לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

המטרה הכללית של שיטת המולטיפלקס המשופרת זו היא להגדיל את מספר דגימות החלבון שניתן לנתח בו-זמנית, תוך הפחתת השגיאות בדגימה וזמן העבודה עם המכשיר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי ההזדקנות, מחלות ניוורו-דגנרטיביות, מחלות אחרות הקשורות לגיל וסרטן, הנוגעות לנושאים של פתוגנזה, התקדמות המחלה, אבחנה, פרוגנוזה ומטרות טיפוליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להפיק תמונת מצב מקיפה של שינויים בחלבונים תחת תנאים רבים.

אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלת אלצהיימר במודל עכברים, ניתן ליישמה גם על דגימות רקמה מחולים באלצהיימר או ממגוון הפרעות אחרות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה ימצאו אותה מאתגרת, כיוון שיש לטפל במספר דגימות בו-זמנית בפרק זמן קצר. הרעיון לשיטה זו עלה אצלנו כאשר הבנו שניתן לשלב אצטילציה עם תיוג איזוברי עבור ניטרציה של חלבונים, מה שהניע אותנו להפוך את הטכניקה לישימה באופן גלובלי עבור כל הפפטידים.

מחקר זה ינתח רקמות ממוח, מלב ומכבד של מודל עכבר למחלת אלצהיימר ומבקרים מסוג wild type. העבירו 60 עד 90 מיליגרם מכל דגימת רקמה לשפופרת ליזיס, והוסיפו 500 µL של PBS עם urea בריכוז שמונה מולארי. הומוגניזו את הדגימות באמצעות הומוגניזטור מכני.

הוצא את הומוגנאט הרקמה משפופרת הליזה והעבר אותו לשפופרת מיקרוצנטריפוגה. שטוף את שפופרת הליזה עם 100 עד 500 µL של PBS עם urea בריכוז שמונה מולרי, ושלב את תמיסת השטיפה עם הומוגנאט הרקמה. צנטריפוג את הומוגנאט הרקמה למשך 15 דקות.

אספו את העלייה (supernatant) מכל דגימה. לאחר ביצוע בדיקת BCA לקביעת ריכוז החלבון, העבירו 100 micrograms של חלבון מכל דגימה לאنبובות מיקרו-צנטריפוגה המסומנות באופן אישי. הוסיפו dithiothreitol לכל דגימה.

והדגירה תתבצע בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. הוסיפו iodoacetamide, IAM, לכל דגימה, והדגירו על קרח בחושך למשך שעתיים. לאחר מכן, הוסיפו L-cysteine לכל דגימה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, הוסיפו Tris buffer עם calcium chloride כדי לדלל את ה-urea לריכוז סופי של 2 M. הוסיפו לכל דגימה trypsin שעבר טיפול ב-L1 tosilimitotophenylethylcholer methyl ketone. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.

ביום למחרת, עצרו את עיכול החלבון על ידי הקפאה מהירה (flash freezing) של הדגימה בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. לפני סימון הדימתילציה (dimethylation labeling), יש להסמיח את דגימות הפפטידים מהמלחים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, ולייבש אותן באמצעות סנטריפוגת ואקום. כדי להתחיל את הליך סימון הדימתילציה, השביחו את הפפטידים ב-1% חומצה אצטית המומסת במים בדרגת HPLC או nanopure.

העבירו כמות של 50 µg מכל דגימה למבחורת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL. שמרו את שארית הפפטידים ששוחללו בטמפרטורה של 80- °C לניסויים עתידיים. בשלבים שיוצגו כעת, קריטי להוסיף את הריאגנטים במהירות, כדי שהתגובות הכימיות המאפשרות את התהליך יתרחשו למשך אותו פרק זמן עבור כל הדגימות.

הוסיפו 8 µL של תמיסת פורמלדהיד בריכוז 60 mM לדגימות המיועדות לסימון בדימתיליזציה קלה. הוסיפו 8 µL של תמיסת פורמלדהיד המסומנת ב-carbon 13 deuterium בריכוז 60 mM לדגימות המיועדות לסימון בדימתיליזציה כבדה. הוסיפו 8 µL של sodium cyanoborohydride בריכוז 24 mM לדגימות המסומנות בדימתיליזציה קלה.

הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של sodium cyanoborohydride בריכוז 24 מילימולרי לדגימות המסומנות בדימתילציה כבדה. ערבלו את הדגימות במערבל Vortex, ולאחר מכן נערו אותן בעדינות במערבל מבחנות למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר. עצרו את התגובות על ידי הוספת 16 מיקרוליטרים של 1% ammonia למשך חמש דקות.

חזרו על החמצתו של תערובת התגובה על ידי הוספת 8 µL של חומצההפורמית (formic acid) בריכוז 5%. שלבו את הפפטידים שעברו דימתילציה קלה וכבדה כדי להפיק סך כולל של שש דגימות. בצעו הסמכה (desalting) של הדגימות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

ייבשו את הדגימות באמצעות צנטריפוגת ואקום. כדי להתחיל בתיוג איזובארי של הדגימות שעברו דימתילציה, ראשית, המיסו מחדש 100 micrograms של פפטידים שעברו דימתילציה בבופר triethylammonium bicarbonate, או TEAB.

הוסיפו את הנפח המתאים, במקרה זה 41 µL של ריאגנט התיוג האיזובארי המומס, לכל אחת מדגימות הפפטידים, וערבבו במערבל Vortex למשך כ-10 שניות. נערנער את הדגימות במערער מבחנות מיקרו-צנטריפוגה למשך כשעה בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את התגובות, הוסיפו 8 µL של hydroxylamine לכל דגימה.

הדגרימו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. איחדו את שש הדגימות המסומנות לתערובת אחת ובצעו התפסלה. הכינו את הפפטידים לכרומטוגרפיה נוזלית על ידי ריסוס של הפפטידים במים בדרגת mass spectrometry עם 0.1% formic acid.

הוסיפו את הפפטידים המשוחזרים למבחנה למיקרוצנטריפוגה המכילה מסנן של 0.65 µm. צנטריפוגו ב-12,000 ×g למשך דקה אחת. הוציאו והשליכו את המסנן.

העבירו את הפפטידים המסוננים לבקבוק דגימה עבור מדגמן אוטומטי (autosampler vial). מזקו שישה מיקרוליטרים (6 µL) מכל דגימה של פракציית חילוף קטיוני חזק לתוך עמודת לכידה (trap column). ארזו אותה עד לאורך של שני סנטימטרים (2 cm) בחומר carbon 18.

הפעילו את שיטות הפרדה אנליטית ורכישת נתונים בספקטרומטר מסות. בוצע ניתוח cPilot מסוג 12-plex של רקמות ממוח, לב וכבד מדגם עכברים למחלת אלצהיימר ומבישגרי פרא (wild type). נתוני הפרקורסור הראו פפטידים עם דמתילציה קלה וכבדה המיוצגים על ידי הפיקים ב-m/z 643.854 ו-647.875.

פפטידים אלו נבחרו, בודדו באופן עצמאי, ועברו פרגמנטציה באמצעות דיסוציאציה מושרית התנגשות (collision induced dissociation) כדי להפיק ספקטרה אלה. תוצאות החיפוש הצביעו על כך שהפיקים שייכים לפפטיד של החלבון phosphoglycerate kinase one. פיקים אלו בודדו עוד יותר עבור ספקטרומטריית מסה טנדם בשיטת דיסוציאציה התנגשותית בעלת אנרגיה גבוהה (higher energy collusional dissociation), ויוני הדוח (reporter ions) נצפו כפי שמוצג.

שתי סדרות של ספקטרומים של ספקטרומטריית מסות בשלושה שלבים נחוצות כדי לקבל מידע על 12 הדגימות. בדוגמה זו, היחסים בין היונים של קבוצת מחלת האלצהיימר לקבוצת הביקורת מסוג הבר (wild type) דומים בשני החזרים הביולוגיים עבור רקמות של מוח, כבד ולב. ערכי שינוי הקיפול (fold change) עבור כל השוואה מעידים כי רמות של phosphoglycerate kinase 1 במוח ובלב גבוהות יותר בעכברי אלצהיימר, אך נמוכות יותר בכבד.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בערך בחמישה שעות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנקוט במשנה זהירות בטיפול בדגימות. כחלק מהליך זה, ניתן לבצע שיטות הפרדה כגון חילוף קטיונים חזק (strong cation exchange) או פרקציונציה ב-pH גבוה, במטרה להגדיל את עומק הכיסוי היומי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה של האופן שבו ניתן לשפר את המולטיפלקס של הדגימות באמצעות C-Pilot.