ושאריות או זיהוי של Interpositional תלות המציין מבני / צמודות תפקודית: אופטימיזציה של חלבונים סינטטיים
14 ביולי 2015
רצפי חלבונים סינתטיים המבוססים על מוטיבים קונצנזואליים מתעלמים בדרך כלל משאריות מתפתחות משותפת, המרמזות על תלות אינטרפוזיציונית (IPD). IPDs יכולים להיות חיוניים לפעילות, ועיצובים המתעלמים מהם עלולים לגרום לתוצאות לא אופטימליות. פרוטוקול זה משתמש ב-StickWRLD כדי לזהות IPDs ולסייע בתכנון חלבון רציונלי, וכתוצאה מכך תוצאות יעילות יותר.
המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות שאריות בעלות-אבולוציה (co-evolving residues) ביישורי חלבונים, המרמזות על תלויות בין-מיקומיות או IPDs. דבר זה מושג תחילה על ידי טעינת היישור לתוך stick world, שהוא כלי לניתוח ויזואלי היוצר ייצוג תלת-ממדי אינטראקטיבי של יישור חלבונים ומציג בבירור שאריות בעלות שונות משותפת (co varying residues) בתוך stick world. כל מיקום ביישור מיוצג כעמוד המורכב מערימה של כדורים, כדור אחד עבור כל אחת מ-20 החומצות האמינו האפשריות באותו מיקום בתוך היישור, כאשר גודלם נקבע בהתאם לתדירותם; העמודים המייצגים כל מיקום עוטפים גליל כדי לייצג את ה-IPDs.
קוים נמתחים בין שאריות המשתנות יחד (co-evolving) במידה גבוהה או נמוכה יותר ממה שהיה צפוי אילו השאריות בעמדות אלו היו תלויות בתוך התוכנית. השארית מכוילת עד למספר בר-ניהול של קצוות, ולאחר מכן מזוהים הקצוות הרלוונטיים. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-stick world כדי לזהות שאריות המשתנות יחד זו עם זו.
שאריות כיסוי נדרשות תפקודית כאלה זוהו ב-ventilate kinase. אחת הסיבות לכך שאנשים מתקשים בתהליך זה היא החידוש שלו. מדובר כמעט בצורה של אמנות כשם שמדובר במדע.
הדגמה חזותית של Stick World היא חשובה מכיוון שזהו כלי לאנליזה חזותית הדורש אינטראקציה של המשתמש. פעולה: השתמש במחשב בעל מעבד Intel i5 או טוב יותר עם לפחות 4 GB של RAM, המריץ Mac OS 10 או Linux OS, ומצויד בספריות ה-Python המפורטות בפרוטוקול הטקסט. הורד את Stick World כארכיון zip המכיל את כל סקריפטי ה-Python הרלוונטיים.
בנוסף, הורד את הסקריפט FASTA two stick להמרת יישורי רצפי DNA וחלבון בפורמט fasta סטנדרטי לפורמט stick world. חלץ את הארכיון והנח את תיקיית ה-stick world שהתקבלה ואת הסקריפט FASTA two stick על שולחן העבודה. לאחר מכן, צור יישור של רצפי החלבונים באמצעות כל תוכנת יישור סטנדרטית.
שמרו את היישור על שולחן העבודה. הגדירו פורמט. פתחו את אפליקציית הטרמינל במחשב ה-Linux והגיעו לשולחן העבודה על ידי הקלדת CD tilda slash desktop ולחיצה על Enter בטרמינל.
הקלידו את הפקודה להפיכת הסקריפט FASTA two stick לניתן להרצה, ולאחר מכן הקלידו את הפקודה להרצת הסקריפט. עקבו אחר ההוראות המופיעות על המסך שמספק הסקריפט כדי להגדיר את שם קובץ הקלט ואת שם הפלט הרצוי. שמרו את קובץ הפלט על שולחן העבודה.
נווט אל תיקיית קבצי ההרצה של stick world באמצעות אפליקציית הטרמינל של מחשב ה-Mac או ה-Linux והפעל את stick world על ידי הקלדת Python -32 stick world demo PI בטרמינל. ודא שפאנל טעינת הנתונים של stick world גלוי על המסך. לאחר מכן, טען את יישור רצפי החלבונים שהומרו על ידי לחיצה על כפתור load protein.
בחר את הקובץ שנוצר ולחץ על "פתח" (open). תוכנת stick world תפתח מספר חלונות חדשים, כולל את stick world control ו-stick world open gl. בחר בחלון stick world open GL. בחר ב-reset view מהתפריט של open GL כדי להציג את ויזואליזציית ברירת המחדל של stick world במבט מלמעלה דרך הגליל, המייצגת את הנתונים בחלונות ה-open GL הניתנים לשינוי גודל.
קיימות מספר אפשרויות תצוגה ב-stick world. סמנו את תיבות הבחירה עבור תוויות עמודות (column labels) ותוויות כדורים (ball labels) בחלונית הבקרה של ה-stick world כדי להציג את הערכים עבור העמודות והכדורים. בטלו את סימון תיבת הבחירה עבור קצוות עמודות (column edges) בחלונית הבקרה של ה-stick world כדי להסתיר את קווי קצוות העמודות.
הגדירו את עובי העמודה ל-0.1 בחלונית הבקרה של ה-stick world כדי לצייר קו דק דרך העמודות. כדי להקל על הניווט בתצוגת התלת-ממד, לחצו על enter לאישור השינוי. הגדירו מחדש את התצוגה בחלון ה-open GL של ה-stick world.
לאחר מכן, לחצו על כפתור המסך המלא כדי להגדיל את התצוגה לצורך ניווט בתוכנה. סובבו את תצוגת עולם המקלות התלת-ממדית על ידי לחיצה ממושכת על לחצון העכבר השמאלי תוך כדי הזזת העכבר לכל כיוון. בצעו זום לתצוגת עולם המקלות התלת-ממדית על ידי לחיצה ממושכת על לחצון העכבר הימני תוך כדי הזזת העכבר למעלה או למטה.
דפדפו בתצוגה באמצעות גרירה וזום; שאריות המשתנות יחד (co-evolving residues) העומדות בתנאי הסף של הן p והן residual מחוברות באמצעות קווי קשת. אם ישנם יותר מדי או מעט מדי קשתים המחברות בין השאריות, שנו את סף ה-residual כדי להציג פחות או יותר קשתים. הגבירו את סף ה-residual בבקרת stick world עד שלא יופיעו קווי קשת של IPD, ולאחר מכן הפחיתו אותו באיטיות עד להופעת קשרים. המשיכו להגביר את ה-residual עד שיהיה מספר מספיק של קשרים לבחינה.
זהו קשרי גומלין הכוללים שאריות בעלות עניין ידוע או שאריות המרוחקות זו מזו בתוך ההלימה באמצעות לחיצה על מקש command יחד עם לחיצה שמאלית, ובחר את הקשתים הרלוונטיים. חלונית הבקרת ה-stick world תציין את העמודות ותחבר שאריות ספציפיות. קווים רציפים מייצגים קשרים חיוביים.
בעוד שקווים מקווקווים מייצגים קשרים שליליים. לחץ על כפתור output edges בלוח הבקרה של stick world כדי לשמור קובץ בפורמט טקסט פשוט של כל הקשתים הנראים בספריה המתאימה, כולל השאריות של המפרקים והערכים השאריתיים הממשיים שלהן. צבר גדול של תלויות בין-מיקומיות (interpositional dependencies) או IPDs, הכולל קשר בין שלושה צמתים בין glycine במיקום 1 32, tyrosine במיקום 1 35 ו-proline במיקום 1 41, נראה בחזית.
כאן, נקודת המבט הוטה כדי למקם את המשתמש מעט מעל הגליל, ובכך נחשף IPD בין היסטמין במיקום 1 36 למתיונין במיקום עשרים ותשעה המרוחקים במאה ושבעה שאריות. לעומת זאת, מוטיב נגזר מ-A-P-A-M-H-M-M של אותו דומיין אינו מזהה אלו כשונות של מוטיב המתרחשת באופן ספציפי יחד, וכן מגדיר את הקיבובים הכלליים בסכמה שאינה נתמכת ביולוגית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנסות זאת בשתי דרכים שונות.
התחילו עם שארית גבוהה והתקדמו כלפי מטה, או התחילו עם שארית נמוכה והתקדמו כלפי מעלה, ובדרך זו תוכלו לחקור את המרחב בשתי דרכים שונות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה משתמש ב-StickWRLD כדי לזהות שאריות בעלות-אבולוציה ביישור רצפי חלבונים, תוך הדגשת תלויות בין-מיקומיות (IPDs) החיוניות לפעילות החלבון. על ידי שילוב של IPDs בתכנון חלבונים, חוקרים יכולים להשיג תוצאות יעילות יותר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- עיצוב חלבונים
- ביואינפורמטיקה
- ביולוגיה מבנית
רקע
- שאריות המתפתחות במקביל מעידות על תלויות בין-מיקומיות (IPDs).
- התעלמות מ-IPDs עלולה להוביל לעיצובי חלבון שאינם אופטימליים.
- StickWRLD הוא כלי אנליטיקה ויזואלית לניתוח יישור חלבונים.
- הבנת IPDs חיונית לעיצוב רציונלי של חלבונים.
מטרת המחקר
- לזיהוי שאריות המתפתחות יחד המרמזות על IPDs.
- לשיפור היעילות של תהליכי עיצוב חלבונים.
- להדגמת התועלת של StickWRLD בוויזואליזציה של יישור חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טעינת יישורי חלבונים לתוך StickWRLD.
- ויזואליזציה של שאריות בעלות קו-אבולוציה באמצעות ייצוגים תלת-ממדיים.
- התאמת ספי השאריות לזיהוי קשרים מובהקים.
- הפקת נתונים על IPDs שזוהו לצורך ניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- זיהוי IPDs משמעותיים ברצפי חלבונים.
- ויזואליזציה של שאריות בעלות אבולוציה משותפת באמצעות מודלים תלת-ממדיים אינטראקטיביים.
- הדגמה של חשיבותם של IPDs בתפקוד החלבון.
- יישום מוצלח של StickWRLD בניתוח יישור רצפי חלבונים.
מסקנות
- שילוב של IPDs בתכנון חלבונים יכול לשפר את הפעילות.
- StickWRLD משמש ככלי יעיל להדמיה של אינטראקציות בין חלבונים.
- הבנת קו-אבולוציה היא קריטית להנדסת חלבונים רציונלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
זיהוי תלויות בין-מיקומיות (IPDs) ברצפי חלבונים מאפשר תכנון מדויק יותר של חלבונים סינתטיים על ידי חשיפת קשרי שאריות שנשמרו אבולוציונית ומשפיעים על קיפול, יציבות ותפקוד. התעלמות מקווריאציות אלו עלולה להוביל ליצירת רצפי קונסנזוס שאינם חיוניים וחסרי רלוונטיות ביולוגית. StickWRLD מספק גישה של אנליטיקה ויזואלית לזיהוי תלויות אלו, ובכך תומך בהנדסה רציונלית של חלבונים טיפוליים עם ביטחון חיזוי משופר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: חושף שאריות הקשורות תפקודית שעשויות להעיד על אתרים מבניים או קטליטיים קריטיים בחלבוני מטרה.
- ערך תפעולי: מאפשר חקירה מונחית-השערות של קו-וריאציה של שאריות לצורך הפחתת סיכונים במנגנוני מטרה בשלב מוקדם של הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: זיהוי זוגות שאריות המשתנים יחד (co-evolving), אשר יכולים להנחות את התכנון של וריאנטים מיוצבים של חלבונים לשיפור העמידות של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תמיכה בפיתוח של תשומות חלבון סטנדרטיות עם ממשקים פונקציונליים שמורים לצורך סריקה הניתנת לשחזור.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין קו-וריאציה של רצפים למוטיבים מבניים שעשויים להתואם עם דומיינים תפקודיים הרלוונטיים למנגנוני מחלה.
- ערך תפעולי: מקל על תרגומם של עיצובים המבוססים על IPD למודלים פרה-קליניים על ידי שימור אינטראקציות של שאריות הדומות למצב טבעי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בזרימת העבודה של הגילוי על ידי מתן מידע לאישור המטרה באמצעות תובנות מכניסטיות, ומאפשרת אופטימיזציה של מולקולות מובילות (leads) באמצעות תכנון מונחה-מבנה המבוסס על קו-וריאציה אבולוציונית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי הדגשת רשתות שאריות שעשויות לעמוד בבסיס התפקוד החלבוני או הבקרה האלוסטרית.
- סריקה: מאפשר הכנה של גרסאות חלבון עם משטחי אינטראקציה שמורים, ובכך משפר את העקביות של המעורבות עם המטרה בבדיקות.
- אנליטיקה: מייצר נתונים כמותיים של קצוות (ערכי שאריות) בין שאריות המתפתחות במקביל, לצורך דירוג ותיעדוף של היפותזות מבניות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דפוסים אבולוציוניים לרצף מבני, ומסייע בתכנון חלבונים עם תפקוד שמור על פני מודלים שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר של אנליטיקה ויזואלית לתכנון חלבונים איטרטיבי במגוון מטרות ופרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בעיצוב חלבונים על ידי התחשבות באינטראקציות של שאריות המוגבלות אבולוציונית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות ויזואליזציה סטנדרטית וזיהוי של זוגות המשתנים יחד (co-evolving) המותאם לסף גילוי.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי שיפור הסבירות הביולוגית של חלבונים סינתטיים בשלב מוקדם של הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכונים של מועמדים להנדסת חלבונים, בהתבסס על תלויות מבניות ותפקודיות של שאריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור רצפי חלבונים ובניתוח אבולוציוני.
- נדרשת תחנת עבודה עם Python 3.2+, תמיכה ב-OpenGL וספריות ספציפיות להרצת StickWRLD.
- דורש יישורי קלט סטנדרטיים והגדרות סף עקביות לצורך זיהוי IPD הניתן לשחזור בין צוותים שונים.
- כולל בדיקה ידנית של הדמיות תלת-ממדיות לזיהוי אינטראקציות של שאריות בעלות רלוונטיות ביולוגית.
- מוגבל על ידי האיכות והעומק של יישור הרצפים המרובה (MSA) של הקלט, דבר המשפיע על עוצמת אות הקו-וריאציה.
