FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר את רמת הגלוקוז התוך תאי או הגלוטמין באופן לא פולשני באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי חלבון מקודדים גנטית. זה מושג על ידי מעבר ראשון של התאים המעניינים עם הגן הביו-חיישן המכיל פלסמיד ובחירה עבור אותם תאים המבטאים את החיישן הביולוגי. בשלב השני, דגימות תרבית תאים נלקחות מתרביות אצווה או מוזנות ונמדדים יחסי השריגים שלהן.

לאחר מכן ניתן לקבוע את ריכוז הגלוקוז או הגלוטמין התוך תאי של הדגימות על ידי בדיקה עצמאית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ביחס השריגים של הדגימות כדי לחשב את הריכוז התוך תאי של גלוקוז או גלוטמין באופן לא פולשני ובזמן אמת. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על שיפור התהליכים הביולוגיים מכיוון שזוהי שיטה אמינה להשגת מידע מטבולי בזמן אמת שניתן להשתמש בו לאופטימיזציה ובקרה מקוונת.

למרות שניתן להשתמש בשיטה כדי לספק תובנה לגבי עיבוד ביולוגי, ניתן להשתמש בה גם במערכות אחרות, כולל חישה של סמני מחלה. התחל בהחייאת תאי CHO בתשעה מיליליטר של מדיום גידול שלם. לאחר מכן סובב את התאים, השהה מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר של צמיחה טרייה, מדיום, וספור את התאים לפי טריפ בהדרה כחולה.

לאחר מכן, התחל תרבית בצפיפות זריעה של שלוש פעמים 10 עד התאים החמישיים למיליליטר ב -125 מיליליטר. צלוחיות שייקר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על פלטפורמת טלטול מסלולית. עם סיבוב של 125 סל"ד, תת-תרבית התאים כל שלושה עד ארבעה ימים במצע הגידול השלם בצפיפות ישיבה של פי שניים מ-10 לתאים החמישיים למיליליטר להעברת תאים.

שמור על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 12 עד 24 שעות לפני הטרנספקציה כדי להבטיח שהתאים מתחלקים באופן פעיל. לאחר מכן לאחר הכנת ה-DNA של הפלסמיד, ספרו את התאים על ידי אי הכללת טריפ וכחול ודללו את התאים לנפח עבודה של 20 מיליליטר של אמצעי תרבית תאים. בבקבוק של 125 מיליליטר יש לנער בריכוז של אחד כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר.

השתמש בערכת טרנספקציה מתאימה לקו התאים בשימוש, כולל לפחות באר בקרה שלילית אחת המכילה תאים, אך ללא DNA. דגרו על התאים שהועברו במשך ארבעה ימים במצב סטטי. כעת הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת פלסמיד לריכוז מתאים כפי שנקבע על ידי עקומת הריגה.

לדוגמה, במחקר זה, נוסף לריכוז סופי של 400 גרם למיליליטר לבחירת התאים המועברים ואז העביר את התרביות לפלטפורמת טלטול המסתובבת ב-125 סל"ד. שנה את המדיה במרווח זמן מתאים לקו התאים, והוסף אנטיביוטיקה בכל פעם עד שהתאים בבאר הבקרה מתו. השתמש בבארות המשולבות ביותר כדי להתקדם לתרבויות הרעד.

לאחר מכן הקפיאו את התאים בבקבוקונים קריוגניים המכילים אחד כפול 10 עד התאים השביעיים ברי קיימא במיליליטר אחד של תערובת הקפאה כדי ליצור עקומות גידול אצווה ומוזנות. ראשית, הקם תרביות תאים משולשות של תאי CHO שעברו טרנספטציה בצלוחיות שייק של 250 מיליליטר בנפח עבודה של 50 מיליליטר. לאחר מכן הניחו את התרביות בחממת תאים לחה עם ניעור והוציאו 4.1 דגימות מיליליטר מכל תרבית גידול במרווחים של 24 שעות עבור תרביות אצווה מוזנות, השלם את התאים בכמות המתאימה של גלוקוז או גלוטמין ביום השישי כדי להחזיר את ריכוזם לערכים הראשוניים שלהם.

האכלת תרביות הבקרה באותו נפח של מים טהורים השתמשו ב-100 מיקרוליטר מתוך דגימות של 4.1 מיליליטר מ-4.2 מדי יום כדי לספור את התאים לפי טריפ והרחקת קוביות כחולות עד שריכוז התא הבר-קיימא יופחת לאפס. כדי לקבוע את יחס השריגים מדידות, צנטריפוגה של שני מיליליטר מהדגימות היומיות והשעיית הגלולה בשני מיליליטר PBS קר כקרח מעבירים מחצית מתרחיף התא לצלחת שש בארות ומוסיפים דגימה ריקה שאינה מכילה תאים לאחת. ובכן, מיד לאחר מכן מדוד מיד את רמות הקרינה הכחולה והצהובה באורך גל עירור של 430 עם רוחב פס של 35 ננומטר ואורכי גל משימה של 465 עם רוחב פס של 35 ננומטר ו-520 עם רוחב פס של 10 ננומטר עבור הקרינה הכחולה והצהובה בהתאמה.

חשב את יחסי השריגים על ידי קביעת היחס בין הקרינה הצהובה שזוהתה לזו של הקרינה הכחולה. כעת סובב את שני המיליליטר האחרונים של הדגימות היומיות ולאחר מכן שטוף את הגלולה פעמיים ב- PBS קר כקרח לאחר הכביסה השנייה. סוניקציה של הדגימה חמש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם בפעימות של 15 שניות הפעלה ו-15 שניות כיבוי.

לבסוף, בצע את בדיקות המטבוליטים בהתאם להוראות היצרן, והשתמש בעקומות הסטנדרטיות המתקבלות כדי לחשב את רמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך תאיות לפי הצורך. בניסוי מייצג זה, תרביות מגודלות של שני קווי תאים נשמרו כפי שהודגם זה עתה עם דגימות יומיות המשמשות לכיול in vivo של כל פיב. פרופיל צמיחת תאים בר-קיימא מייצג של שני קווי התאים ביחס לרמות הגלוקוז או הגלוטמין התוך-תאיות שלהם מודגם בגרף זה ומדידות השריגים המקבילות וריכוזי המטבוליטים התוך-תאיים שנקבעו על ידי הבדיקות האנזימטיות מוצגות בטבלה זו.

נקבע כי מספרי התאים הנמוכים שהיו קיימים בארבעת הימים הראשונים של התרבית הובילו לאות שריג לא אמין. באופן דומה, הרמה הגבוהה של ליזאט תאים הקיימת לאחר היום השמיני של התרבית יצרה כמות גבוהה של פיזור אור. לכן, רק נתונים עבור הימים הרביעי עד השמיני משמשים לבניית עקומות הכיול עבור פיבי הגלוקוז והגלוטמין.

התוצאות מצביעות על כך שאות ה-FIB מייצר מתאם אמין עם הריכוזים התוך-תאיים בין 1 ל-5 מילי-מולרי לגלוקוז ו-0.3 ו-2 מילי-מולרי לגלוטמין. כדי לאמת את ממצאי ה-fibs, בוצעו תרביות מגודלות של שני קווי התאים. הזנה המכילה ריכוז סובסטרט גבוה הוספה ביום השישי של תרבית התאים כדי להעלות את הריכוזים החוץ-תאיים של המצע.

כפי שהשתלים מתארים, יחסי השריגים בכל יום מציגים תגובה ברורה להאכלה. על ידי היפוך המגמה הם המשיכו עד היום השישי. לדוגמה, בתרבויות המוזנות בגלוקוז, ריכוז הגלוקוז החוץ-תאי עלה בחזרה עד 36 מילימולר.

בעוד שבתרביות שניזונו מגלוטמין, ריכוז הגלוטמין עלה ל-4 מילי-מולאר. בניסוי הגלוקוז, יחס העצבים עבור גרגרי הגלוקוז שנבחרו בקו התאים ירד ביום השביעי בתגובה לתוספת גלוקוז. מכיוון שסיבי הגלוקוז עוקבים אחר ה-APO בתצורה.

באופן דומה, בניסוי הגלוטמין, יחס השריג עבור פיבי הגלוטמין שנבחרו גדל בתגובה לתוספת גלוטמין בהתאם לעיקרון של חיישני APO כבויים. מדידות השריג הללו שימשו לבסוף לחישוב ריכוזי הגלוקוז והגלוטמין התוך-תאיים המתאימים על סמך עקומות הכיול שהוזכרו לעיל. הם מושווים לריכוזים התוך-תאיים בפועל של סובסטרטים אלה כפי שנקבעו במבחנים האנזימטיים של גלוקוז וגלוטמין, ומראים הסכמה מספקת לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום לחקור את ההשפעה של פורמולציות מדיום שונות על תפוקת החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לנטר ריכוזי מטבוליטים תוך תאיים.