פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשוות את הריכוזים של חלבונים רבים בין דגימות על ידי ספקטרומטריית מסה באמצעות פרוטאומיקה מוכנה. זה מושג על ידי עיכול החלבון מכל דגימה ליצירת תערובות פפטידים. לאחר מכן, שתי הדגימות מעורבבות, והפפטידים בדגימה המעורבת מפוצלים ומומלחים.

לאחר מכן, הדגימה המעורבת מנותחת על ידי ספקטרומטריית מסה. לבסוף, הפפטידים מזוהים על ידי השוואת שני ספקטרום MS למסד נתונים של פיתוי מטרה של כל הפפטידים הפוטנציאליים בדגימות והשפע היחסי של פפטידים בין הדגימות מכומת. בסופו של דבר, פרוטאומיקה מוכנה מאפשרת לכמת את השפע היחסי של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות.

היתרונות העיקריים של דה-מתילציה רדוקטיבית על פני שיטות אחרות לתיוג איזוטופים יציבים כגון iLite, הוא ש-ready היא שיטה מהירה, זולה ומדויקת שאינה דורשת טרואה ספציפית או מדיום סינתטי, כלומר ניתן ליישם אותה כמעט על כל סוג של דגימה. כדי להתחיל, הכינו מיליגרם אחד של חלבון תאי ו -500 מיקרוליטר על ידי שימוש בסוניקציה או מכבש צרפתי כדי להניע את התאים כדי לזרז את החלבונים. הוסיפו נפח אחד של חומצה תלת-כלורוטית לארבעה נפחים של חלבון וצננו על קרח למשך 10 דקות.

צנטריפוגה ב -12,000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של אצטון קר כקרח כדי להחזיר לחיים. השעו את הכדור לפני שתסתובבו בפעם השנייה.

לאחר שאיבת הסנאט, יבש את הגלולה בבלוק חום של 56 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את החלבונים ולהפחית את קשרי הצבע הגופרתי. השתמש ב-500 מיקרוליטר של מאגר דנטורינג והפחתה ל-reus. השעו את החלבונים לכשני מיליגרם למיליליטר.

דגרו על החלבונים למשך 30 דקות בחום של 56 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 10 דקות בטמפרטורת החדר. לצד קבוצות סולפיד ללא אלקילט, הוסיפו 25 מיקרוליטר של אצטמיד IDO טרי 0.3 מולארי במים ל -500 מיקרוליטר חלבון ודגרו בחושך למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, יש להרוות את התגובה על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של שלושה מילי-מולרי DTT.

אחסן את החלבונים האלקיליים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס כדי לעכל את החלבונים האלקיליים לאחר משקעי TCA השתמש באוריאה טוחנת אחת ב-50 מילי-מולרי pH 8.2 כדי להשעות מחדש את החלבון. הכינו תמיסת מלאי של ליזול, אנדו פרוטאינאז או ly C במים בריכוז של שני מיקרוגרם למיקרוליטר והוסיפו את האנזים לחלבון המעוכל בריכוז סופי של 10 ננוגרם למיקרוליטר דגימות נשארות בטמפרטורת החדר למשך שש שעות או לילה. השעו 20 מיקרוגרם של טריפסין בדרגת ריצוף ב -40 מיקרוליטר של חומצה אצטית של 50 מילי-מולרית והוסיפו חמישה מיקרוליטר לתגובת העיכול של הליס.

דגירה במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחלבונים האלקיליים. הוסף חומצה אצטית tri Fluor או TFA לריכוז סופי של 0.5% חבר עמודת C 18 לסעפת מיצוי. לאחר מכן השתמש בשישה מיליליטר אצטו ניטריל או CN כדי להרטיב את העמוד.

לאחר מכן, עם קצב הזרימה הגבוה ביותר האפשרי, השתמש בשישה מיליליטר של 80%a CN 0.1%TFA כדי לשטוף את העמודה לפני שתשתמש בשישה מיליליטר של 0.1% TFA כדי לאזן את העמודה, לעצור את לחץ הוואקום ולהעמיס 500 מיקרוגרם של פפטידים על העמודה בקצב זרימה של כמיליליטר לדקה. לאחר שהפפטידים נקשרים לעמודה, הפעל מחדש את הוואקום ועם קצב הזרימה הגבוה ביותר האפשרי, השתמש ב-0.1% TFA ואחריו שלושה מיליליטר של חומצת לימון כדי לשטוף את העמודה לביצוע תיוג אונקו, רדוקטיבי, עמום או תיוג מוכן. מתחת למכסה מנוע כימי, הכינו 12 מיליליטר כל אחד של מאגרים מוכנים קלים וכבדים ללא פפטידים של Tom Methylate.

אמצעי מוסיף 10 מיליליטר של מאגר מוכן קל או כבד לעמודה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר מריחת אליקוט שני של 10 מיליליטר. כדי להבטיח תיוג השתמש בשישה מיליליטר של 0.1% TFA, ואחריהם מיליליטר אחד של 0.5% חומצה אצטית.

כדי לשטוף את העמודה כדי לסלק את החלבונים, עצרו את הוואקום ומרחו מיליליטר אחד של 40% על חומצה אצטית CN 0.5% בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של 80%a CN 0.5% חומצה אצטית עם מזרק של חמישה מיליליטר אם רוצים. מערבבים יחס של אחד לאחד של דגימות פפטיד כבדות וקלות ומכמתים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי להבטיח שגם התיוג וגם התיוג הקל היו יעילים לחלק את תערובת הפפטידים על ידי החלתה תחילה על עמודת C 18 HPLC.

לאחר מכן, לאחר שימוש ב-5%a CN כדי לשטוף את העמודה במשך חמש דקות, השתמש בשיפוע של 5 עד 35%a CN במשך 60 דקות כדי לסלק את הפפטידים בשברים שווים. בצלחת של 96 בארות, ואחריה 90%A CN למשך דקה אחת. לאחר ארבע דקות נוספות של 90%A CN, השתמש ב-5%A CN כדי לאזן מחדש את העמודה.

לאחר מכן שלב שברים בצורה הבאה עם צנטריפוגת הוואקום. הסר את הממס מהשברים המשולבים. לאחר מכן השתמש ב-130 מיקרוליטר של אוריאה טוחנת אחת 0.5% TFA כדי להחזיר לחיים.

השעו את הפפטידים מהשברים הבאים, ואחסנו את קבוצת השברים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס כדי לבצע, לעצור וללכת מיצוי על השברים התלויים. הכן עמודי מיקרו קצה שלב C 18 מקצות פיפטה של 200 מיקרוליטר על ידי שימוש בשני דיסקים C 18 בקוטר פנימי של 1.07 מילימטר כדי לארוז אותם. הנח את קצות הבמה לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה והוסף 130 מיקרוליטר מתנול וסיבוב.

לאחר מכן מוסיפים 130 מיקרוליטר של 80%a CN 0.5% חומצה אצטית לפני שמסתובבים שוב לאחר שימוש ב-130 מיקרוליטר של 0.1% TFA כדי לאזן את הקצוות, להעביר את תערובת הפפטידים לקצוות ולשטוף. תחילה עם 130 מיקרוליטר של 0.1% TFA ואחריו 40 מיקרוליטר של 0.1% TFA. לאחר מכן 40 מיקרוליטר של חומצה אצטית 0.5% כדי לסלק את הפפטידים.

ראשית, הוסף 20 מיקרוליטר של 40% לחומצה אצטית CN 0.5%. ואז 20 מיקרוליטר של 80%a CN 0.5% חומצה אצטית. שלב את ה-IITs ואת סינון הוואקום לייבוש כדי לבצע כרומטוגרפיה נוזלית מיקרו-נימית.

ספקטרומטריית מסה טנדם או L-C-M-S-M-S מתחילים בשימוש בחומצה פורמית של 5%, 5%A CN כדי להשעות את החלבונים לריכוז של כמיקרוגרם אחד למיקרוליטר. מרחו כמיקרוגרם אחד של פפטידים על 100 מיקרומטר על 20 סנטימטר C 18. עמודת HPLC בשלב הפוך ומסירה באמצעות שיפוע של שישה עד 22% של CN ב-0.1 25% חומצה פורמית בקצב זרימה של כ-300 ננוליטר לדקה, מיושם במשך 75 עד 100 דקות.

השתמש בספקטרומטר מסה עם רזולוציה גבוהה ודיוק מסה גבוה וזהה פפטידים בדגימה על ידי השוואת קבצי גלם Ms.Ms Spectra למסד נתונים תיאורטי עם אלגוריתם כגון SE quest, תוך שימוש בפרמטרים המוצגים כאן עם מסד הנתונים של מסגרות קריאה פתוחות בכיוונים בפועל והפוך, מסננים פפטידים לשיעור גילוי שגוי של 1% בשיטה כגון פיתיון המטרה. כדי לכמת את הפפטידים שזוהו, חשב את האזורים של זוגות כבדים וקלים של כרומטוגרמות יונים שחולצו MS אחד ויחסי אות פפטיד לרעש כוללים זוגות פפטידים רק כאשר יחס האות לרעש הממוצע שלהם הוא מעל חמש. כמת את השכיחות היחסית של פפטיד בשתי הדגימות כיחס של טרשת נפוצה אזורי שיא אחד של גרסאות כבדות וקלות של אותו פפטיד חשב את שפע החלבון היחסי כחציון MS יחס שטח שיא אחד עבור כל הפפטידים בחלבון כאשר מסוננים לשיעור גילוי שגוי של 1% פפטיד.

יעילות התיוג המוכנה של תערובת של תסיסה c פיטו מתרביות כבדות וקלות המכילות 11,194 רצפי פפטידים ייחודיים הייתה 98% ליזאט חלבון visier לא מפורק. הבדלי ביטוי החלבון משקפים באופן שחזורי את היחסים שבהם הדגימות הכבדות והקלות עורבבו על פני מגוון רחב של יחסי ערבוב. באופן ספציפי, השינוי ב-fo של 99% מהחלבונים היה קטן מ-1.6 עבור הדגימות המעורבות של אחד לאחד בדגימות של 1 ל-10 ו-10 לאחד.

99% מהחלבונים היו בטווח של פי 3.8 מהיחס הצפוי, מה שמראה עלייה בסטיית התקן במרחק גדול יותר מתערובת של אחד לאחד. כאשר התיוג המוכן הוחל על פרוטאום התסיסה של קלוסטרידיום פיטו, יותר מ-2000 חלבונים כומתו עם 94% חלבונים שנמדדו ברמות כפולות עבור תרביות משוכפלות הגדלות על קפל חלבון גלוקוז. שינויים עבור זוגות כפולים של תרביות היו גם הם בקורלציה גבוהה.

יחד ניסויים אלה תומכים בכך שפרוטאומיקה מוכנה היא שיטה מדויקת וניתנת לשחזור לכימות הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות מורכבות. מכיוון שניתן ליישם טכניקה זו כמעט על כל סוג של דגימה, היא סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור שינויים בביטוי פרוטה בכל מיני דגימות, כולל חיידקים חדשים, דגים ותאי יונקים.