שבץ בחומר הלבן צדדי דגם Murine של קורטיקליים לחקר ניוון אקסונלית ולבן Matter לנוירוביולוגיה
17 במרץ 2016
כאן אנו מציגים מתודולוגיה לייצור שבץ מוחי מוקדי בחומר לבן של עכברים על ידי הזרקה מקומית של מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (eNOS) בלתי הפיך (L-Nio). מוצגות שתי וריאציות סטריאוטקטיות, מעקב עצבי רטרוגרדי ותיוג ודיסקציה של רקמות טריות המרחיבות את היישומים הפוטנציאליים של טכניקה זו.
המטרה הכללית של הליך זה היא לאתר במדויק שבץ קטן בתוך החומר הלבן של עכבר, כדי לדמה צורה נפוצה זו של שבץ בחומר הלבן התת-הקליפתי (subcortical). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השבץ, כגון מנגנונים של פגיעה אקסונלית, תגובה נוירונלית לשבץ תת-קליפתי, וכיצד הרכיבים התאיים של החומר הלבן מגיבים הן בשלב החריף והן בשלבי ההחלמה של השבץ. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי למקם במדויק את השבץ בחומר הלבן, וניתן ליישמה במגוון רחב של מודלים של עכברים.
באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עשויים להתקשות, בשל הכמות הקטנה של החומר הלבן שמובילה למיקום שגוי של השבץ. ייתכן שיהיה צורך בביצוע התאמות קלות בזווית ההזרקה או בקואורדינטות הסטריאוטקטיות עבור כל זן של עכבר, או בהגדרות הסטריאוטקטיות. התחילו תחילה בחיבור פיפטת זכוכית משוכה לצינור המחובר לקו ואקום.
הכנס את הקצה שנמשך לתוך תמיסת ה-L-Nio, או L-Nio בתוספת סמן פלואורסצנטי. הפעל את הוואקום, והפעל שאיבה עד שלפחות שני מילימטרים מהחלק שקוטרו 0.5 מילימטר של הפפיטה יתמלאו. הנח את הפפיטה המלאה בצד.
לאחר מכן, מקמו את העכבר במכשיר סטריאוטקטי המצויד במיקרוסקופ סטריאוטקטי. לאחר הרדמה והכנת העכבר לניתוח בהתאם לנהלים המאושרים, בדקו את עומק ההרדמה באמצעות צביטה בבוהן. לא אמורה להיות תגובה.
בשלב הבא, כוון את זרוע ההזרקה ל-36 מעלות. הצמד מחזיק פיפטת זכוכית משוכה לקצה הרחוק של מערכת הזרקה בלחץ לנפח נמוך, וחבר אותו לזרוע ההזרקה. לאחר ביצוע חתך של 1.5 סנטימטר בקו האמצע של קרקפת הראש כדי לחשוף את הגולגולת, ייבש את פני השטח של הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן.
לאחר מכן, תוך התבוננות דרך מיקרוסקופ סטריאוטקטי בהגדלה של 1 עד 3 X, השתמש בכלי מיקרו-פוינט (micropoint tool) כדי להסיר כל רקמה פריאוסטיאלית (periosteal tissue) מעל האזור. סמן את ה-bregma בעזרת טוש בעל חוד דק. לאחר מכן, השתמש במקדח כירורגי המצויד במקדח כירורגי בעל חוד דק כדי לבצע קרניוטומיה אליפטית של 2 mm, החל מה-bregma לכיוון האחורי, המתרחבת לכיוון הקדמי משמאל לקו האמצע.
הסר רסיסי עצם ורקמות רכות המכסות את האזור כדי שניתן יהיה לראות את קליפת המוח (cerebral cortex). שמור על פני השטח של הקורטקס לחים על ידי הוספה של טיפות תמיסת סלין סטרילית במרווחי זמן. לאחר מכן, חבר את הפפיטה המלאה לזרוע המזרק.
יישרו את הקצה הדיסטלי של הפ pipette עם ה-bregma, ואפסו את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות. הניעו את ה-pipette לנקודת ההזרקה הראשונה באמצעות הקואורדינטות האנטריוריות, הפוסטריוריות והמדיאליות-לטרליות המופיעות בטבלה 1. לאחר מכן, הניעו את ה-pipette אל פני השטח של הקורטקס, ואפסו את המדידה הדורסלית-בנטרלית.
הורד באיטיות את הפ pipette לקואורדינטות הגב-בטן (dorsal-ventral). ודא שההגדלה של המיקרוסקופ הסטריאוטקטי מכוונת ל-three X, וכי ניתן לראות בבירור את הסרגל המכויל (reticle). התבונן ב-pipette הזוויתית מהצד כך שיהיה מבט סגיטלי על המניסקוס של נוזל האוויר.
המניסקוס צריך להופיע באותו מישור מוקד הן של הדופן הפנימית והן של הדופן החיצונית של הפ pipette. כעת, באמצעות מערכת הזרקה בלחץ מקומי המכוונת ל-20 PSI לפולסים של 20 millisecond, הזריקו 100 nanoliters של L-Nio לתוך המוח. לאחר הזרקת הנפח הכולל, המתינו חמש דקות כדי למנוע רפלקס (reflux) חזרה במעלה נתיב ה-pipette.
לאחר מכן, הוצא את הפ pipette, וחזור על הליך ההזרקה בסט השני והשלישי של הקואורדינטות המפורטות בטבלה 1. לאחר ההזרקה האחרונה, הסר את ה-pipette והנח מספיק שעוות עצם (bone wax) כדי למלא את אתר הקרניוטומיה. לבסוף, קרב את קצוות הפצע בקרקפת, וסגור באמצעות דבק דרמלי.
לאחר מתן אלגזיה פוסט-אופרטיבית, העבירו את החיה לכלוב נקי. ספקו אנטיביוטיקה פוסט-אופרטיבית במי השתייה למשך חמישה ימים, או עד למועד ההקרבה אם פרק זמן זה קצר מחמישה ימים. לאחר הקרבת העכבר ועריכת דקפיטציה בהתאם לנהלים המאושרים, השתמשו במספריים סטריליים כדי לפתוח את הגולגולת בחלקה האחורי, ולאחר מכן השתמשו בשפכטל כדי להסיר בעדינות את שכבת הגולגולת העליונה.
בשלב הבא, הכניסו שפכטל סטרילי של 4 מילימטרים לחלק הקדמי של המוח כדי לנתק את הפחוס הריחני ואת העצבים האופטיים. לאחר מכן, הרימו בעדינות את המוח מתוך הגולגולת והניחו אותו בבuffer דיסקציה קר מאוד. באמצעות בלוק למוח ולהבי תער סטריליים, חתכו פרוסות בעובי של 2 עד 3 מילימטרים המכילות את האזור הפגוע, והניחו אותן בבuffer דיסקציה קר.
תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), זהו את החומר הלבן הנמצא מתחת לקליפת המוח המוטורית (motor cortex) בהמיספרה שזו הזרקה. בפרקי זמן מוקדמים יותר לאחר השבץ, הזרקה של L-Nio מעורבב עם צבעי מעבדה נפוצים, כגון fast green, עשויה לאפשר זיהוי חזותי של השבץ. בפרקי זמן מאוחרים יותר לאחר השבץ, ניתן לזהות את האזור חזותית באמצעות נמק מוקדי (focal necrosis) וחיוורון של המיאלין.
לאחר הזיהוי, השתמש בסכין מנתחים כדי להפריד בזהירות את אזור החומר הלבן המכיל את השבץ. הסר את קליפת המוח העליונה ואת הסטריאטום שמתחתיה, בהתאם לצורך. כפי שמוצג כאן, סימון אימונופלואורסצנטי לסיבים עצביים (neural filaments), המוצג באדום, מדגים את מידת האובדן האקסונלי שבעה ימים לאחר השבץ, תוך שימוש בגישה המדיאלית.
בשימוש בגישה זוויתית אחורית, נגעי השבץ בחומר הלבן ממוקדים ממש מעל הפרוזדור הצדי ומראים תגובתיות מיקרוגליאלית אינטנסיבית, כפי שזו זוהתה באמצעות סימון אימונו-היסטוכימי ל-IBA-1. שני סמנים של פילמנטים בינוניים באסטרוציטים, vimentin המוצג באדום, ו-glial fibrillary acidic protein המוצג בירוק, חושפים שינויים במורפולוגיה של אסטרוציטים בחומר הלבן לאחר שבץ. הזרקה משולבת של dextran amine פלואורסצנטי בזמן השראת השבץ מאפשרת זיהוי של נוירונים בודדים עם אקסונים שנפגעו מהשבץ.
רוב הסימון מתרחש באקסונים בתוך נוירונים של שכבה חמש ושש בקליפות התחושה והתנועה הראשוניות המכסות את אזור השבץ. תמונה זו מייצגת מצב שבעה ימים לאחר השבץ. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 45 דקות, במידה והיא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להוביל לשבץ מוחי מוקדי בחומר הלבן בעכבר, ולהכין את המוח למגוון של תהליכי עיבוד המשכיים, המועילים למענה על שאלות חשובות בנושאי שבץ ושיקום עצבי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה ליצירת שבץ מוקדי בחומר הלבן של עכברים באמצעות הזרקה מקומית של מעכב eNOS בלתי הפיך (L-Nio). הטכניקה כוללת וריאציות סטריאוטקטיות וסימון רקמות טריות כדי להרחיב את יישומיה במחקר של שבץ מוחי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- מחקר שבץ מוחי
- מודלים של עכברים
רקע
- שתיכים מוקדיים בחומר הלבן נפוצים במודלים של שבץ תת-קורטיקלי.
- הבנת הפגיעה האקסונית והתגובות הנוירונליות היא קריטית למחקר שבץ.
- מיקום מדויק של השתיכים יכול לשפר את תוצאות הניסוי.
- וריאציות בזני עכברים עשויות להצריך התאמות בטכניקה.
מטרת המחקר
- למידול מדויק של שבץ בחומר הלבן התת-קורטיקלי בעכברים.
- לחקירת מנגנונים של פגיעה אקסונלית ותגובות נוירונליות.
- לבחינת תגובות תאיות במהלך שלבי השבץ החריפים ושלבי ההחלמה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה של L-Nio באמצעות מכשיר סטריאוטקטי.
- הכנת העכבר והליכים כירורגיים להשראת שבץ מוחי.
- הפרידה וסימון של רקמת מוח לצורך ניתוח.
- סימון אימונופלואורסצנטי להערכת אובדן אקסוני ותגובתיות מיקרוגליאלית.
תוצאות עיקריות
- מיקום מוצלח של נגעים משבכיים בחומר הלבן של עכברים.
- זיהוי פגיעה אקסונית והפעלה של מיקרוגליה לאחר שבץ.
- זיהוי חזותי של שבץ באמצעות סומנים פלואורסצנטיים.
- הדגמה של שינויים באסטרוציטים כמענה לשבץ.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת מידול מדויק של שבחים בחומר הלבן.
- היא מספקת תובנות לגבי המנגנונים התאיים של פגיעה כתוצאה משבץ.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את ההבנה של תהליכי ההחלמה משבץ.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול שבץ מוח מוקדי בחומר הלבן בעכברים נותן מענה לפער קריטי במחקר פרה-קליני של שבץ מוח, ומאפשר הפחתת סיכונים מכנית של מסלולי דגנרציה אקסונלית. מודל זה תומך בתיקוף מטרות על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לבדיקת תגובות דלקתיות-עצביות ותגובות תיקון הרלוונטיות לדמנציה וסקולרית ולנטול של אוטמים שקטים. לוקליזציה מדויקת של הנגע מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפחתת השונות הביולוגית במדדי הבדיקות הבאות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למנגנוני פגיעה אקסונלית בפתולוגיה של החומר הלבן.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה תואמת עכברים לתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כלים נוירוביולוגיים מבוססים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול תרומה של אוטמים שקטים להתקדמות דמנציה וסקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נקודות קצה היסטולוגיות כמותיות, כגון אובדן אקסוני ותגובתיות מיקרוגליאלית, לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מקל על הכנת חתכי רקמה מאומתים עבור אנליזות הניתנות לשחזור של אימונופלואורסצנציה וסימון באמצעות סומנים (tracers).
- ערך מדעי: מאפשר מוכנות לסריקה באמצעות השראה של נגע מוקדי התואם לסימון עצבי רטרוגרדי ולסימון רקמה טרייה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול שבץ בחומר הלבן התת-קליפתי התורם לדמנציה וסקולרית.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות הזרקה סטראטוקטית סטנדרטית ועיבוד רקמות.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור מיקום הנגע לפרופילי תגובה תאית בשלבי השלב החריף ובשלבי ההחלמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת היפותזות של מנגנוני שבץ ספציפיים לחומר לבן לפני מאמצי זיהוי של מועמדים פוטנציאליים (lead identification).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים באמצעות השראה ממוקדת של נגעים במסלולי החומר הלבן בעכברים.
- סריקה: מספק רקמה מוכנה לבדיקה עם פלטים כמותיים, כגון הפעלה של מיקרוגליה IBA-1+ ואובדן סיבי אקסונים.
- אנליטיקה: מספק משתנים תלויים מדידים, כולל עוצמת פלואורסצנציה של פילמנטים עצביים וסמני אסטרוציטים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות מידול של שלבי שבץ הרלוונטיים לליקוי קוגניטיבי וסקולרי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע מסגרת סטריאוטקטית הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה בין זני עכברים ושילובי חומרי סימון למחקרים אורך.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באימות המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במודלים של פגיעה בחומר לבן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות קואורדינטות סטנדרטיות, פרמטרי של הזרקה ופרוטוקולים של ניתוח רקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אפשור הערכה מוקדמת של מעורבות המטרה במסלולי ניוון אקסונלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי מידול תת-סוג של שבץ שכיח מאוד אך לא נחקר מספיק, הקשור לסיכון לדמנציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים סטריאוטקטיים ובנוירו-אנטומיה של עכברים לצורך מיקוד מדויק בחומר הלבן.
- תלוי במערכות הזרקה בלחץ מכויילות ובכלי מיקרו-כירורגיה סטריליים להשראת נגעים עקבית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה היסטולוגית והדמיה לצורך הדירות בין מספר אתרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל ברקעים גנטיים שונים של עכברים או במצבים של תחלואה נלווית.
- מגבלות מעשיות כוללות גודל מטרה קטן הדורש התאמות של קואורדינטות בהתאם לגזע, וטיפול קפדני לאחר הניתוח להבטחת הישרדות.
