסלולית מסתובבת ב125 סל&quot;ד, ולהסיר 4.1 מיליליטר דגימות מכל תרבות גדלה ב24 מרווחי שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במדגם 100 μl כדי לקבוע את כדאיות ריכוז תא ותא קיימא עם שיטת הדרת צבע הכחולה trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד ריכוז תאי קיימא מצטמצם לאפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור תרביות תאי הפד אצווה להשלים עם הכמות המתאימה של גלוקוז או גלוטמין ביום 6 לשחזר ריכוזיהם לערכיהם הראשוניים של 36 מ&quot;מ ו 4 מ&quot;מ, בהתאמה. מומלץ תרבויות שליטה נוספת גם נשמרות, שהם שיאכילו עם אותו הנפח (12 מיליליטר במקרה זה) של מים טהורים. </li></ol> 4. סריג מדידות יחס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 מיליליטר של הדגימות יומיות הוסר בשלב 3.2 לעיל וצנטריפוגות ב 5 דקות 100 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspסיימתי את התא גלולה ב 2 מיליליטר של תמיסת מלח קרח קר פוספט (PBS). העבר את זה לצלחת 6 היטב ולהוסיף מדגם ריק המכיל לא תאים לאחד טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את רמות הקרינה כחולה וצהובה באופן מיידי בגל עירור של 430/435 אורכי גל nm ופליטה של ​​465/435 ננומטר (כחול) ו520/510 ננומטר (צהוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יחסי סריג (יחס של הקרינה צהובה זוהתה על הקרינה כחולה המזוהה). </li></ol> 5. המטבוליט מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 מיליליטר של הדגימות יומיות הוסר בשלב 3.2 לעיל וצנטריפוגות ב 5 דקות 100 XG ב 4 ° C. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 3 קרח מיליליטר PBS הקר ו צנטריפוגות שוב בדקות 5 100 XG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מיליליטר PBS הקר הקרח כאמור לעיל. Sonicate 5x המדגם עבור 3 דקות כל אחד בדופק של 15 שניות וב15 שניות משם. בשלב זה, התא נוסףCTS עשוי להיות מוקפא אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת assay גלוקוז מתאימה לפי הוראות היצרן על דגימות של תמציות תא כדי לקבוע את ריכוז הגלוקוז התוך התאי (ראה טבלה של חומרים). הערה: השתמש בסטנדרטים מתאימים לבניית עקומת סטנדרט. בעבודה זו, הריכוז של סטנדרטים נע בין 0-100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקריאה לסטנדרטים, לבנות את עקומת הסטנדרט ולמצוא את המשוואה ליניארית בכושר הטוב ביותר (במקרה זה: y = 1310.51x - 723.43 בי y הוא קריאת הספיגה וx הוא ריכוז גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוזי הגלוקוז באמצעות עקומת הסטנדרט ולוקח את הדילול בחשבון. ריכוז הגלוקוז התוך התאי ואז יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הזאת: <img alt="" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" /> לתאי CHO, אחד נפח התא חושב באמצעות קוטר תא של 12 מיקרומטר 12 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת assay גלוטמין מתאימה לפי הוראות היצרן על דגימות של תמציות תא כדי לקבוע את ריכוז גלוטמין תאיים (ראה טבלה של חומרים). הערה: השתמש בסטנדרטים מתאימים לבניית עקומת סטנדרט. בעבודה זו, הריכוז של סטנדרטים נע בין 0-2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו ב5.5 לעיל, לבנות את עקומת הכיול (במקרה זה y = 203.1x + 17.1 בי y הוא קריאת הספיגה וx הוא ריכוז גלוקוז) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עקומת הסטנדרט, לחשב את ריכוז גלוטמין של הדגימות, לוקח את הדילול בחשבון. ריכוז גלוטמין תאיים יכול להיות מחושב באמצעות משוואה 1 לעיל. </li></ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
<li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li>
<li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li>
<li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+J.+Sel.+Top.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels%E2%80%94the+Holy+Grail+in+muTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li>
<li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li>
<li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li>
<li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li>
<li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li>
<li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li>
<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li>
<li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+binding+proteins%3A+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

FIBS לאפשר in vivo ו בquantitation באתרו של מולקולות מרכזיות, במקרה זה חומרים מזינים הגבלת צמיחה, הסרת אי ודאות הנובעת ממרווה ומיצוי שיטות. הממצאים מראים כי קיים מתאם טוב בין אות שקרים ואת הריכוזים תאיים בטווח של 1-5 מ&quot;מ לגלוקוז ו0.3-2 מ&quot;מ לגלוטמין. בתרבית תאים אצווה CHO, ריכוזים אלה נתקלו בשלבי הירידה מעריכית, נייחים, ומוקדם. שלבי מעריכי ונייחים הם הקריטיים ביותר במונחים של העיצוב של אסטרטגיות האכלה מתאימות; שימוש biosensors אלה להערכת דרישות חילוף החו...

יש ניטור המטבוליט יישומים שונים בbioprocessing, כוללים פיתוח תהליך, תקשורת ועיצוב מזון, והנדסה מטבולית. שיטות שונות זמינות עבור מדידות ריכוז באמצעות האנזימטית 1, 2 כימי, או מבחני מחייבים 3. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של הריכוז תאיים של מטבוליטים מפתח המבוסס על חלבונים. במבחני נפח נמוכים במיוחד, הקרינה היא כלי נוח כמו מזעור ממש משפר את 4,5 יחס אות לרעש וחיישנים המבוססים על חלבונים יכולים להיות מקודד גנטי משמעות שאין חומרים כימיים אקסוגניים נחוצים לניתוח המטבוליט. biosensors העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) מורכב משני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג הוא העברת nonradiative של אנרגיה מתורם צילום נרגש locat מולקולת ניאון acceptor<html> אד בסמיכות (&lt;100). מחשוף יגנד או מחייבים גורם לשינוי קונפורמציה בחיישן, אשר, בתורו, גורם לשינוי בקרבתו של fluorophores, מה שמוביל לשינוי בסריג יעילות שנמדד על ידי השינוי בספקטרום הפליטה. חיישני סריג משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצרים constitutively בתוך קו התא והמאפיינים ספקטרליים שלהם לשנות מבוססים על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. יש לי FIBS זמני תגובה מהירה שהופך אותם אידיאליים עבור מדידות לדגמים דינמיים 6. יישומים קודמים כוללים ניטור אחת 7-9 ומרובים 10 מטבוליטים ומספקים נתונים על חלוקת spatiotemporal 11. ניתן ליצור FIBS בשתי תצורות: Apo-מקס, שבו ליגנד מחייב משבש את הקרבה של fluorophores הפחתת העברת אנרגיה וApo-מינ &#39;, שבו ליגנד מחייב מביא שני fluorophores במגע קרוב יותר (איור 1). _content &quot;&gt; בעבודה זו, פרוטוקול שהוצג לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS למטבוליט, גלוקוז או גלוטמין. המתודולוגיה הוא הוקם עבור הכיול של החיישן in vivo כדי לאפשר כמותיים עתיד מדידות של ריכוז המטבוליט תאיים, כפי שהוצגו באיור 2. על בסיס זה, הריכוז תאיים של גלוקוז או גלוטמין ניתן לקבוע בתרביות תאים שייזונו אצווה CHO, שלשני חומרים מזינים נוספו בריכוזים גבוהים בתהליך. התוצאות להוכיח כי שימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, בצורה מדויקת חיזוי של הריכוז תאיים הוא אפשרי, כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכנולוגיות אנליטיות הנוכחיות משום שהיא עלות נמוכה לא פולשנית, ומהיר, נותן אות של FIBS שיכול להיות יום שני בזמן אמתitored לאורך כל התרבות.

<table><tbody><tr><td>CHO-S Cells</td><td>Life Tecnologies</td><td>11619-012</td><td>קו התאים ישתנה בהתאם למטרות המחקר</td></tr><tr><td>pCDNA4/TO וקטור&nbsp;</td><td></td><td></td><td>טכנולוגיות חיים</td></tr><tr><td>TransIT-PRO מגיב טרנספקציה</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>ניתן לבצע טרנספקציות באמצעות כל שיטה המתאימה לקו התאים הנחקר</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO מדיום</td><td>חיים</td><td>טכנולוגיות חיים 10743-011</td><td>מדיום גידול תאים תלוי בתאים הנחקרים</td></tr><tr><td>100x HT Supplement</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ (פי 100),</td><td>טכנולוגיות חיים נוזליות</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות InfinitePRO 200</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>ניתן להחליף כל קורא צלחות פלואורסצנטי בעל 96 בארות שיכול לגשת לאורכי הגל הנדרשים</td></tr><tr><td>מסננים לקורא צלחות</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep ערכת טיהור פלסמיד</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>ניתן להחליף כל ערכה מתאימה</td></tr> ערכת <tr><td>בדיקת גלוקוז/גלוקוז אוקסידאז אדום</td><td>Amplex Invitrogen</td><td>A22189</td><td>ניתן להחליף כל ערכה מתאימה</td></tr><tr><td>EnzyChrom&nbsp; ערכת בדיקת גלוטמין</td><td>BioAssay Systems</td><td>EOAC-100</td><td>ניתן להחליף כל ערכה מתאימה</td></tr><tr><td>משופר Neubauer hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td>נואיר</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

fibs מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

בעידן של ביולוגיה חישובית, מערכות ניסיוניות תפוקה גבוהה חדשות הן הכרחיות על מנת לאכלס ולשפר דגמים, כך שהם יכולים להיות תוקף למטרות חזויה. באופן אידיאלי מערכות כאלה יהיו בנפח נמוך, שאינו מאפשר ניתוח דגימה והרסני כאשר הנתונים כמובן זמן הם כדי להתקבל. מה שדרוש הוא בכלי ניטור אתר שיכול לדווח את המידע הדרוש בזמן אמת וnoninvasively. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של ריכוזים תאיים המבוסס על חלבונים. סוג מסוים אחד in vivo biosensors כי יש למצוא יישומים בכימות המטבוליט מבוסס על העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג חיישנים משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצר constitutively בתוך הקו הסלולרי, יש להם זמני תגובה מהירה וצ&#39;ה הרפאים שלהםracteristics לשנות מבוסס על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. במאמר זה, השיטה לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS לגלוקוז וגלוטמין וכיול FIBS in vivo בתרבית תאים אצווה על מנת לאפשר כימות עתיד של ריכוז המטבוליט תאיים מתוארת. נתונים מתרביות תאים האכילו אצווה CHO מוכיחים כי FIBS הצליח בכל מקרה כדי לזהות את השינוי וכתוצאה מכך הריכוז תאיים. השימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, הריכוז תאיים היה מדויק ייקבע כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי.

סקירה של המתודולוגיה מוצגת באיור 2. בעבודה שהוצגה במסמך זה, תאי CHO היו transfected עם וקטור השקרים ושורות תאי יציבות נבחרו בלחץ אנטיביוטי של 400 מיקרוגרם / מיליליטר Zeocin. שתי שורות תאי יציבות נפרדות constitutively מבטאות את חיישני גלוקוז וגלוטמין נוצרו לכן. איור 1 מתאר את התצורות של שני biosensors שימש במחקר זה. חיישן גלוקוז מבוסס על עיקרון Apo-מקס ופלסמיד המתאים הוא pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. זו היא שילוב של החלבון המשופר ציאן הניאון (ECFP...

תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר באופן לא פולשני את רמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיים באמצעות ביו-סנסורים מבוססי חלבון המקודדים גנטית. הדבר מושג תחילה על ידי טרנספקציה של התאים הרלוונטיים באמצעות פלסמיד המכיל את הגן של הביו-סנסור, ובחירת התאים המבטאים את הביו-סנסור. בשלב השני, נלקחים דגימות תרביות תאים מתרביות batch או fed-batch, ומודדות את יחסי ה-FRET שלהם.ניתן לקבוע את ריכוז הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאי של הדגימות באמצעות בדיקה עצמאית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ביחס ה-fret של הדגימות כדי לחשב את הריכוז התוך-תאי של גלוקוז או גלוטמין באופן לא פולשני ובזמן אמת. ההשלכות של טכניקה זו פונות לשיפור ביו-תהליכים, שכן זוהי שיטה מהימנה להשגת מידע מטבולי בזמן אמת שניתן להשתמש בו לאופטימיזציה ובקרה מקוונת.אף שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבל תובנות לגבי עיבוד ביולוגי (bioprocessing), ניתן להשתמש בה גם במערכות אחרות, כולל זיהוי סממני מחלה. התחילו בהחייאת תאי CHO בתשעה מיליליטרים של מצע גידול מלא. לאחר מכן, סובבו את התאים במ centri-fuge, השעיקו מחדש את המשקע ב-10 מיליליטרים של מצע גידול טרי, וספרו את התאים באמצעות שיטת dye exclusion של trypan blue.בשלב הבא, התחל תרבית בצפיפות זריעה של 3×10⁵ תאים למילליליטר בבקבוקי שייקר בנפח 125 מיליליטר, בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 על פלטפורמת ניעור אורביטלית. בסיבוב של 125 RPM, בצע תת-תרבית לתאים כל שלושה עד ארבעה ימים במצע גידול מלא בצפיפות זריעה של 2×10⁵ תאים למילליליטר לצורך טרנספקציית תאים.שמרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 12 עד 24 שעות לפני הטרנספקציה, כדי להבטיח שהתאים נמצאים בחלוקה פעילה. לאחר הכנת ה-plasmid DNA, ספרו את התאים באמצעות צביעת trypan blue ודללו את התאים לנפח עבודה של 20 milliliters של מצע גידול תאים. השתמשו בבקבוק שילום (shake flask) של 125 milliliters בריכוז של 1×10⁶ תאים ל-milliliter.השתמש בערכה מתאימה לטרנספקציה עבור שלב התאים שבשימוש, הכוללת לפחות באר ביקורת שלילית המכילה תאים אך ללא DNA. הדגר את התאים שעברו טרנספקציה למשך ארבעה ימים במצב סטטי. כעת הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת הפלסמיד בריכוז הולם, כפי שנקבע על ידי עקומת הריגה (kill curve).לדוגמה, במחקר זה, zin הוסף לריכוז סופי של 400 grams per milliliter לצורך סלקציה של התאים שעברו טרנספקציה, ולאחר מכן הועברו התרביות למנער (shaking platform) המסתובב במהירות של 125 RPM. יש להחליף את המצע במרווחי זמן המתאימים לשורת התאים, ולהוסיף אנטיביוטיקה בכל פעם עד למות התאים בבאר הביקורת. השתמש בבארים בעלות הצפיפות (confluence) הגבוהה ביותר כדי להמשיך לתרביות המנוערות.לאחר מכן, הקפיאו את התאים במבחנות קריוגניות המכילות 1×10⁷ תאים חיוניים ב-1 mL של תערובת הקפאה, כדי להפיק עקומות גדילה של אצווה (batch) ואצווה מוזנת (fed-batch). ראשית, הקימו תרביות תאים בשלוש חזרות של תאי CHO שעברו טרנספקציה בבקבוקי ניעור בנפח של 250 mL עם נפח עבודה של 50 mL. לאחר מכן, הניחו את התרביות באינקובטור תאים מלחח עם ניעור, ודגמו 4.1 mL מכל תרבית גדלה במרווחי זמן של 24 שעות. עבור תרביות ה-fed-batch, הוסיפו לתאים את הכמות המתאימה של גלוקוז או גלוטמין ביום השישי כדי להחזיר את ריכוזיהם לערכיהם ההתחלתיים.בזמן ההאכלה של תרביות הביקורת בנפח זהה של מים מזוקקים, השתמשו ב-100 µL מתוך הדגימות של 4.1 מ-4.2 מדי יום כדי לספור את התאים באמצעות שיטת הדחיית צבע טריפאן כחול (trypan blue dye exclusion), עד שריכוז התאים החיים יירד לאפס. כדי לקבוע את מדידות יחס ה-FRET, סבבו במצמדת (צנטריפוגה) 2 mL מהדגימות היומיות והשעיקו מחדש את המשקע ב-2 mL של PBS קר בקרח. העבירו חצי מתרחיף התאים לפלטה בעלת 6 בארות והוסיפו לבארה אחת דגימת רקע (blank) שאינה מכילה תאים. לאחר מכן, מדדו מיד את רמות הפלואורסצנציה הכחולה והצהובה באורך גל עירור של 430 nm עם רוחב פס של 35 nm, ובאורכי גל פליטה של 465 nm עם רוחב פס של 35 nm ו-520 nm עם רוחב פס של 10 nm עבור הפלואורסצנציה הכחולה והצהובה, בהתאמה.חשבו את יחסי ה-FRET על ידי קביעת היחס בין הפלואורסצנציה הצהובה שזוהתה לזו של הפלואורסצנציה הכחולה. כעת, סבבו במהירות (spin down) את שני המיליליטרים האחרונים של הדגימות היומיות, ולאחר מכן שטפו את המשקע פעמיים ב-PBS קר בקרח; לאחר השטיפה השנייה, בצעו סוניקציה לדגימה חמש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם, בפולס של 15 שניות פעילות ו-15 שניות השהייה.לבסוף, בצעו את בדיקות המטבוליטים לפי הוראות היצרן, והשתמשו בעקומות הסטנדרט שהתקבלו כדי לחשב את רמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיים, לפי העניין. בניסוי מייצג זה, תרביות של שני קווי תאים שגדלו בשיטת batch הוחזקו כפי שהודגם זה עתה, כאשר דגימות יומיות שימשו לכיול in vivo של כל fibs. פרופיל מייצג של צמיחת תאים חיים עבור שני קווי התאים ביחס לרמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיים שלהם מוצג בגרף זה, ומדידות ה-fret התואמות וריכוזי המטבוליטים התוך-תאיים שנקבעו על ידי הבדיקות האנזימטיות מוצגים בטבלה זו.נקבע כי מספר התאים הנמוך בנוער ארבעת הימים הראשונים של התרבית הוביל לאות FRET לא אמין. באופן דומה, הרמה הגבוהה של ליזט תאים שנכחה לאחר היום השמיני של התרבית גרמה לפיזור אור גבוה. לכן, נעשה שימוש בנתונים מהימים הרביעי עד השמיני בלבד כדי לבנות את עקומות הכיול עבור חיישני הגלוקוז והגלוטמין.התוצאות מעידות כי אות ה-FIB מפיק מתאם מהימן עם הריכוזים התוך-תאיים בין 1 ל-5 millimolar עבור גלוקוז, ובין 0.3 ל-2 millimolar עבור גלוטמין. כדי לתקף את ממצאי ה-FIB, בוצעו תרביתי fed-batch של שניים מסלולי התאים. תזונה בעלת ריכוז גבוה של סובסטרט הוספה ביום השישי של תרבית התאים כדי להעלות את הריכוזים החוץ-תאיים של הסובסטרט.כפי שהגרפים מראים, יחסי ה-fret בכל יום מציגים תגובה ברורה להאכלה, תוך היפוך המגמה ששררה עד היום השישי. לדוגמה, בתרביות שהוזנו בגלוקוז, ריכוז הגלוקוז החוץ-תאי עלה בחזרה ל-36 millimolar.בעוד שבמטעויות שהוזנו בגלוטמין, ריכוז הגלוטמין עלה ל-4 mM. בניסוי הגלוקוז, יחס ה-FRET עבור שורת התאים של glucose fibs ירד ביום השביעי בתגובה להוספת גלוקוז. זאת מכיוון ש-glucose fibs עוקב אחר קונפיגורציית ה-APO.בדומה לכך, בניסוי הגלוטמין, יחס ה-FRET עבור שורת התאים של glutamine fibs עלה בתגובה להוספת גלוטמין, בהתאם לעיקרון של חיישני APO off. מדידות FRET אלו שימשו בסופו של דבר לחישוב ריכוזי הגלוקוז והגלוטמין התאיים המתאימים, על בסיס עקומות הכיול שהוזכרו לעיל. הן נשוו לריכוזים התאיים הממשיים של מצעים אלו כפי שנקבעו באמצעות בדיקות אנזימטיות לגלוקוז וגלוטמין, והראו התאמה מספקת לאחר פיתוחן.טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום לחקור את ההשפעה של הרכבי מצע שונים על פריון החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש בביוסנסורים מקודדים גנטית כדי לנטר ריכוזי מטבוליטים תוך-תאיים.

fibs-enabled-noninvasive-metabolic-profiling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

עבודה זו מדגימה את ההיתכנות של טכניקת ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית של זרחן-31 in vivo (31PMRS) לכימות יכולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) בשריר השלד האנושי.

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת In vivo קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

מחקר זה מתאר פרוטוקול המשתמש בהדמיית 18F-FDG וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT), יחד עם מודלים קינטיים, כדי לכמת את הספיגה בזמן אמת של 18F-FDG לרקמות.

קביעת קינטיקס והגלוקוז שימוש<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG מיקרו-PET / CT

כאן אנו מציגים שיטה לשימוש צנתר אופטי פנים-חדר בלבבות מעשה כדי לבצע ספקטרוסקופיה ספיגת על פני קיר הלב. הנתונים שהושגו מספק מידע חזק על מתח החמצן ברקמות, כמו גם ניצול מצע ופוטנציאל הממברנה במקביל עם ביצועים מדדים לב בהכנה זו בכל מקום.

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

פרוטוקול זה מתאר הדמיה וניתוח פלואורסצנטי של קואנזימים מטבוליים אנדוגני, אדנין ניקוטינאמיד מופחת (פוספט) dinucleotide (NAD(P)H), ו flavin adenine dinucleotide מחומצן (FAD). הדמיה אוטופלואורסצנטית של NAD(P)H ו-FAD מספקת שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת חילוף החומרים התאי.

הדמיית זרם אוטומטי להערכת חילוף החומרים התאי

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהכלאה פוטותרמית פוטותרמית-פלואורסצנטית באתרו (OPTIR-FISH), הידועה גם בשם MID-INFRARED PHOTOTHERMAL-FISH (MIP-FISH), כדי לזהות תאים בודדים ולהבין את חילוף החומרים שלהם. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב עבור יישומים מגוונים, כולל מיפוי מטבוליזם תאי עם רזולוציה של תא יחיד.

הכלאה פוטותרמית אופטית אינפרא אדום-פלואורסצנטי באתרו (OPTIR-FISH)

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

תוך שימוש בפלטפורמה רב-מודאלית המשלבת שיטות הדמיה אופטיות ללא תוויות, פיתחנו פרוטוקול להדמיה וכימות של דינמיקה תאית וחילוף חומרים. באמצעות הדמיה באמצעות פלואורסצנציה רב-פוטונית, דור הרמוני שני ומיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה, אנו יכולים ליצור סקירה הוליסטית של הסביבה התאית והמולקולרית.

פלטפורמת הדמיה אופטית מולטי-מודאלית לחקר חילוף החומרים התאי

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

למד כיול חיישנים ביולוגיים משולבי FRET לפרופיל מטבולי לא פולשני. השיטה מאפשרת ניטור בזמן אמת של רמות גלוקוז וגלוטמין תוך תאיים לשיפור בקרת ביופרוססים.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

גלה סרטונים נוספים