FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר באופן לא פולשני את רמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיים באמצעות ביו-סנסורים מבוססי חלבון המקודדים גנטית. הדבר מושג תחילה על ידי טרנספקציה של התאים הרלוונטיים באמצעות פלסמיד המכיל את הגן של הביו-סנסור, ובחירת התאים המבטאים את הביו-סנסור. בשלב השני, נלקחים דגימות תרביות תאים מתרביות batch או fed-batch, ומודדות את יחסי ה-FRET שלהם.

ניתן לקבוע את ריכוז הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאי של הדגימות באמצעות בדיקה עצמאית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ביחס ה-fret של הדגימות כדי לחשב את הריכוז התוך-תאי של גלוקוז או גלוטמין באופן לא פולשני ובזמן אמת. ההשלכות של טכניקה זו פונות לשיפור ביו-תהליכים, שכן זוהי שיטה מהימנה להשגת מידע מטבולי בזמן אמת שניתן להשתמש בו לאופטימיזציה ובקרה מקוונת.

אף שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבל תובנות לגבי עיבוד ביולוגי (bioprocessing), ניתן להשתמש בה גם במערכות אחרות, כולל זיהוי סממני מחלה. התחילו בהחייאת תאי CHO בתשעה מיליליטרים של מצע גידול מלא. לאחר מכן, סובבו את התאים במ centri-fuge, השעיקו מחדש את המשקע ב-10 מיליליטרים של מצע גידול טרי, וספרו את התאים באמצעות שיטת dye exclusion של trypan blue.

בשלב הבא, התחל תרבית בצפיפות זריעה של 3×10⁵ תאים למילליליטר בבקבוקי שייקר בנפח 125 מיליליטר, בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 על פלטפורמת ניעור אורביטלית. בסיבוב של 125 RPM, בצע תת-תרבית לתאים כל שלושה עד ארבעה ימים במצע גידול מלא בצפיפות זריעה של 2×10⁵ תאים למילליליטר לצורך טרנספקציית תאים.

שמרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 12 עד 24 שעות לפני הטרנספקציה, כדי להבטיח שהתאים נמצאים בחלוקה פעילה. לאחר הכנת ה-plasmid DNA, ספרו את התאים באמצעות צביעת trypan blue ודללו את התאים לנפח עבודה של 20 milliliters של מצע גידול תאים. השתמשו בבקבוק שילום (shake flask) של 125 milliliters בריכוז של 1×10⁶ תאים ל-milliliter.

השתמש בערכה מתאימה לטרנספקציה עבור שלב התאים שבשימוש, הכוללת לפחות באר ביקורת שלילית המכילה תאים אך ללא DNA. הדגר את התאים שעברו טרנספקציה למשך ארבעה ימים במצב סטטי. כעת הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת הפלסמיד בריכוז הולם, כפי שנקבע על ידי עקומת הריגה (kill curve).

לדוגמה, במחקר זה, zin הוסף לריכוז סופי של 400 grams per milliliter לצורך סלקציה של התאים שעברו טרנספקציה, ולאחר מכן הועברו התרביות למנער (shaking platform) המסתובב במהירות של 125 RPM. יש להחליף את המצע במרווחי זמן המתאימים לשורת התאים, ולהוסיף אנטיביוטיקה בכל פעם עד למות התאים בבאר הביקורת. השתמש בבארים בעלות הצפיפות (confluence) הגבוהה ביותר כדי להמשיך לתרביות המנוערות.

לאחר מכן, הקפיאו את התאים במבחנות קריוגניות המכילות 1×10⁷ תאים חיוניים ב-1 mL של תערובת הקפאה, כדי להפיק עקומות גדילה של אצווה (batch) ואצווה מוזנת (fed-batch). ראשית, הקימו תרביות תאים בשלוש חזרות של תאי CHO שעברו טרנספקציה בבקבוקי ניעור בנפח של 250 mL עם נפח עבודה של 50 mL. לאחר מכן, הניחו את התרביות באינקובטור תאים מלחח עם ניעור, ודגמו 4.1 mL מכל תרבית גדלה במרווחי זמן של 24 שעות. עבור תרביות ה-fed-batch, הוסיפו לתאים את הכמות המתאימה של גלוקוז או גלוטמין ביום השישי כדי להחזיר את ריכוזיהם לערכיהם ההתחלתיים.

בזמן ההאכלה של תרביות הביקורת בנפח זהה של מים מזוקקים, השתמשו ב-100 µL מתוך הדגימות של 4.1 מ-4.2 מדי יום כדי לספור את התאים באמצעות שיטת הדחיית צבע טריפאן כחול (trypan blue dye exclusion), עד שריכוז התאים החיים יירד לאפס. כדי לקבוע את מדידות יחס ה-FRET, סבבו במצמדת (צנטריפוגה) 2 mL מהדגימות היומיות והשעיקו מחדש את המשקע ב-2 mL של PBS קר בקרח. העבירו חצי מתרחיף התאים לפלטה בעלת 6 בארות והוסיפו לבארה אחת דגימת רקע (blank) שאינה מכילה תאים. לאחר מכן, מדדו מיד את רמות הפלואורסצנציה הכחולה והצהובה באורך גל עירור של 430 nm עם רוחב פס של 35 nm, ובאורכי גל פליטה של 465 nm עם רוחב פס של 35 nm ו-520 nm עם רוחב פס של 10 nm עבור הפלואורסצנציה הכחולה והצהובה, בהתאמה.

חשבו את יחסי ה-FRET על ידי קביעת היחס בין הפלואורסצנציה הצהובה שזוהתה לזו של הפלואורסצנציה הכחולה. כעת, סבבו במהירות (spin down) את שני המיליליטרים האחרונים של הדגימות היומיות, ולאחר מכן שטפו את המשקע פעמיים ב-PBS קר בקרח; לאחר השטיפה השנייה, בצעו סוניקציה לדגימה חמש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם, בפולס של 15 שניות פעילות ו-15 שניות השהייה.

לבסוף, בצעו את בדיקות המטבוליטים לפי הוראות היצרן, והשתמשו בעקומות הסטנדרט שהתקבלו כדי לחשב את רמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיים, לפי העניין. בניסוי מייצג זה, תרביות של שני קווי תאים שגדלו בשיטת batch הוחזקו כפי שהודגם זה עתה, כאשר דגימות יומיות שימשו לכיול in vivo של כל fibs. פרופיל מייצג של צמיחת תאים חיים עבור שני קווי התאים ביחס לרמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיים שלהם מוצג בגרף זה, ומדידות ה-fret התואמות וריכוזי המטבוליטים התוך-תאיים שנקבעו על ידי הבדיקות האנזימטיות מוצגים בטבלה זו.

נקבע כי מספר התאים הנמוך בנוער ארבעת הימים הראשונים של התרבית הוביל לאות FRET לא אמין. באופן דומה, הרמה הגבוהה של ליזט תאים שנכחה לאחר היום השמיני של התרבית גרמה לפיזור אור גבוה. לכן, נעשה שימוש בנתונים מהימים הרביעי עד השמיני בלבד כדי לבנות את עקומות הכיול עבור חיישני הגלוקוז והגלוטמין.

התוצאות מעידות כי אות ה-FIB מפיק מתאם מהימן עם הריכוזים התוך-תאיים בין 1 ל-5 millimolar עבור גלוקוז, ובין 0.3 ל-2 millimolar עבור גלוטמין. כדי לתקף את ממצאי ה-FIB, בוצעו תרביתי fed-batch של שניים מסלולי התאים. תזונה בעלת ריכוז גבוה של סובסטרט הוספה ביום השישי של תרבית התאים כדי להעלות את הריכוזים החוץ-תאיים של הסובסטרט.

כפי שהגרפים מראים, יחסי ה-fret בכל יום מציגים תגובה ברורה להאכלה, תוך היפוך המגמה ששררה עד היום השישי. לדוגמה, בתרביות שהוזנו בגלוקוז, ריכוז הגלוקוז החוץ-תאי עלה בחזרה ל-36 millimolar.

בעוד שבמטעויות שהוזנו בגלוטמין, ריכוז הגלוטמין עלה ל-4 mM. בניסוי הגלוקוז, יחס ה-FRET עבור שורת התאים של glucose fibs ירד ביום השביעי בתגובה להוספת גלוקוז. זאת מכיוון ש-glucose fibs עוקב אחר קונפיגורציית ה-APO.

בדומה לכך, בניסוי הגלוטמין, יחס ה-FRET עבור שורת התאים של glutamine fibs עלה בתגובה להוספת גלוטמין, בהתאם לעיקרון של חיישני APO off. מדידות FRET אלו שימשו בסופו של דבר לחישוב ריכוזי הגלוקוז והגלוטמין התאיים המתאימים, על בסיס עקומות הכיול שהוזכרו לעיל. הן נשוו לריכוזים התאיים הממשיים של מצעים אלו כפי שנקבעו באמצעות בדיקות אנזימטיות לגלוקוז וגלוטמין, והראו התאמה מספקת לאחר פיתוחן.

טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום לחקור את ההשפעה של הרכבי מצע שונים על פריון החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש בביוסנסורים מקודדים גנטית כדי לנטר ריכוזי מטבוליטים תוך-תאיים.