ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

מאמר זה מדגים את השימוש בתיוג רדיו רודף דופק בשילוב עם קישור פוטו-צולב ספציפי לאתר כדי לנטר אינטראקציות בין חלבון מעניין לגורמים אחרים ב-E. coli. בניגוד לשיטות הצלבה כימיות מסורתיות, גישה זו מייצרת "תמונות" ברזולוציה גבוהה של מסלול הרכבה מסודר בתא חי.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון בתוך תא חי. זה מושג על ידי ביטוי ראשון של חלבון מעניין באי קולי, שילוב חומצת האמינו האנלוגית בנזואיל פניל אלנין בחלבון במיקום ספציפי וביצוע תיוג רדיו של מרדף דופק כדי לתייג אוכלוסייה קטנה של מולקולות חלבון מסונתזות באופן סינכרוני. כצעד שני.

כמויות של תאים שנאספו בנקודות זמן שונות במהלך המרדף מוקרנות כדי לעורר היווצרות קשרים קוולנטיים בין החלבון המעניין לבין כל הגורמים שהוא מקיים איתם אינטראקציה. לאחר מכן, חלבונים משקעים חיסונית עם נוגדנים ספציפיים ונפתרים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל SDS poly acrylamide על מנת לזהות גורמים אינטראקטיביים, מתקבלות תוצאות המראות שינויים באינטראקציות בין החלבון המעניין לגורמים תוך-תאיים אחרים לאורך זמן בהתבסס על שינויים בניידות האלקטרופורטית של תוצרי קישור צולב. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קו-אימונו-משקעים או קישור צולב כימי, הוא יכולתה לייצר מידע זמני על אינטראקציות המתרחשות בין שאריות ספציפיות בחלבון מעניין לבין מולקולות אחרות.

נתונים כאלה חשובים במיוחד כאשר חוקרים התקדמות של חלבון דרך מסלול הרכבה רב-שלבי וכדי לזהות מתווכי הרכבה. למרות ששיטה זו עברה אופטימיזציה לשימוש באי קולי, ניתן להשתמש בה גם במערכות אחרות, כולל חיידקים אחרים, שמרים ותאי יונקים. פרטים להכנת תרבית ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.

הכינו בקצרה חמישה מיליליטר של M, תשע מדיום המכיל 0.2% גליצרול, כל חומצות האמינו למעט מתיונין וציסטין ואנטיביוטיקה התחילו תרביות לילה על ידי הוספת אי קולי שהפך עם פלסמיד המקודד לחלבון המעניין עם מוטציה ענברית, והפלסמיד המקודד למערכת דיכוי הענבר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. ביום הניסוי, הוסף כמות מתאימה של תאים מתרבית הלילה לבקבוק ארלנמאייר של 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של מדיום M תשע ואנטיביוטיקה כדי לקבל צפיפות אופטית של 550 ננומטר של 0.03. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד.

כאשר התרביות מגיעות לשלב היומן המוקדם עד האמצעי, הוסיפו 50 מיקרוליטר של בנזואיל פנילאלנין או BPA טוחנת אחת לכל תרבית. הוסף BPA טיפה אחת בכל פעם תוך כדי סיבוב הבקבוק כדי למנוע משקעים. לאחר מכן, הוסף את כל המשרתים הדרושים כדי להניע את הביטוי של המוטציה הענברית.

המשיכו לדגור על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות במהלך תקופת האינדוקציה של 30 דקות. סמן שישה צינורות צנטריפוגה חד פעמיים של 15 מיליליטר עם נקודת הזמן ובתוספת UV או מינוס UV. הנח את הצינורות המסומנים על קרח.

מניחים צלחת תרבית רקמות של שש בארות על גבי דלי קרח שני מלא בקרח. הפעל את ה-UV lamp חמש דקות לפני תיוג הרדיו. לאחר מכן הוסף כשני מיליליטר קרח לכל צינור המסומן מינוס UV ולשתיים מהבארות בצלחת מרובת הבארות.

חיוני לשדר קרח ישירות לתוך הצינורות והבארות כדי לעצור את התגובות התוך תאיות באופן מיידי בכל נקודת זמן ובכך לקבל תמונת מצב מדויקת של המסלול הביוכימי בתום תקופת האינדוקציה של 30 דקות. העבירו 25 מיליליטר מהתרבות לבקבוק ארלנמאייר חד פעמי של 125 מיליליטר מחומם מראש. מניחים את הבקבוק באמבט מים רועדים של 37 מעלות צלזיוס.

השלבים בתיוג דופק וקרינת UV חייבים להתבצע בזמן ודורשים ארגון רב והכנה מתקדמת. הוסף 30 מיקרו קורי למיליליטר של S 35 המסומן מתיונין וציסטאין לתרבית וערבב במהירות כדי לערבב בכל פעם. דקה אחת אפס שניות.

הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת 100 מילי-מולרית מתיונין ציסטאין לא רדיואקטיבית והסתחרר במהירות. כדי לערבב מיד, פיפטה ארבעה מיליליטר מהתרבית לאחת הבארות של הצלחת המצוננת מרובת הבארות המכילה פיפטת קרח שנייה של ארבעה מיליליטר לתוך הצינור של 15 מיליליטר המסומן אפס דקות מינוס UV בכל פעם. שתי דקות אפס שניות.

פיפטה ארבעה מיליליטר מהתרבית לבאר שנייה של הצלחת המצוננת מרובת הבארות המכילה קרח. לאחר מכן הכניסו פיפטה נוספת של ארבעה מיליליטר לתוך שפופרת ה-15 מיליליטר המסומנת כדקה פחות UV מיד לפני נקודת הזמן של חמש הדקות בכשני מיליליטר קרח לבאר שלישית בצלחת מרובת הבארות לפעמים שש דקות אפס שניות. פיפטה ארבעה מיליליטר של התרבות לבאר השלישית של הצלחת המצוננת מרובת הבארות המכילה צינור קרח.

היה לי עוד ארבעה מיליליטר aliquot לתוך צינור ה-15 מיליליטר שסומן חמש דקות מינוס UV. הניחו את דלי הקרח עם צלחת הבאר המרובה מתחת למנורת ה-UV שחוממה מראש והקרינו כל דגימה בנפרד למשך ארבע דקות. העבירו את התאים לצינורות המצוננים של 15 מיליליטר המסומנים אפס דקות בתוספת UV, דקה אחת בתוספת UV וכן הלאה.

ואז תאי צנטריפוגה ב -2, 500 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש כל דגימה ב-300 מיקרוליטר של M תשע בינוני או PBS ו-33 מיקרוליטר של 100% חומצה טריכלורואצטית קרה או TCA כדי לזרז את צנטריפוגת החלבונים שה-TCA משקע במיקרו פוגה במהירות מרבית למשך 10 דקות. לפני הסרת הסאט, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר מסיס לכל דגימה וחמם בערבול ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להמיס את החלבון המשקע.

לאחר הוספת מיליליטר אחד של בדיקת משקעים חיסוניים רדיו, מאגר מבצע משקעים חיסוניים סטנדרטיים באמצעות חמישית עד מחצית מכל דגימה. פתור את החלבונים המשקעים החיסוניים על ידי נתרן ESAL סולפט, אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד או דף SDS. לבסוף, חשפו את הג'לים המוכתמים והמיובשים למסך פוספו למשך הלילה וכדי לזהות חלבונים רדיואקטיביים כולל תוצרי קישור צולבים עם הדמיית פוספו.

לצורך ניסוי זה, קודוני אלנין pH בשאריות 1113 ו-1214 של תחום הבטא ESPP הוחלפו בקודוני ענבר. המבנה הגבישי של תחום הבטא ESPP מראה ששתי השאריות נמצאות שתיהן בצד הפרי-פלזמי של חבית הבטא, מופרדות בכ-120 מעלות. שני פוליפפטידים שונים הוזרמו חיסונית הן מתאי הקרנה והן מתאי ביקורת על ידי C terminal anti ESPP וסרום.

בתחילה, צורת מבשר של כ-135 קילודלטון של החלבון המכילה תחומי נוסעים ובטא מקושרים קוולנטית שלטו בנקודות זמן מאוחרות יותר. רמת ה-PRO ESPP ירדה ותחום הבטא החופשי החל לשלוט כאשר תחום הנוסעים היה טרנס הממוקם על פני הממברנה החיצונית ומופרד מתחום הבטא על ידי מחשוף פרוטאוליטי. עם זאת, לדגימות הקרנת UV I היו בבירור רצועות משקל מולקולרי גבוהות יותר שלא היו קיימות בדגימות הביקורת.

רצועות אלה נובעות מקישור צולב של PRO ESPP לחלבונים אינטראקטיביים על סמך הניידות של פוליפפטידים אלה, גדלי החלבונים האינטראקטיביים הוערכו כדי לבדוק אם הם עשויים להתאים לגורמי הרכבת חלבון הממברנה החיצונית הידועים. בוצעו משקעים חיסוניים נוספים באמצעות אנטי סרה שנוצרו כנגד השותפים המשוערים האינטראקציה. פוליפפטיד של כ-150 קילודלטון שנצפה כאשר BPA שולב בשתי השאריות 1113 ו-1214 יכול להיות מזורז חיסוני עם אנטי-סרום כנגד דילוג המלווה הפרי פלזמי של 17 קילודלטון.

יתר על כן, מצאנו כי פוליפפטידים גדולים יותר שנצפו כאשר BPA שולב רק באחד משני המיקומים יכולים להיות מזורזים חיסונית עם אנטי סרה כנגד תת-היחידות המורכבות של BAM, BAM B ו-BAM D בהתאמה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לטהר מוצרים צולבים ולבצע שיטות אחרות כולל ספקטרומטריית מסה כדי לסייע בזיהוי גורמים המקיימים אינטראקציה עם חלבון מעניין. לאחר צפייה בווידאו, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב בהצלחה תיוג מרדף דופק עם קישור צולב תמונות ספציפי לאתר כדי לחקור את הדינמיקה של האינטראקציה של החלבון שלך, המעניין עם מולקולות אחרות בתוך התא החי.