ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות כיצד לבודד ולתרבית משותפת את הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השיניים המתפתחים. זה מושג על ידי עיקור, הרכבה וציפוי ראשונים של המכשירים המיקרופלואידיים. השלב השני הוא לנתח גרעיני טריגמינל וחיידקי שיניים משלב התפתחותי ספציפי בעכבר המעניין.

לאחר מכן, הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השן מוכנסים למכשירים המיקרופלואידיים ומתרבתים במשותף. השלב האחרון הוא לתקן את התאים ולהכתים אותם באמצעות אימונופלואורסצנטיות. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה משמשת כדי להראות את דפוס העצבוב שהוא תוצאה של תרבית משותפת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות, כמו תרביות קו-קונבנציונליות, הוא ששיטה זו מאפשרת תרבית משותפת של איברים ורקמות שונות כל אחד בתרבית האופטימלית שלו. בינוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החדשנות המלאכותית, כגון תפקידן של מולקולות שונות בחדשנות בשיניים וכלל החדשנות בהתפתחות השיניים. התחל בחיטוי כלי דיסקציה, הכוללים זוג מלקחיים מיקרו-דיסקציה וזוג מספריים.

לאחר מכן, יש לעקר אצווה של החלקות כיסוי זכוכית בגודל 24 מילימטר על 24 מילימטר על ידי הנחתן בתמיסה של חומצה הידרוכלורית מולרית אחת על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן שלוש שטיפות באתנול 99%, יבשו אותם מתחת לקולט אדים סטרילי לאחר הייבוש, הדליקו את אור ה-UV של מכסה המנוע למשך 30 דקות. לאחר מכן אחסן את פתקי הכיסוי באתנול 70% עד שהם נחוצים.

לאחר מכן, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להסיר בזהירות את המכשירים המיקרופלואידיים של בידוד האקסון מאריזתם ולהניח אותם בצלחת פטרי סטרילית באמצעות אגרוף ביופסיה סטרילי של מילימטר אחד. צור חור אחד במכשירים עבור כל דגימה. בהתכתבות של חדרי התרבות.

היזהר לא לנקב קרוב מדי לחריצי המיקרו מכיוון שהם עלולים להינזק מהלחץ. לאחר מכן, עקר את המכשירים על ידי הופעתם באתנול של 70%. דואגים להסיר את כל האוויר הכלוא.

לאחר מכן הסר את המכשירים מהאתנול וייבש אותם לחלוטין מתחת למכסה המנוע סטרילי. כמו כן, הסר את החלקות הכיסוי מתמיסת האתנול 70% ותן להן להתייבש מתחת למכסה המנוע הסטרילי. המתן לפחות שלוש שעות לפני שתמשיך.

מניחים כל כיסוי לבאר בתוך צלחת שש בארות. לאחר מכן הנח את המכשיר המיקרופלואידי על החלקת הכיסוי ולחץ בעדינות אך בחוזקה עם המלקחיים על מנת לאפשר הידבקות מלאה בין מכשיר הבידוד להחלקת מכסה הזכוכית. לאחר מכן, פיפטה 150 מיקרוליטר של 0.1 מיליגרם למיליליטר, פולי D ליצין לכל אחד מתאי התרבות.

לאחר מכן הנח את המכשירים המיקרופלואידיים תחת ואקום למשך חמש דקות כדי להסיר את כל האוויר מהתאים. אם עדיין ניתן לראות אוויר בתוך התאים. החזר את תמיסת הפולי D ליזין לתאים.

דגרו את המכשירים עם פולי דה ליזין למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת. שטפו את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מלאו את התאים ב -150 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר, תמיסת עבודה למין, ודגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אמצעי תיקון עבור הגרעינים הטריגמינליים ותרביות נבט השיניים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

נקה את אזור הדיסקציה ואת הסטריאוסקופ עם אתנול 70% והנח את מכשירי הדיסקציה לאחר ההקרבה. נתח את העור סביב הבטן התחתונה של עכברה בהריון עם עוברי עכבר בשלב E 14.5 עד E 17.5. ואז פתח בזהירות את הבטן בעזרת מספריים.

אתר את הרחם, הסר אותו והנח אותו בצינור מלא בקרח. PBS קר מנתח את העוברים ומניח אותם בנפרד בצלחת פטרי חדשה מלאה ב-PBS קר כקרח. לאחר שכל העוברים הוסרו מהרקמות העובריות הנוספות, ערפו את ראשיהם באמצעות מספריים.

הפרד את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות דיסקציה מיקרו, מספריים, תוך הקפדה לא לפגוע בגרעינים הטריגמינליים. לאחר מכן, קח את הראש והניח אותו על צלחת פטרי מזכוכית צוננת. השתמש במלקחיים כדי להסיר את העור והגולגולת.

לאחר מכן הניחו מלקחיים מתחת לקפלון והרימו. כדי להסיר את הצפלון והמוח הקטן, מקם את הגרעינים הטריגמינליים והשתמש במלקחיים ובמחטי הדיסקציה כדי להפריד את הגרעינים הטריגמינליים מהעצבים הטריגמינליים ולנקות את הגרעין. שמור אותם ב- PBS קר באמצעות מחטי דיסקציה כסכינים.

הסר את הלשון ואת העור המקיף את הלסת. הפרד את לסת המי השמאלית והימנית על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. לאחר מכן אתר את חיידקי השיניים ובודד אותם באמצעות מחטי דיסקציה לאחר דיסקציה של הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השן, הסר את הלמינין מהמכשירים המיקרופלואידיים ומלא את התאים ב-200 מיקרוליטר של המדיה המתאימה.

בעזרת מלקחיים, העבירו בעדינות את הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השיניים המנותחים לתוך החורים שנוצרו באמצעות אגרוף ביופסיה. ודא שחיידקי השיניים אינם צפים ושהם שוקעים עד שהם באים במגע עם החלקות הכיסוי. תרבית, הדגימות בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות למשך 10 ימים כדי לשנות את המדיום. ראשית, הסר את המדיום על ידי הפניית הפיפטה לכיוון הצד החיצוני של הבארות. לאחר מכן מוסיפים את המדיום הטרי והחם בצד הוולס הממוקם מול התאים בתקופת התרבות.

דמיין את תרביות הקו בכל עת באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר תקופת התרבות, יש לשטוף את התאים על ידי פיפטינג של 150 מיקרוליטר PBS לבאר אחת לכל תא, ולתת ל- PBS לזרום דרך התאים. חזור על הכביסה בסך הכל שלוש פעמים לאחר הכביסה האחרונה.

הסר את ה-PBS וקבע את הדגימות על ידי פיפטינג של 150 מיקרוליטר של 4% אלדהיד פרפורמי ב-PBS לבאר אחת לכל תא, ואפשר לו לזרום לתא השני. דגרו את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם PBS והמשיכו בניתוח נוסף כגון צביעה אימונו-פלואורסצנטית והדמיה של הצמיחה.

במהלך תרבית פחם, נויריטים מהגרעינים הטריגמינליים מסתעפים מתא התרבות שלו ומתרחבים לעבר נבט השן המתפתח. בהגדלה גבוהה יותר, אפשר לראות את הנויריטים משתרעים דרך החדרים האקסונליים ואת החריצים הזעירים במכשיר המיקרופלואידי. ניתן לעקוב אחר התקדמות צמיחת העצבים לאורך זמן כדי לתאר את התפתחות החדשנות.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כמו RNA או PROTEINIZATION על מנת לחקור, למשל, שינויים בביטוי גנים או הפרשת חלבונים ברקמות המטרה בעקבות חדשנות.