פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשוות ריכוזים של חלבונים רבים בין דגימות באמצעות ספקטרומטריית מסה תוך שימוש ב-ready proteomics. דבר זה מושג תחילה על ידי עיכול החלבון מכל דגימה ליצירת תערובות פפטידים. לאחר מכן, שתי הדגימות מעורבבות, והפפטידים בדגימה המעורבבת עובריםים פרקציונציה והסמכה.

בשלב הבא, הדגימה המעורבבת מנותחת באמצעות ספקטרומטריית מסות. לבסוף, הפפטידים מזוהים על ידי השוואת ספקטראי MS שניים למסד נתונים של פפטידים פוטנציאליים (target decoy) בדגימות, והשפעיות היחסיות של הפפטידים בין הדגימות נמדדות כמותית. בסופו של דבר, שיטת ready proteomics מאפשרת כימות של השפעיות היחסיות של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות.

היתרונות המרכזיים של דמתילציה רדוקטיבית על פני שיטות אחרות לסימון באיזוטופים יציבים, כגון iLite, הם בכך שמדובר בשיטה מהירה, זולה ומדויקת שאינה דורשת תנאים ספציפיים או מצע סינתטי, מה שאומר שניתן להחילה אותה על כמעט כל סוג של דגימה. לתחילתו של התהליך, הכינו מיליגרם אחד של חלבון תאי ו-500 µL תוך שימוש בסוניקציה או במכבש צרפתי (French press) כדי לבלגן את התאים ולהשקיע את החלבונים. הוסיפו נפח אחד של חומצה טריכלורואצטית לארבעה נפחים של חלבון וקררו על קרח למשך 10 דקות.

סבבו בצנטריפוגה ב-12,000 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והסירו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, השתמשו ב-1 ml של אצטון קר מאוד כדי לסבב מחדש את המשקע (pellet) לפני סיבוב שני.

לאחר שאיבת הנוזל העודף, ייבשו את המשקע בבלוק חימום בטמפרטורה של 56 °C כדי לדנטור proteins ולהפחית את קשרי הדיסולפיד של הצבע. השתמשו ב-500 µL של בופר דנטורציה והסימון כדי לחדש את תמיסת החלבונים. השעיקו את החלבונים לריכוז של כ-2 mg/mL.

דגרו את החלבונים למשך 30 דקות ב-56 °C, ולאחר מכן למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לבצע אלקיליזציה של קבוצות סולפיד חופשיות, הוסיפו 25 µL של IDO acetamide 0.3 M שהוכן טרי במים ל-500 µL של חלבון ודגרו בחושך למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השביתו את התגובה על ידי הוספה של 10 µL של DTT 3 mM.

יש לאחסן את החלבונים האלקיליים בטמפרטורה של 80°C- . כדי לעכל את החלבונים האלקיליים לאחר שיקוע TCA, השתמש ב-urea בריכוז 1M ב-HEPES בריכוז 50mM ב-pH 8.2 כדי לתלוש את החלבון. הכן תמיסת מלאי של Lys-C, endoproteinase Lys-C, או ly C במים בריכוז של 2µg/µL והוסף את האנזים לחלבון שעבר עיכול בריכוז סופי של 10ng/µL. השאר את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שש שעות או למשך הלילה. השהה 20µg של trypsin בדרגת sequencing ב-40µL של חומצה אצטית בריכוז 50mM והוסף 5µL לתגובת העיכול של lyce.

דגרו במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 °C עבור החלבונים האלקיליים. הוסיפו חומצה טריפלואורואצטית (TFA) עד לריכוז סופי של 0.5%. חברו עמודת C 18 למערכת מיצוי (extraction manifold). לאחר מכן, השתמשו ב-6 mL של אצטוניטריל (ACN) כדי להרטיב את העמודה.

בשלב הבא, בקצב זרימה הגבוה ביותר האפשרי, השתמשו ב-6 mL של 80% AC N 0.1% TFA כדי לשטוף את העמודה, ולאחר מכן השתמשו ב-6 mL של 0.1% TFA כדי להביא את העמודה לשיווי משקל. הפסיקו את לחץ הוואקום והטעינו 500 µg של פפטידים אל העמודה בקצב זרימה של כ-1 mL לדקה. לאחר שהפפטידים נקשרו לעמודה, הפעילו מחדש את הוואקום ובקצב זרימה הגבוה ביותר האפשרי, השתמשו ב-0.1% TFA ולאחר מכן ב-3 mL של בופר חומצה ציטרית כדי לשטוף את העמודה לצורך ביצוע onco, reductive, dim methylation או סימון מוכן. תחת מ 빠르게 כימי, הכינו 12 mL של בופרי סימון קלים וכבדים למתילציה של פפטידים חופשיים.

יש להוסיף 10 מיליליטר של בופר מוכן, קל או כבד, לעמודה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר החלת מנה שנייה של 10 מיליליטר, וכדי להבטיח סימון, השתמש ב-6 מיליליטר של 0.1%TFA, ולאחר מכן במיליליטר אחד של 0.5%acetic acid.

כדי לשטוף את העמודה לצורך אלוציה של החלבונים, הפסיקו את הוואקום והחילו 1 mL של 40% aCN עם 0.5% acetic acid בקצב זרימה של 0.5 mL לדקה. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של 80% aCN עם 0.5% acetic acid ובצעו אלוציה באמצעות מזרק של 5 mL במידת הצורך. ערבבו דגימות פפטידים המסומנות בסימון כבד וקל ביחס של 1:1 וכמתו אותן באמצעות ספקטרומטריית מסות כדי לוודא ששני סוגי הסימון, הכבד והקל, היו יעילים. בצעו הפרקציה של תערובת הפפטידים על ידי העברה ראשונית לעמודת C 18 HPLC.

לאחר מכן, לאחר שטיפת העמודה ב-5%a CN למשך חמש דקות, השתמש במעבר (gradient) של 5% עד 35%a CN לאורך 60 דקות כדי להבליט (elute) את הפפטידים לתוך פראקציות שוות, בלוח של 96 בארות, ולאחר מכן ב-90%A CN למשך דקה אחת. לאחר ארבע דקות נוספות של 90%A CN, השתמש ב-5%a CN כדי להחזיר את העמודה למצב שיווי משקל (re-equilibrate).

לאחר מכן, שלבו את הפראקציות באופן הבא באמצעות צנטריפוגת ואקום. הסירו את הממיס מהפראקציות המאוחדות. לאחר מכן, השתמשו ב-130 µL של urea בריכוז 1M ב-0.5% TFA לצורך השהייה (Resus).

שHה את הפפטידים מהמנות הבאות, ואחסן את קבוצת המנות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס כדי לבצע מיצוי מסוג stop and go על המנות שהושחאו. הכן מיקרו-עמודות של C 18 stage tip מקצות של פפטות בנפח 200 microliter על ידי שימוש בשתי דיסקאות C 18 בעלות קוטר פנימי של 1.07 millimeter כדי לדחוס אותן. הנח את ה-stage tips לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה, הוסף 130 microliters של methanol וסובב בצנטריפוגה.

לאחר מכן, הוסף 130 µL של 80% CN 0.5% acetic acid לפני סבב צנטריפוגה נוסף. לאחר שימוש ב-130 µL של 0.1% TFA לשיווי פנים (equilibrate) של הקצוות, העבר את תערובת הפפטידים לקצוות ובצע שטיפה: ראשית עם 130 µL של 0.1% TFA ולאחר מכן עם 40 µL של 0.1% TFA. לבסוף, הוסף 40 µL של 0.5% acetic acid כדי לאלואציה (elute) של הפפטידים.

ראשית, הוסף 20 µL של 40% ל-CN 0.5% acetic acid. לאחר מכן הוסף 20 µL של 80% ל-CN 0.5% acetic acid. שלב את ה-IITs ובצע סינון בוואקום לייבוש לצורך ביצוע כרומטוגרפיה נוזלית מיקרו-קפילרית.

ספקטרומטריית מסות בטור (Tandem mass spectrometry) או L-C-M-S-M-S מתחילים בשימוש ב-5% formic acid ו-5% ACN כדי להמיס מחדש את החלבונים לריכוז של כ-1 µg/µL. יש להעביר כ-1 µg של פפטידים לעמודת C 18 Reverse phase HPLC בגודל 100 µm על 20 cm ולהבדיל אותם באמצעות גרדיאנט של 6% עד 22% ACN ב-0.1% formic acid בקצב זרימה של כ-300 nL/min, לאורך 75 עד 100 דקות.

השתמש בספקטרומטר מסות בעל רזולוציה גבוהה ודיוק מסה גבוה, וזהה פפטידים בדגימה על ידי השוואת קבצי raw של ספקטרום Ms.Ms למסד נתונים תיאורטי באמצעות אלגוריתם כגון SE quest, תוך שימוש בפרמטרים המוצגים כאן עם מסד נתונים של מסגרות קריאה פתוחות (open reading frames) באוריינטציה קדימה ואחורה; סנן פפטידים לשיעור גילוי שגוי (false discovery rate) של 1% באמצעות שיטה כגון target decoy. כדי לכמת את הפפטידים שזוהו, חשב את השטחים של זוגות כבדים וקלים של כרומטוגרמות יונים חולצות (extracted ion chromatograms) ב-MS one ויחסי אות לרעש של הפפטידים; כלול זוגות פפטידים רק כאשר יחס האות לרעש הממוצע שלהם גבוה מחמישה. כמת את השפע היחסי של פפטיד בשתי הדגימות כיחס בין שטחי שיאי ה-MS one של הגרסאות הכבדות והקלות של אותו פפטיד; חשב שפע חלבוני יחסי כחציון של יחס שטחי שיאי ה-MS one עבור כל הפפטידים בחלבון, כאשר אלו סוננו לשיעור גילוי שגוי של 1% ברמת הפפטיד.

יעילות הסימון המוכנה של תערובת של c phyto ferment מתרביות מסומנות בכבד ובקל, המכילה 11,194 רצפי פפטידים ייחודיים, הייתה 98%. ליזט חלבון visier לא מופרד נותח באופן דומה. הבדלים בביטוי חלבונים משקפים באופן הדיר את היחסים שבהם ערבבו את הדגימות הכבדות והקלות על פני טווח רחב של יחסי ערבוב. באופן ספציפי, ה-fold change של 99% מהחלבונים היה קטן מ-1.6 עבור דגימות שערבבו ביחס של אחד-לאחד, ובדגימות ביחס של 1 ל-10 ו-10 ל-1.

99% מהחלבונים היו בטווח של 3.8 fold מהיחס הצפוי, מה שהראה עלייה בסטיית התקן במרחק גדל מתערובת של יחס אחד-לאחד. כאשר הסימון המהיר הוחל על הפרוטאומה של Clostridium phytofermentum, קוונטו תרתיעו יותר מ-2000 חלבונים, כאשר 94% מהחלבונים נמדדו בטווח של twofold עבור תרביות חוזרות שגדלו על מצע גלוקוז. שינויים עבור זוגות כפילים של תרביות היו גם הם בעלי מתאם גבוה.

יחד, ניסויים אלה תומכים בכך שפרוטאומיקה מסוג Ready היא שיטה מדויקת וניתנת לשחזור לכימות הבדלים בביטוי חלבונים בין דגימות מורכבות. מכיוון שניתן להחיל טכניקה זו על כמעט כל סוג של דגימה, היא סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור שינויים בביטוי חלבונים במגוון סוגי דגימות, כולל מיקרובים חדשים, דגים ותאי יונקים.