ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות
14 באוגוסט 2015
תרביות משותפות מייצגות שיטה רבת ערך לחקר האינטראקציות בין עצבים לרקמות ואיברי מטרה. מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות תרבית משותפת של גנגליונים ואיברים או רקמות מתפתחים שלמים במצעי תרבית שונים, ובכך מייצגות כלי רב ערך למחקר במבחנה של הדיבור בין נוירונים למטרותיהם.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד לבודד ולגדל בתרבית משותפת (co-culture) את הגנגליונים התריגמינליים וניבצי השן המתפתחים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי עיקור, קיבוע וציפוי של התקנים המיקרופלואידיים. השלב השני הוא דיסקציה של הגנגליונים התריגמינליים וניבצי השן משלב התפתחותי ספציפי בעכבר הנחקר.
בשלב הבא, הגנגליונים התריגמינליים ונבטי השן מוחדרים למכשירים המיקרופלואידיים ומגודלים יחד בתרבית משותפת. השלב הסופי הוא קיבוע התאים וצביגתם באמצעות אימונופלואורסצנציה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה כדי להראות את דפוס העצבוי שנוצר כתוצאה מהתרבית המשותפת.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות משותפות (co-cultures) קונבנציונליות, הוא ששיטה זו מאפשרת תרבית משותפת של איברים ורקמות שונות, כאשר כל אחת מהן נמצאת במצע תרבית אופטימלי משלה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום החדשנות של השן, כגון תפקידן של מולקולות שונות בחידוש השן ותפקידה של החדשנות בהתפתחות השן. התחילו בעיקור באוטוקלאב של כלי הניתוח, הכוללים זוג פינצטות למיקרו-דיסקציה וזוג מספריים.
בשלב הבא, עקרו קבוצה של כיסויי זכוכית בגודל 24 מילימטר על 24 מילימטר על ידי הנחתם בתוך תמיסה של חומצה כלורית 1 M במנער אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, שטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן בשלושה שטיפות ב-99% Ethanol, וייבשו אותם תחת מrepresents מזרים סטרילי. ברגע שהם יבשים, הפעילו את תאורת ה-UV של המזרים למשך 30 דקות. לאחר מכן, אחסנו את כיסויי הזכוכית ב-70% ethanol עד למועד השימוש בהם.
בשלב הבא, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא בזהירות את התקני המיקרופלואידיקה לבידוד אקסונים מהאריזה שלהם, והניחו אותם בתוך צלח פטרי סטרילי באמצעות מחץ ביופסיה סטרילי של מילימטר אחד. צרו חור אחד בכל התקן עבור כל דגימה, בהתאמה לתאי התרבית.
הקפידו לא להחורר קרוב מדי לחריצים המיקרוסקופיים, שכן הם עלולים להינזק מהלחץ. לאחר מכן, סטריליזו את המכשירים על ידי טבילה ב-70% ethanol, תוך הקפדה להוציא את כל בועות האוויר שנלכדו.
לאחר מכן, הוצא את המכשירים מהאתנול ויבש אותם לחלוטין תחת מapay זרימה סטרילי. כמו כן, הוצא את כיסויי הזכוכית (cover slips) מתמיסת האתנול 70% והנח להם להתייבש תחת מapay הזרימה הסטרילי. המתן לפחות שלוש שעות לפני ההמשך.
הניחו כל זכוכית כיסוי לתוך באר בתוך פלטה בעלת שישה בארות. לאחר מכן, הניחו את המכשיר המיקרופלואידי על זכוכית הכיסוי ולחצו בעדינות אך בחוזקה בעזרת פינצטה כדי לאפשר הידבקות מלאה בין מכשיר הבידוד לבין זכוכית הכיסוי.
לאחר מכן, הניחו את ההתקנים המיקרופלואידיים בוואקום למשך חמש דקות כדי להוציא את כל האוויר מהתאים. אם עדיין ניתן לראות אוויר בתוך התאים, חזרו על הזרקת תמיסת ה-poly D lysine לתאים.
הדגרימו את המכשירים עם poly de lysine למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, שטפו את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מלאו את התאים ב-150 µL של תמיסת עבודה lamin בריכוז 5 µg/mL, והדגירימו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הכינו מצע גידול עבור תרביות של ganglion trigeminale ונבט שן כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.
נקה את אזור הנתיחה ואת הסטראוסקופ באמצעות אתנול 70% והנח את מכשירי הנתיחה לאחר ההריגה. נתח את העור מסביב לבטן התחתונה של עכברה ההרה עם עוברים בשלבי התפתחות E 14.5 עד E 17.5. לאחר מכן, פתח בזהירות את הבטן באמצעות מספריים.
אתרו את הרחם, הוציאו אותו והניחו אותו במבחנה מלאה בקרח. בעזרת PBS קר, בדלו את העוברים והעבירו כל אחד מהם בנפרד לצלח פטרי חדש המלא ב-PBS קר מאוד. לאחר שכל העוברים הוצאו מהרקמות חוץ-עובריות, בצעו להם כריתה של הראש באמצעות מספריים.
הפרידו את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות מיקרו-דיסקציה ומספריים, תוך הקפדה שלא לפגוע בגנגליונים התריגמינליים. לאחר מכן, קחו את הראש והניחו אותו על פטריה של זכוכית לדיסקציה שקוללה.
לאחר מכן, מקמו פינצטה מתחת לראש (cephalon) והרימו. כדי להסיר את הראש ואת המוח הקטן (cerebellum), אתרו את הגנגליונים התריגמינליים והשתמשו בפינצטה ובמחטי דיסקציה כדי להפריד את הגנגליונים התריגמינליים מהעצבים התריגמינליים ולנקות את הגנגליונים. שמרו אותם ב-PBS קר, תוך שימוש במחטי הדיסקציה כסכינים.
הסר את הלשון ואת העור המקיף את הלסת. הפרד בין חצאי הלסת השמאלית והימנית על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. לאחר מכן, אתר את נבטי השן ובודד אותם באמצעות מחטי נשף. לאחר נשף הגנגליונים התריגמינליים ונבטי השן, הסר את הלמינין מהמכשירים המיקרופלואידיים ומלא את התאים ב-200 microliters של המצע המתאים.
בעזרת פינצטה, העבירו בעדינות את הגנגליונים התריגמינליים (trigeminal ganglia) המנותחים ואת נקבת השן לתוך החורים שנוצרו באמצעות מחורר ביופסיה (biopsy punch). ודאו שנקבת השן אינה צפה ושהיא שוקעת עד למגע עם לוחות הזכוכית (cover slips). דגרו את הדגימות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.
החליפו את מצע התרבית בכל 48 שעות למשך 10 ימים לצורך רענון המצע. ראשית, הסירו את המצע על ידי הכוונת הפיפט לכיוון הצד החיצוני של הבארות. לאחר מכן, הוסיפו מצע טרי שחומם מראש לצד של הבארות הממוקם מול התאים במהלך תקופת התרבית.
בצעו דימוג של התרביות המשולבות (co-cultures) בכל עת באמצעות מיקרוסקופיה של אור. לאחר תקופת התרבית, שטפו את התאים על ידי הזרקה של 150 µL של PBS לתוך באער אחד לכל תא, והניחו ל-PBS לזרום דרך התאים. חזרו על השטיפה שלוש פעמים בסך הכל לאחר השטיפה האחרונה.
הסיר את ה-PBS וקבע את הדגימות על ידי הזרקת 150 µL של 4% paraformaldehyde ב-PBS לתא אחד בכל תא, והמתנה עד להזרמתו לתא השני. הדגר את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטוף את התאים פעמיים ב-PBS והמשך בניתוחים נוספים כגון צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיה של הצמיחה.
במהלך תרבית משותפת, נויריטים מהגנגליונים התריגמינליים מסתעפים ממדור התרבית שלהם ומתפשטים לעבר נבט השן המתפתח. בהגדלה גבוהה יותר, ניתן לראות את הנויריטים נמתחים דרך תאי האקסונים והחריצים המיקרוסקופיים במכשיר המיקרופלואידי. ניתן לעקוב אחר התקדמות הגדילה של העצב לאורך זמן כדי לתאר את התפתחות העצביות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד RNA או חלבונים כדי ללמוד, למשל, על שינויים בביטוי גנים או בהפרשת חלבונים ברקמות המטרה לאחר החדשנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטה לבידוד ולתרבית משותפת (co-culture) של גנגליונים טריגמינליים מתפתחים ונבטי שן באמצעות התקנים מיקרופלואידיים. גישה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות עצביות עם רקמות מטרה בסביבה מבוקרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מיקרופלואידיקה
רקע
- תרביות משולבות (Co-cultures) חיוניות לחקר אינטראקציות בין עצב למטרה.
- מערכות מיקרופלואידיקה מאפשרות שיתוף-גידול (co-culturing) של רקמות שונות.
- הבנת דפוסי העצבוב חיונית למחקרים התפתחותיים.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפתחות נוירונלית ואינטראקציות בין רקמות.
מטרת המחקר
- לבידוד ולגידול משותף (co-culture) של גנגליונים תריגמינליים ונבטי שיניים.
- לחקירת התקשורת ההדדית (crosstalk) בין נוירונים לבין הרקמות המטרה שלהם.
- להדמיה של דפוסי העצבוב באמצעות מיקרוסקופיה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- עיקור וציפוי של התקני מיקרופלואידיקה.
- הוצאה של גנגליונים תריגמינליים ונבטי שיניים מעוברי עכבר.
- הנחת רקמות בתוך התקני מיקרופלואידיקה לתרבית משותפת (co-culture).
- קיבוע וצביעה אימונופלואורסצנטית של תאים.
תוצאות עיקריות
- תרבית משותפת מוצלחת של גנגליות טריגמינליות ונבטי שן.
- ויזואליזציה של דפוסי העצבבה העצבית.
- הדגמה של האינטראקציות בין עצבים לרקמות מטרה.
- תובנות לגבי התהליכים ההתפתחותיים של מיקום עצבי המטרה.
מסקנות
- תרביות שיתוף (co-cultures) מיקרופלואידיות יעילות לחקר אינטראקציות נוירונליות.
- שיטה זו יכולה לקדם את ההבנה של התפתחות עצבים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור אינטראקציות בין רקמות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
הבנת האינטראקציות בין עצבים לרקמות המטרה היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות של ביולוגיה התפתחותית בתהליכי גילוי תרופתי. שיטת השיתוף-תרביתי (co-culture) במיקרופלואידיקה זו מאפשרת מחקרים מבוקרים וארוכי טווח של דפוסי עיצוב עצבי (innervation), ותומכת בתיקוף מכניסטי במודלים של אורגנוגנזה. גישה זו מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת מתווכים מולקולריים של התפתחות רקמות, עם רלוונטיות ישירה לתהליכי תיקוף של מטרות ותהליכי סריקת פנוטיפית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של ההשפעה העצבית על המורפוגנזה ובידול התאים של נבט השן.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד האינטראקציה בין העצב לרקמה בסביבה מיקרוסקופית מוגדרת.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכה של מתווכים מולקולריים (למשל, רמזי הדרכה, גורמים טרופיים) המודולפים את מסלולי ההתפתחות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מבסס מערכת שיתוף-תרבית (co-culture) סטנדרטית לניתוח כמותי של צמיחת ניוריטים ותגובת רקמות.
- שחזוריות: שומר על חיוניות רקמה יציבה ועל דפוסי עיצוב עצביים טבעיים לאורך תקופות תרבית ממושכות (עד 10 ימים).
- מדרגיות: תואם לריבוי-מיקרופלואידקה (microfluidic multiplexing) לבדיקה מקבילה של תנאים במסגרת גילוי תרופות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תהליכים התפתחותיים רלוונטיים להפרעות מולדות המשפיעות על ההתפתחות הקרניו-פציאלית והעצבית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של התחדשות רקמה התלויה בעצב.
- הפחתת סיכונים: מפחיתה את העמימות במנגנון המטרה על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בהשפעה העצבית על אינטראקציות אפיטליאליות-מזנכימליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מערכת מבוקרת לתיקוף מטרות נוירונליות לפני מאמצים לזיהוי מולקולות מובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקידן של מולקולות ספציפיות בהתפתחות רקמות המודרכות על ידי עצבים.
- סריקה: מייצר פלטי דימות כמותיים (מסלול נוריטים, צפיפות התבסעות) לצורך ניתוח של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- אנליזה: מאפשר קריאות מורפומטריות ומבוססות פלואורסצנציה להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנונים התפתחותיים לבין אסטרטגיות רגנרטיביות בהנדסת רקמות קרניו-פציאליות.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה הניתנת להתאמה לזוגות אחרים של נוירונים ורקמות מטרה (למשל, גנגליונים סימפתטיים ולב, עצבים אנטריים ומעי).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני מטרה על ידי הפחתת ההסתמכות על מודלים ניסיוניים של in vivo.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי תרבית משותפת (co-culture), הממזערת שונות הנובעת ממגאלות סרום או מחוסר תאימות של מצעי גידול.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) באמצעות אספקת ראיות ישירות למעורבות המטרה במסלולי פיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על נתונים מאומתים של אינטראקציה בין עצב לרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכשירים מיקרופלואידיים, בניתוח רקמות סטרילי ובמיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
- תלוי בגישה למקורות של רקמות עובריות ובתשתית תרבית סטרילית (אינקובטור CO2, מCב מזרם למינרי).
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ציפוי ב-poly-D-lysine ובלמינין להבטחת היצמדות עקבית לפני השטח.
- התאמה למערכות רקמות אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של גיאומטריית התא והרכב המדיום.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכון לסתימה של המכשיר והצורך בהחלפת מדיום מבלי להפר את מיקום הרקמה.
