יצירת צמתים עצביים-שריריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

התחל עם מכשיר מיקרופלואידית מצופה פולימר הכולל בארות מחוברות זו לזו הנושאות תאי מראה המחוברים באמצעות מיקרו-חריצים.

זרע תאי אב עצביים לבארות של תא אחד.

אפשר להם לנדוד לתעלה המחוברת ולדבוק בפולימר.

כיסוי עם מצע גידול לקידום התבגרות עצבית לנוירונים מוטוריים.

בתא הנגדי, זרעו את הבארות בתאי אב שריר, הנודדים ונצמדים לתעלה המחוברת זו לזו.

החלף את המדיום במדיום התמיינות, הגורם לאיחוי של תאי אב שריר ויוצר תאי שריר מרובי גרעינים.

הוסף מדיום התמיינות נוירונים המכיל גורמי גדילה לתא המכיל תאי שריר.

בינתיים, הוסף חצי נפח של מדיום נטול גורמי גדילה לתא המכיל תאים עצביים.

גורמי הגדילה ונפח גבוה יותר של מדיום בתא הנגדי מקדמים את הנוירונים המוטוריים להרחיב את תהליכיהם דרך המיקרו-חריצים.

תהליכים עצביים אלה מתחברים לאחר מכן לתאי השריר ויוצרים צמתים עצביים-שריריים.

כדי לצלחת את תאי האב העצביים, או NPCs, במכשיר המיקרופלואידי, הסר DPBS משתי בארות בצד אחד של המיקרו-חריצים במכשיר באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר. כדי לזרוע בסך הכל 250,000 NPCs ב-60 עד 100 מיקרוליטר של תווך נוירונים מוטוריים ביום 10 לכל מכשיר בבאר הימנית העליונה, זרע מחצית מתרחיף התא קרוב לפתח התעלה בזווית של 45 מעלות.

השהה למספר שניות כדי לאפשר לתרחיף התא לזרום דרך התעלה לפני הוספת המחצית הנותרת של תרחיף התא בבאר התחתונה. השתמש בעט כדי לסמן את הצד הזרוע כ-NPC או שווה ערך להתמצאות קלה של המכשיר ללא מיקרוסקופ ודגירה למשך חמש דקות לחיבור תאים. לאחר מכן, מלאו לאט לאט את שתי הבארות עם זרעי NPC עם יום נוסף של 10 נוירונים מוטוריים בינוניים לנפח כולל של 200 מיקרוליטר לבאר. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, הסר DPBS משתי הבארות בצד השני של המיקרו-חריצים שממול ל-NPCs הטריים.

הוסף 200 מיקרוליטר של יום 10 מדיה של נוירונים מוטוריים לכל באר לבארות הלא זרועות. לאחר מכן, הוסף 6 מיליליטר DPBS לכל צלחת של 10 סנטימטר סביב המכשיר כדי למנוע אידוי של המדיום במהלך הדגירה.

כדי לשנות את המדיום, הסר לאט את המדיה בשתי הבארות עם NPCs על ידי מיקום קצה הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר בקצה התחתון של דופן הבאר מול פתח התעלה. כדי למנוע מזרימת מדיום חזקה לפגוע בתאים בערוץ, הוסיפו לאט לאט 50 עד 100 מיקרוליטר של מדיום נוירונים מוטורי טרי לכל באר, על ידי מעבר מתמיד בין הבאר העליונה והתחתונה. חזור על התהליך עד שכל באר מכילה 200 מיקרוליטר בינוני.

ביום ה -17 של התמיינות הנוירונים המוטוריים, הסר את מדיום הנוירונים המוטוריים בצד הלא זרוע של המיקרו-חריצים במכשיר בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר ושטוף את הבארות עם DPBS. זרע בסך הכל 200,000 מזואנגיובלסטים ראשוניים אנושיים או MABs ב-60 עד 100 מיקרוליטר של מצע גידול לכל מכשיר על ידי זריעת מחצית מתרחיף התא בבאר העליונה.

השהה למספר שניות כדי לאפשר לתרחיף התא לזרום דרך התעלה לפני שתזרע את המחצית הנותרת של תרחיף התא בבאר התחתונה, כפי שהודגם קודם לכן עבור ציפוי NPCs. דגירה של המכשיר למשך חמש דקות לחיבור התא. לאחר מכן, מלאו את שתי הבארות הטריות שנזרעו ב-MAB במצע גידול נוסף ודגרו שוב כפי שהודגם.

כדי ליזום את השיפוע הכימוטקטי והנפחי ביום ה-21 של התמיינות הנוירונים המוטוריים, הוסף 200 מיקרוליטר לבאר של מדיום בסיסי של נוירון מוטורי המכיל גורמי גדילה לתא השריר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מדיום בסיסי של נוירון מוטורי ללא גורמי גדילה לתא הנוירונים המוטוריים.