Name: ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למד שיטה לבידוד ושיתוף תרבות של גנגליון הטריגמינוס ונבטי שיניים בעכברים באמצעות התקני מיקרו-פלואידיקה. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות עצביות עם רקמות מטרה בסביבה מבוקרת ומספקת תובנות לביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מומנה על ידי אוניברסיטת ציריך. המחברים רוצים להודות לאסטרלה נטו ולד"ר מרים למגרי על עזרתם בביסוס תנאי התרבות המשותפת.

כל העכברים נשמרו וטופלו על פי חוק צער בעלי החיים השוויצרי ובהתאם לתקנות של משרד הקנטון הווטרינרית, ציריך. 1. הכנת Dissection חומר, תרבות מדיה, המכשירים microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים החיטוי מיקרו לנתיחה ומספריים (121 מעלות צלזיוס, זמן עיקור: 20 דקות) ולאחסן אותם במכל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר coverslips זכוכית (24 מ&quot;מ x 24 מ&quot;מ) על ידי דוגריהם ב 1 M HCl למשך 24 שעות על שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף אותם שלוש פעמים עם סטרילי H, מזוקק 2 O ושלוש פעמים עם אתנול 99%. יבש ולאחר מכן את coverslips על 37 מעלות צלזיוס או מתחת למכסת מנוע לזרום סטרילי. לבסוף, החיטוי או לחשוף את coverslips לאור UV (30 דקות) כדי להשלים את העיקור. אז יכול להיות מאוחסן בcoverslips 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקני בידוד AXIS אקסון מהחבילה באמצעות מלקחיים סטרילית ומניח אותם בצלחת פטרי סטרילי. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אגרוף ביופסית סטרילי (o: 1 מ&quot;מ) ליצור חור אחד לדגימה ללהיות מתורבת (איור 1) בהתכתבות של תאי התרבות. הערה: אל אגרוף קרוב מדי לmicrogrooves, כפי שהם עלולים להיפגע על ידי הלחץ המופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכשירי בידוד AXIS אקסון ידי immerging באתנול 70%. יבשים אז התקני AXIS אקסון בידוד וcoverslips תחת מכסה המנוע זרימת סטרילי לגמרי. חכה מינימום של 3 שעות לפני שתמשיך. הערה: ייבוש חלקי תגרום הרכבה לקויה של מכשירי microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל coverslip לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ או לתוך באר בתוך צלחת 6 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מכשיר בידוד AXIS אקסון על coverslip ולחץ בעדינות אך בתקיפות עם מלקחיים עם קצוות מקופלים על מנת לאפשר הדבקה מלאה בין מכשיר הבידוד וcoverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל חדר תרבות, פיפטה 150 μl של פולי-D ליזין (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל בסטריליים, מזוקקת H 2O). הנח את מכשירי microfluidic תחת ואקום במשך 5 דקות, כדי להסיר את כל האוויר מתאי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אוויר עדיין ניתן לראות בתוך התאים, מחדש פיפטה פתרון poly-D- ליזין לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המכשירים עם O פולי-D ליזין / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלושה זמן עם סטרילי H, מזוקק 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא תאים עם 150 פתרון μl laminin עובד (סיגמא אולדריץ, 5 מיקרוגרם / מיליליטר, ב PBS או בינוני סרום ללא), ודגירת O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של מדיום לתרבויות גרעיני trigeminal 37, מורכב כדלקמן: 48 מיליליטר Neurobasal בינוני, 1 מיליליטר B-27, 100 U / פניצילין / סטרפטומיצין, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 5 ng / גורם גדילה עצבית מיליליטר מיליליטר (NGF) , Arabinoside ציטוזין 12:25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של מדיום לתרבויות נבט שן 37, מורכב כדלקמן: 40 מיליליטר DMEM-F12, בסרום שור עוברי 10 מיליליטר (FBS ריכוז, סופי: 20%), 100 U / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 150 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית. </li></ol> דור העובר 2. עכבר וDissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע גיל עוברי על פי התוספת נרתיק (תוסף נרתיק: יום עוברי של התפתחות 0.5, E0.5) ולאשר אותה באמצעות קריטריונים מורפולוגיים. לפרוטוקול זה, אנחנו בדרך כלל להשתמש בעוברי עכברי E14.5-E17.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האזור לנתיחה וstereoscope עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את האמא בהריון באמצעות נקע בצוואר הרחם. לחסום את הצוואר של העכבר עם האצבע הראשונה ושנייה על גבי רשת, ולמשוך עם החלטת הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העור סביב הבטן התחתונה, ולפתוח את הבטן באמצעות מספריים. אתר את הרחם: בשלבים מאוחר כל כך של הריון, הרחם למלא את חלל הבטן בשפע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרחם ומקום בצינור מלא PBS על קרח. כאשר על קרח, הרקמות ניתן להשאיר לכמה שעות. מחק את הגופה של האם על פי הנחיות מוסדיות </li> &lt;li&gt; לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic. מניחים את העוברים בPBS על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העוברים באמצעות מספריים, ולהפריד את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה (איור 2 א). הסר בדיוק הלסת התחתונה, מבלי לפגוע בגרעינים המשולש; כהאחרונים מקומיים בסמיכות ללסת התחתונה, הנזק המקרי שלהם הוא אפשרי. לשמר את הלסת תחתונה ושאר הראש בקור PBS, על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח TG, לקחת את הראש ומניח אותו על גבי צלחת פטרי זכוכית לנתיחה, מילאה בעבר עם PBS הקר. שימוש במלקחיים, להסיר את העור ואת הגולגולת. הסר אז telencephalon והמוח הקטן על ידי הצבת מלקחיים מתחת לtelencephalon והמעלית; telencephalon והמוח הקטן תהיה להעיף ביחד, משאירים את החלק התחתון של הגולגולת החשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הגרעינים המשולש (שמוצגים באיור 2 ב). השתמש במלקחייםלהפריד את TG מהעצבים המשולש. לחסל את השאריות של תחזיות trigeminal באמצעות המחטים לנתיחה כסכינים. מניחים את TG גזור בצלחת פטרי מלאה PBS הקר ולשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שיניים עובריות, למקם את הלסת התחתונה, נפרדה בעבר מהגולגולת, על צלחת פטרי זכוכית לנתיחה, מלאה PBS הקר. שימוש במחטים לנתיחה כסכינים, להסיר את הלשון והעור שמסביב הלסת. הפרד את השמאל וחם-לסתות תקין על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. חיידקי השן בקלות לעין, כפי שמוצגים באיור 1 ג. לבודד את חיידקי השן באמצעות מחטים לנתיחה ולהסיר את העודפים של רקמות שאינן שיניים. מניחים את חיידקי שן גזור בצלחת פטרי מלאה PBS הקר ולשמור אותם על קרח. </li></ol> 3. Microfluidic שיתוף תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נתיחה, להסיר laminin ממכשירי microfluidic. מלא את התאים עם 200 μl של respectiיש תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להעביר בעדינות את חיידקי TG ושן גזורים לתוך החורים שנוצרו על ידי ניקוב (1D איור). ודא שחיידקי השן לא יצופו ושהם שוקעים עד שקשר עם coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות דגימות חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מדיום התרבות כל שעה 48. לא לרוקן את התאים לחלוטין, ולא פיפטה ישירות לתאי התרבות. התרוקנות מלאה של תאים יגרמו להיווצרות של בועות אוויר בתוך התאים; pipetting הישיר לתוך התא יגרום לניזק axonal. כדי למנוע בעיות אלה, להסיר את המדיום מצביע פיפטה לכיוון הצד החיצוני של הבארות; באופן דומה, פיפטה בינונית הטרי בצד של הבארות ממוקמות מול לתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת התרבות, ניתן הדמיה שיתוף תרבויות בקלות על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות. שיתוף תרבויות יכולות להישמר במשך 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר Perio התרבותד, לשטוף את התאים על ידי pipetting 150 μl של PBS לתוך היטב אחד לכל תא, ומאפשר לי PBS לזרום דרך התאים שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולתקן את הדגימות על ידי pipetting 150 μl של paraformaldehyde 4% (PBS) ובאחד לתא; לדגור על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כמתואר ב3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בניתוח נוסף. </li></ol>

<ol><li>Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).</li>
<li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+dependence+in+tissue%2C+organ%2C+and+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li>
<li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).</li>
<li>Katayama, Y., Battista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+sympathetic+nervous+system+regulate+hematopoietic+stem+cell+egress+from+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.</a> Cell. 124 (2), 407-421 (2006).</li>
<li>Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).</li>
<li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Science%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science(New York, N.Y.)</a>. 329 (5999), 1645-1647 (2010).</li>
<li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
<li>Oakley, B., Witt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+sensory+receptors+on+the+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Building sensory receptors on the tongue.</a> Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).</li>
<li>Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogenesis+of+mouse+vallate+gustatory+epithelium+and+taste+buds+requires+BDNF-dependent+taste+neurons.+Brain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research.</a> Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).</li>
<li>Sun, H., Oakley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anterior+gustatory+epithelia+in+the+palate+and+tongue+requires+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor.</a> Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).</li>
<li>Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+size%2C+number%2C+and+morphology+of+gustatory+papillae+and+taste+buds+in+BDNF+null+mutant+mice+demonstrate+neural+dependence+of+developing+taste+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs.</a> The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+determination+during+tooth+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+reviews%22%5BJournal%5D)">Cell fate determination during tooth development and regeneration.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).</li>
<li>Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+study+of+the+innervation+of+developing+mouse+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">A histological study of the innervation of developing mouse teeth.</a> Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).</li>
<li>Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+nerve+fibres+during+development+of+embryonic+rat+molar+using+peripherin+and+protein+gene+product+9.5+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies.</a> Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).</li>
<li>Johnsen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+teeth%3A+qualitative%2C+quantitative%2C+and+developmental+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment.</a> Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+nerve+growth+factor+%28NGF%29+and+NGF+receptor+%28NGF-R%29+in+the+developing+first+molar+tooth+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat.</a> Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+in+odontogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins in odontogenesis.</a> The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).</li>
<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).</li>
<li>Kettunen, P., Løes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+trigeminal+axon+navigation+and+patterning+with+tooth+organ+formation%3A+epithelial-mesenchymal+interactions+and+epithelial+Wnt4+and+Tgfbeta1+regulate+semaphorin+3a+expression+in+the+dental+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme.</a> Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).</li>
<li>Tuisku, F., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+neural+influence+on+tooth+germ+generation+in+a+polyphyodont+species%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species.</a> Developmental biology. 165, 1-9 (1994).</li>
<li>Zhao, H., Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+rudimentary+diastema+tooth+primordia+are+devoid+of+peripheral+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+embryology%22%5BJournal%5D)">Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers.</a> Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).</li>
<li>Lumsend, A., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+study+of+timing+and+topography+of+early+tooth+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo.</a> Archives of oral biology. , 301-311 (1986).</li>
<li>Kollar, E., Lumsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+morphogenesis%3A+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Biologia+Buccale%22%5BJournal%5D)">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li>
<li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+tooth+morphogenesis+and+neuronal+development+through+tissue+interactions%3A+lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models.</a> Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li>
<li>Lumsend, A., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323 (9), 538-539 (1986).</li>
<li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).</li>
<li>Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nogo-A+regulates+neurite+fasciculation%2C+branching+and+extension+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system.</a> Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).</li>
<li>Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odontogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Odontogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 887, (2012).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Drouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+Pitx1+genomic+locus+affects+mandibular+tooth+morphogenesis+and+expression+of+the+Barx1+and+Tbx1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes.</a> Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).</li>
<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll%2Finterleukin-1+receptor+domain-containing+adapter+inducing+interferon-%CE%B2+mediates+microglial+phagocytosis+of+degenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).</li>
<li>Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+on+microfluidics%3A+multimodal+analysis+for+studying+celll-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction.</a> Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).</li>
<li>Neto, E., Alves, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neurons+and+osteoblasts%3A+close+partners+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment.</a> Integrative Biology. , (2014).</li>
<li>Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li>
<li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maxillary+factor%2C+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

קודם בניסויים במבחנה של עצבוב שן היו מבוסס על שיתוף תרבויות קונבנציונליות של הגרעינים המשולש ורקמות או תאים 26,28,29 שיניים. מחקרים אלה נערכו לחקור בעיקר את ההשפעות אטרקטיביות של תאים או רקמות אלה באקסונים חושיים 38. למרות שמביא התקדמות משמעותית בתחום, כמה בעיות טכניות הועלו. חיידקי שן מתחילים להידרדר לאחר כמה ימים של תרבות 37. בהתבסס על תצפיות אלה, תאי עצב ושיניים גדלו באותם תנאי התרבות לפגוע בכל ניתוח סופי של מולקולות מעורבות בשיחת ההכלא...

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות 1,2. יתר על כן, עצבוב מעורב בוויסות של התפשטות תאי גזע, גיוס ובידול 3-5. ואכן, מחקרים שנעשה לאחרונה הבינו ברקמות של המתחם orofacial הראו כי עצבים הפאראסימפתטית נחוצים לתפקוד תאי אפיתל בפיתוח וההתחדשות של בלוטות הרוק 6,7. באופן דומה, זה כבר הוכיח כי העצבוב הוא הכרחי לפיתוח והתחזוקה של בלוטות טעם 8-11. לפיכך, חשוב לנתח את התפקידים עדיין המוזנחים של עצבוב בפיתוח איברים אחרים חשובים orofacial ורקמות כגון שיניים. למרות העצבוב העשיר של שיניים למבוגרים, וזאת בניגוד לכל איברים ורקמות האחרים בגוף, develoשיני פינג מתחילות להיות מעוצבבים בשלבי הלידה המוקדמים. שיניים להתפתח כתוצאה מאינטראקציות רציפות והדדית בין האאקטודרם האוראלי וmesenchyme נגזר רכס העצבי גולגולתי. אינטראקציות אלה להצמיח ameloblasts נגזר אפיתל וodontoblasts נגזר mesenchyme שאחראי להיווצרות של אמייל והדנטין, בהתאמה 12. עצבים תחושתיים מהגרעינים המשולש ועצבים סימפטיים מגרעיני צוואר רחם מעולים מעצבבים את השיניים למבוגרים 13-15. במהלך עובר, סיבי עצב הנובעים מפרויקט הגרעינים המשולש כלפי חיידקי שן פיתוח ומקיפים אותם בהדרגה, אבל הם לא לחדור לתוך mesenchyme papilla השיניים 13. סיבי עצב להיכנס mesenchyme עיסת השיניים בשלבי התפתחות מתקדמים יותר המתואמים עם בידול odontoblast ומטריצת דנטין תצהיר 16. עצבוב עיסת שיניים הוא completed זמן קצר לאחר בקיעת השן בחלל הפה 13. מחקרים קודמים גילו כי semaphorins וneurotrophins השונים מעורבים בוויסות של עצבוב בodontogenesis 16-19. המחקרים קודמים הראו כי באופן ברור עצבוב הוא תנאי הכרחי להיווצרות שן בדגים 20. מחקרים מאוחרים יותר הראו שהומאוסטזיס של תאי גזע mesenchyme שיניים בשיניים חותכות עכבר מוסדר על ידי עצבים תחושתיים באמצעות הפרשה של קיפוד הקולי (ששש) 21. עם זאת, התפקיד של עצבוב בשן ייזום, פיתוח והתחדשות הוא עדיין שנוי במחלוקת ביונקים 22-24. שפע של מחקרי in vivo סיפק מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים 13,25,26. עם זאת, רוב אלה approכאבים אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת 26-29. במקביל, שיתוף culturing כפוף להתאמות טכניות שונות. לדוגמא, עצבים ורקמות ספציפיות שיניים (לדוגמא, עיסת שיניים, זקיק שיניים, השיניים אפיתל) לעתים קרובות דורש תקשורת ותרבות שונה על מנת להבטיח את הישרדות רקמה לפרקי זמן ארוך 30 - 32. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים) כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתי 27-29.עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation, וללמוד את הדינמיקה של סיבי עצב הסתעפות בתוך אברי מטרה. לכן, שיתוף תרבויות בלתי רציפה תהיה יותר מתאימות לביצוע מחקרים על אינטראקציות רקמות עצביות-שיניים. מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. במכשירים אלה, רקמות ותאי עצב שיניים מופרדות בתאים שונים, תוך מתן אפשרות לצמיחה של אקסונים מהגופים התא העצביים דרך microchannels כלפי התא המכיל רקמות היעד שלהם 33. מכשירי microfluidic כבר נעשו שימוש כדי ללמוד את יחסי הגומלין בין תאי עצב והמיקרוגלים 34,35, כמו גם תא לתא אינטראקציות בסרטן וneovascularization 35. יתר על כן, מערכות אלה היו בשימוש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין Dorsגרעיני אל שורש וosteoblasts 36. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופות זמן ארוכות כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic 37. יתר על כן, יש לנו הראינו ששיניים משלבי התפתחות שונים לשמור במבחנה בתנאים אלה את אותו האפקט דוחה או מושך על עצבוב המשולש שהם מראים בvivo 37. פרוטוקול זה מספק מידע על דרך פשוטה, חזקה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על כגון אינטראקציות בסביבה מבוקרת ומבודדת.

<table><tbody><tr><td>התקני בידוד AXON AXIS</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>מיקרו-ערוצים באורכים שונים זמינים</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי beta-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>בטא-NGF אנושי וחולדה (R& D Systems) מקבילים</td></tr><tr><td>ל-DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני microfluidic משותף התרבות

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות. עם זאת, מנגנוני תופעות אלה אינם מובנים היטב עדיין. בפרט, התפקיד של עצבוב בהתפתחות שן והתחדשות מוזנח. כמה מחקרים בvivo סיפקו מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים. עם זאת, רוב הגישות אלה אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים)כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתיים. עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation. מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופה ארוכה של זמן, כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic, וכי הם שומרים בתנאים אלה את אותו דפוס העצבוב שהם מראים בvivo. על בסיס זה, אנו מתארים כיצד לבודד ושיתוף התרבות מתפתחת חיידקי הגרעינים ושן המשולש בפרוטוקול system.This שיתוף תרבות microfluidic מתארת ​​בצורה פשוטה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על אינטראקציות כאלה בcontrolled וסביבה מבודדת.

תוצאות אלו מראות כי הגרעינים המשולש מבודדים יכולים לגדול בתא אחד של מכשיר microfluidic ו, בנוסף, כי הפיתוח של חיידקי שן הבודדים מתמשך לתקופה ארוכה של זמן בתא האחר של מכשיר microfluidic. תקשורת והתרבות שונה משמשות בשני תאים, וmicrogrooves בין שני התאים לאפשר הרחבה של האקסון מגנגליון trigeminal כלפי חיידקי שן המתפתחות. איור 3 מייצגת הדמיה של neurofilament באמצעות immunofluorescence 37, בשיתוף תרבות של עכבר הגנגליון עוברי המשולש וחותך עכבר עוברי במערכת שית...

תרביות משותפות מייצגות שיטה רבת ערך לחקר האינטראקציות בין עצבים לרקמות ואיברי מטרה. מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות תרבית משותפת של גנגליונים ואיברים או רקמות מתפתחים שלמים במצעי תרבית שונים, ובכך מייצגות כלי רב ערך למחקר במבחנה של הדיבור בין נוירונים למטרותיהם.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד לבודד ולגדל בתרבית משותפת (co-culture) את הגנגליונים התריגמינליים וניבצי השן המתפתחים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי עיקור, קיבוע וציפוי של התקנים המיקרופלואידיים. השלב השני הוא דיסקציה של הגנגליונים התריגמינליים וניבצי השן משלב התפתחותי ספציפי בעכבר הנחקר.בשלב הבא, הגנגליונים התריגמינליים ונבטי השן מוחדרים למכשירים המיקרופלואידיים ומגודלים יחד בתרבית משותפת. השלב הסופי הוא קיבוע התאים וצביגתם באמצעות אימונופלואורסצנציה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה כדי להראות את דפוס העצבוי שנוצר כתוצאה מהתרבית המשותפת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות משותפות (co-cultures) קונבנציונליות, הוא ששיטה זו מאפשרת תרבית משותפת של איברים ורקמות שונות, כאשר כל אחת מהן נמצאת במצע תרבית אופטימלי משלה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום החדשנות של השן, כגון תפקידן של מולקולות שונות בחידוש השן ותפקידה של החדשנות בהתפתחות השן. התחילו בעיקור באוטוקלאב של כלי הניתוח, הכוללים זוג פינצטות למיקרו-דיסקציה וזוג מספריים.בשלב הבא, עקרו קבוצה של כיסויי זכוכית בגודל 24 מילימטר על 24 מילימטר על ידי הנחתם בתוך תמיסה של חומצה כלורית 1 M במנער אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, שטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן בשלושה שטיפות ב-99% Ethanol, וייבשו אותם תחת מrepresents מזרים סטרילי. ברגע שהם יבשים, הפעילו את תאורת ה-UV של המזרים למשך 30 דקות. לאחר מכן, אחסנו את כיסויי הזכוכית ב-70% ethanol עד למועד השימוש בהם.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא בזהירות את התקני המיקרופלואידיקה לבידוד אקסונים מהאריזה שלהם, והניחו אותם בתוך צלח פטרי סטרילי באמצעות מחץ ביופסיה סטרילי של מילימטר אחד. צרו חור אחד בכל התקן עבור כל דגימה, בהתאמה לתאי התרבית.הקפידו לא להחורר קרוב מדי לחריצים המיקרוסקופיים, שכן הם עלולים להינזק מהלחץ. לאחר מכן, סטריליזו את המכשירים על ידי טבילה ב-70% ethanol, תוך הקפדה להוציא את כל בועות האוויר שנלכדו.לאחר מכן, הוצא את המכשירים מהאתנול ויבש אותם לחלוטין תחת מapay זרימה סטרילי. כמו כן, הוצא את כיסויי הזכוכית (cover slips) מתמיסת האתנול 70% והנח להם להתייבש תחת מapay הזרימה הסטרילי. המתן לפחות שלוש שעות לפני ההמשך.הניחו כל זכוכית כיסוי לתוך באר בתוך פלטה בעלת שישה בארות. לאחר מכן, הניחו את המכשיר המיקרופלואידי על זכוכית הכיסוי ולחצו בעדינות אך בחוזקה בעזרת פינצטה כדי לאפשר הידבקות מלאה בין מכשיר הבידוד לבין זכוכית הכיסוי.לאחר מכן, הניחו את ההתקנים המיקרופלואידיים בוואקום למשך חמש דקות כדי להוציא את כל האוויר מהתאים. אם עדיין ניתן לראות אוויר בתוך התאים, חזרו על הזרקת תמיסת ה-poly D lysine לתאים.הדגרימו את המכשירים עם poly de lysine למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, שטפו את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מלאו את התאים ב-150 µL של תמיסת עבודה lamin בריכוז 5 µg/mL, והדגירימו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הכינו מצע גידול עבור תרביות של ganglion trigeminale ונבט שן כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.נקה את אזור הנתיחה ואת הסטראוסקופ באמצעות אתנול 70% והנח את מכשירי הנתיחה לאחר ההריגה. נתח את העור מסביב לבטן התחתונה של עכברה ההרה עם עוברים בשלבי התפתחות E 14.5 עד E 17.5. לאחר מכן, פתח בזהירות את הבטן באמצעות מספריים.אתרו את הרחם, הוציאו אותו והניחו אותו במבחנה מלאה בקרח. בעזרת PBS קר, בדלו את העוברים והעבירו כל אחד מהם בנפרד לצלח פטרי חדש המלא ב-PBS קר מאוד. לאחר שכל העוברים הוצאו מהרקמות חוץ-עובריות, בצעו להם כריתה של הראש באמצעות מספריים.הפרידו את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות מיקרו-דיסקציה ומספריים, תוך הקפדה שלא לפגוע בגנגליונים התריגמינליים. לאחר מכן, קחו את הראש והניחו אותו על פטריה של זכוכית לדיסקציה שקוללה.לאחר מכן, מקמו פינצטה מתחת לראש (cephalon) והרימו. כדי להסיר את הראש ואת המוח הקטן (cerebellum), אתרו את הגנגליונים התריגמינליים והשתמשו בפינצטה ובמחטי דיסקציה כדי להפריד את הגנגליונים התריגמינליים מהעצבים התריגמינליים ולנקות את הגנגליונים. שמרו אותם ב-PBS קר, תוך שימוש במחטי הדיסקציה כסכינים.הסר את הלשון ואת העור המקיף את הלסת. הפרד בין חצאי הלסת השמאלית והימנית על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. לאחר מכן, אתר את נבטי השן ובודד אותם באמצעות מחטי נשף. לאחר נשף הגנגליונים התריגמינליים ונבטי השן, הסר את הלמינין מהמכשירים המיקרופלואידיים ומלא את התאים ב-200 microliters של המצע המתאים.בעזרת פינצטה, העבירו בעדינות את הגנגליונים התריגמינליים (trigeminal ganglia) המנותחים ואת נקבת השן לתוך החורים שנוצרו באמצעות מחורר ביופסיה (biopsy punch). ודאו שנקבת השן אינה צפה ושהיא שוקעת עד למגע עם לוחות הזכוכית (cover slips). דגרו את הדגימות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.החליפו את מצע התרבית בכל 48 שעות למשך 10 ימים לצורך רענון המצע. ראשית, הסירו את המצע על ידי הכוונת הפיפט לכיוון הצד החיצוני של הבארות. לאחר מכן, הוסיפו מצע טרי שחומם מראש לצד של הבארות הממוקם מול התאים במהלך תקופת התרבית.בצעו דימוג של התרביות המשולבות (co-cultures) בכל עת באמצעות מיקרוסקופיה של אור. לאחר תקופת התרבית, שטפו את התאים על ידי הזרקה של 150 µL של PBS לתוך באער אחד לכל תא, והניחו ל-PBS לזרום דרך התאים. חזרו על השטיפה שלוש פעמים בסך הכל לאחר השטיפה האחרונה.הסיר את ה-PBS וקבע את הדגימות על ידי הזרקת 150 µL של 4% paraformaldehyde ב-PBS לתא אחד בכל תא, והמתנה עד להזרמתו לתא השני. הדגר את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטוף את התאים פעמיים ב-PBS והמשך בניתוחים נוספים כגון צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיה של הצמיחה.במהלך תרבית משותפת, נויריטים מהגנגליונים התריגמינליים מסתעפים ממדור התרבית שלהם ומתפשטים לעבר נבט השן המתפתח. בהגדלה גבוהה יותר, ניתן לראות את הנויריטים נמתחים דרך תאי האקסונים והחריצים המיקרוסקופיים במכשיר המיקרופלואידי. ניתן לעקוב אחר התקדמות הגדילה של העצב לאורך זמן כדי לתאר את התפתחות העצביות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד RNA או חלבונים כדי ללמוד, למשל, על שינויים בביטוי גנים או בהפרשת חלבונים ברקמות המטרה לאחר החדשנות.

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

הסרטון מדגים היווצרות של צמתים עצביים-שריריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. תאים מבשרים עצביים ותאי אב שריריים נזרעים לבארות שונות בתוך המכשיר ונשארים להבשיל לנוירונים מוטוריים ולצינורות מיו, בהתאמה. יצירת נפח ושיפוע כימי מובילה להתפתחות של צמתים נוירומוסקולריים פעילים.

יצירת צמתים עצביים-שריריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

סרטון זה מציג טכניקה לביסוס תרבית משותפת של נוירונים טריגמינליים ותאי מוך שיניים ראשוניים באמצעות מסנן טרנסוול. במצב זה של הפרדה פיזית, תאים מזנכימליים המתקבלים מרקמת מוך השן מפרישים מולקולות איתות פרקריניות החוצות דרך הנקבוביות, ומקדמים התמיינות ונדידה של נוירונים לעבר התאים המזנכימליים היוצרים מערכת תרבית משותפת.

הקמת תרבית משותפת של תאי מוך השן ונוירונים טריגמינליים לתקשורת צולבת

סרטון זה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי כדי לחקור את האינטראקציות בין מוך נבט השן לבין גרעינים טריגמינליים. הוא מציג את מיקום הרקמות בתוך המכשיר המיקרופלואידי ומספק הדמיה מפורטת של צמיחת עצבים טריגמינליים לכיוון נבט השן דרך המיקרו-חריצים של המכשיר. בנוסף, הוא מדגיש את תפקידם של גורמים מולקולריים שמקורם בשיניים בקידום או עיכוב הרחבת נוירויט למוך נבט השן, שהוא חיוני להבטחת עצבוב שיניים יעיל לאחר הלידה.

ניתוח אינטראקציות בין נבט שיניים וגרעינים טריגמינליים באמצעות מערכת תרבית משותפת מיקרופלואידית

סרטון זה מדגים את הערכת הפעילות החשמלית העצבית בתרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח שמקורם ב-hiPSC ותאי גליומה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי עם מערכים מרובי אלקטרודות.

הערכת אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה בתרבית משותפת

כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.

שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

עבודות אחרונות לחשוף את ההשפעה העצבית על גליומה ילדים ברמה גבוהה (pHGG) תאים ואינטראקציות הדדיות שלהם. העבודה הנוכחית מראה את ההתפתחות של מודל אין ויטרו פולחן תאי pHGG cohGG נוירונים גלוטמטרגיים ותיעדה את האינטראקציות האלקטרופיזיולוגיות שלהם כדי לחקות את האינטראקטיביות האלה.

תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטריים ותאי גליומה ברמה גבוהה לילדים למכשירים מיקרופלואידיים להערכת אינטראקציות חשמליות

neuroHuMiX הוא מודל מעיים על שבב מתקדם לחקר האינטראקציות של תאים חיידקיים, אפיתליאליים ועצביים בתנאי תרבית משותפת פרוקסימלית ומייצגת. מודל זה מאפשר לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקשורת בין מיקרוביום המעי למערכת העצבים.

מודל מעיים-על-שבב לחקר ציר המיקרוביום-מערכת העצבים של המעי

למד שיטה לבידוד ושיתוף תרבות של גנגליון הטריגמינוס ונבטי שיניים בעכברים באמצעות התקני מיקרו-פלואידיקה. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות עצביות עם רקמות מטרה בסביבה מבוקרת ומספקת תובנות לביולוגיה התפתחותית.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

גלה סרטונים נוספים