לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

המטרה הכוללת של שיטת מולטיפלקס משופרת זו היא להגדיל את מספר דגימות החלבון שניתן לנתח בו זמנית תוך הפחתת שגיאת הדגימה וזמן המכשיר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הזדקנות, מחלות ניווניות, מחלות אחרות הקשורות לגיל וסרטן הקשורות לפתוגנזה, התקדמות, אבחון, פרוגנוזה ומטרות טיפוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור תמונת מצב מקיפה של שינויים בחלבון בתנאים רבים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלת אלצהיימר במודל עכברים, ניתן ליישם אותה גם על דגימות רקמה מחולה עם אלצהיימר או מגוון הפרעות אחרות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ימצאו אותה מאתגרת מכיוון שישנן מספר דוגמאות לטפל בו זמנית במסגרת זמן קצרה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר זיהינו שניתן לשלב אצטילציה עם תיוג איזוברי עבור חנקת חלבון, מה שהניע אותנו לגרום לטכניקה לעבוד באופן גלובלי עבור כל הפפטידים.

מחקר זה ינתח רקמות מוח, לב וכבד ממודל עכברים של מחלת אלצהיימר ובקרות מסוג בר. העבירו 60 עד 90 מיליגרם מכל דגימת רקמה לצינור ליזינג, והוסיפו 500 מיקרוליטר PBS עם שמונה אוריאה טוחנת. הומוגניזציה של הדגימות באמצעות הומוגנייזר מכני.

הסר את הרקמה ההומוגנית מצינור הליזינג והעביר לצינור מיקרו-צנטריפוגה. שטפו את צינור הליזינג עם 100 עד 500 מיקרוליטר PBS עם שמונה אוריאה מולרית ושלבו את תמיסת השטיפה עם הרקמה הומוגנית. צנטריפוגה הרקמה הומוגנית למשך 15 דקות.

הצמד את הסופרנטנט מכל דגימה. לאחר ביצוע בדיקת ה-BCA לקביעת ריכוז החלבון, הוסף 100 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה המסומנים בנפרד. הוסף דיתיותרייטול לכל דגימה.

ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הוסיפו יודואצטמיד, IAM, לכל דגימה, ודגרו על קרח בחושך למשך שעתיים. לאחר מכן, הוסיפו L-ציסטאין לכל דגימה, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, הוסף טריס באפר עם סידן כלורי כדי לדלל אוריאה לריכוז סופי של שתי טוחנות. הוסף L1 tosilimitotophenylethylcholer טריפסין שטופל במתיל קטון לכל דגימה. ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

למחרת, יש להרוות את עיכול החלבון על ידי הקפאת הדגימה בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד להמשך עיבוד. לפני תיוג דימתילציה, דגימות הפפטיד מותפלות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ומיובשות על ידי צנטריפוגה ואקום. כדי להתחיל בהליך תיוג הדימתילציה, הרכיבו מחדש את הפפטידים בחומצה אצטית 1% המומסת ב-HPLC או במים בדרגת ננו-טהור.

הסר חלק של 50 מיקרוגרם מכל דגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. אחסן את שארית הפפטידים המשוחזרים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לניסויים עתידיים. בשלבים שיודגמו בהמשך, קריטי להוסיף ריאגנטים במהירות כדי שהתגובות הכימיות המאפשרות יתרחשו באותו פרק זמן עבור כל הדגימות.

הוסף שמונה מיקרוליטרים של תמיסת פורמלדהיד של 60 מילי-מולרית לדגימות לתיוג עם דימתילציה קלה. הוסף שמונה מיקרוליטרים של תמיסת פורמלדהיד פחמן 60 מילי-מולרית 13 עם תווית פורמלדהיד לדגימות לתיוג עם דימתילציה כבדה. הוסף שמונה מיקרוליטרים של נתרן ציאנובורוהידריד 24 מילי-מולרי לדגימות המסומנות בדימתילציה קלה.

הוסף שמונה מירקוליטרים של נתרן ציאנובורורודודריד 24 מילי-מולרי לדגימות המסומנות בדימתילציה כבדה. מערבלים את הדגימות, ולאחר מכן מנערים בעדינות על שייקר צינור כ-10 דקות בטמפרטורת החדר. להרוות את התגובות על ידי הוספת 16 מיקרוליטר של 1% אמוניה למשך חמש דקות.

החמצה מחדש של תערובות התגובה על ידי הוספת שמונה מיקרוליטרים של 5% חומצה פורמית. שלב את הפפטידים הקלים והכבדים כדי ליצור בסך הכל שש דגימות. בצע התפלה לדוגמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

וייבש את הדגימות באמצעות צנטריפוגה ואקום. כדי להיות תיוג איזוברי של הדגימות הדימתיליות, ראשית, יש להרכיב מחדש 100 מיקרוגרם של פפטידים דימתיליים וטריאתילאמוניום ביקרבונט, או מאגר TEAB. לאחר מכן, הכינו ריאגנטים איזובריים על פי פרוטוקול היצרן של ערכת התיוג האיזוברית.

הוסף את הנפח המתאים, במקרה זה, 41 מיקרוליטר של מגיב התיוג האיזוברי המסיס לכל אחת מדגימות הפפטיד, ומערבולת למשך כ-10 שניות. לנער את הדגימות על שייקר צינור מיקרו-צנטריפוגה למשך כשעה בטמפרטורת החדר. כדי להרוות את התגובות, הוסף 8 מיקרוליטר הידרוקסילאמין לכל דגימה.

ודגרו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. אגד את שש הדגימות המסומנות לתערובת אחת והמלח. הכן את הפפטידים לכרומטוגרופיה נוזלית על ידי בנייה מחדש של הפפטידים במים בדרגת ספקטרומטריית מסה עם 0.1% חומצה פורמית.

הוסף פפטידים משוחזרים לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל מסנן של 0.65 מיקרומטר. וצנטריפוגה ב 12, 000 פעמים גרם למשך דקה אחת. הסר והשליך את המסנן.

העבירו פפטידים מסוננים לבקבוקון דגימה אוטומטית. הזרקו שישה מיקרוליטר מכל דגימת סיעת חילופי קטיונים חזקה על עמוד מלכודת. אורזים לשני סנטימטרים עם חומר פחמן 18.

הפעל את שיטות ספקטרומטר המסה של הפרדה אנליטית ורכישת נתונים. בוצע ניתוח cPilot של 12 פלקסים של רקמות מוח, לב וכבד ממודל עכברים של מחלת אלצהיימר ובקרות מסוג בר. נתוני קודמים הראו פפטידים דימתיליים קלים וכבדים המיוצגים על ידי הפסגות ב-m/z 643.854 ו-647.875.

פפטידים אלה נבחרו, בודדו באופן עצמאי ופוצלו עם דיסוציאציה המושרה על ידי קנוניה כדי ליצור ספקטרום זה. תוצאות החיפוש הצביעו על כך שהפסגות שייכות לפפטיד של החלבון פוספוגליצרט קינאז 1. פסגות אלה בודדו עוד יותר עבור ספקטרומטריית מסה טנדם של דיסוציאציה באנרגיה גבוהה יותר ויוני המדווח נצפים כפי שמוצג.

שתי הקבוצות של ספקטרומטריית מסה תלת-שלבית נחוצות כדי לקבל מידע על 12 הדגימות. בדוגמה זו, יחסי היונים של מחלת אלצהיימר לסוג בקרה מסוג בר דומים בשני השכפולים הביולוגיים של רקמות המוח, הכבד והלב. ערכי שינוי הקיפול עבור כל השוואה מצביעים על כך שרמות הפוספוגליירט קינאז 1 במוח ובלב גבוהות יותר בעכברים עם מחלת אלצהיימר אך נמוכות יותר בכבד.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר מטיפול בדגימות. בשילוב הליך זה, ניתן לבצע שיטות הפרדה כמו החלפת קטיונים חזקים או פיצול pH גבוה על מנת להגדיל את העומק והכיסוי לכל יום.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשפר את ריבוב הדגימה באמצעות C-Pilot.