אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להניע תגובות אנזימטיות באמצעות אור נראה. בגישה זו, נעשה שימוש באור כדי להמיר חומצות שומן לאלקינים טרמינליים תחת תנאי תגובה מתונים. דקרבוקסילציה דורשת שבירה של קשרי CC.

קשר זה יציב מאוד, מה שהופך תגובה זו לקשה מאוד. שימוש באור הוא גישה בת-קיימא להשגת תגובה קשה שכזו. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ניסינו להוסיף מי חמצן ישירות לתגובה, דבר שהוביל לנטרול של האנזימים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כמות קבועה של מימן פחמון (hydrogen peroxide). תחילה השתמשנו ב-OleT מנוקה לביוקטליזה מונעת אור כדי לאפיין את האנזים שלנו. מאוחר יותר בחנו גם תמצית גולמית, דבר שיהיה חשוב לפיתוח יישומים תעשייתיים.

לאחר שיבוט הגן הסינתטי OleT לתוך וקטור הביטוי והחדרת הפלסמיד לתוך E.Coli כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, יש להחדיר את התאים לשתי מבחנות המכילות שלושה milliliters של מצע LB עם 100 micrograms per milliliter של ampicillin. יש לדגור את תרביות המקדימה בשייקר למשך 15 שעות. יש לדלל שני milliliters מהתרבית לתוך 200 milliliters של LB עם ampicillin בשני בקבוקים של ליטר אחד.

דגרו את הבקבוקים בשייקר בטמפרטורה של 37 degree celsius ובמהירות של 180 RPM עד שהתרביות מגיעות לצפיפות אופטית ב-600 nanometers שבין 0.6 ל-0.8. לאחר מכן, הוסיפו לתרביות 0.5 millimolar של delta aminolevulinic acid. לאחר מכן, גרו את התאים על ידי הוספת tetracycline לבקבוקים בריכוז של 0.2 micrograms per milliliter.

דגרו את התרביות למשך 15 שעות ב-20 degree celsius וב-180 RPM. לאחר ההשראה, העבירו את התרביות למבחנות צנטריפוגה וסובבו את המבחנות ב-12000 times G וב-four degree celsius למשך 20 דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant).

יש להחזיר את המשקעים למצב תמיסלי על ידי פיפטור ב-50 milliliters של Tris buffer קר בקרח ולהעביר את התמיסה למבחנה קונית לצנטריפוגה. לאחר מכן, יש לבצע צנטריפוגה במהירות של 4000 times G ובטמפרטורה של ארבעה degree celsius למשך 15 דקות. יש להסיר את הנוזל העליון ולהחזיר כל משקע למצב תמיסלי בשלושה milliliters של בופר על ידי פיפטור חוזר.

בצעו ליזיס לתאים באמצעות סוניקציה בשלושה מחזורים של 30 שניות, עם הפסקה של דקה אחת בין מחזור למחזור. לאחר מכן, סבבו את הליזט בצנטריפוגה ב-15000 $\times$g ובטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות, ואז העבירו בזהירות בעזרת פיפט את התמצית נטולת התאים למבחנות צנטריפוגה קוניות. להכנת התמצית הגולמית עבור הביוקטליזה המונעת מאור, העבירו 3 mL מהתמצית נטולת התאים למסנן צנטריפוגה של 10 kDa וסבבו בצנטריפוגה ב-4000 $\times$g ב-4°C כדי להסיר מולקולות קטנות.

השביה מחדש את החלבון בשלושה מיליליטר של Tris. כדי לאפיין את הפעילות של OleT בביוקטליזה המונעת על ידי אור, יש לטהר את החלבון. כדי להתחיל בטיהור החלבון, טען שלושה מיליליטר של תמצית תאיים ללא תאים (cell free extract) על עמודים מסוג nickel NTA spin columns שעברו שיווי משקל.

אטמו את העמודות באמצעות פקקי תחתון ומכסיי הברגה. נערו אותן קלות עד שהשרף יתפזר באופן שווה. המשיכו בהדגרה של העמודות במנער עליון.

לאחר מכן, סבבו את העמודה בצנטריפוגה. בשלב הבא, שטפו את העמודות על ידי הוספת 1 mL של תמיסת שטיפה וסבב בצנטריפוגה ב-700 ×g למשך שתי דקות. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות.

לאחר השטיפה, העבירו את העמודות למבחנות צנטריפוגה קוניות והוסיפו מיליליטר אחד של בופר אלוציה לכל עמודה. צנטריפוגו את המבחנות ב-700 ×g למשך שתי דקות וחזרו על תהליך האלוציה פעמיים נוספות. העבירו את תמציות העמודות המשולבות למסנן צנטריפוגה של 10 kilodalton וצנטריפוגו אותו ב-4000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C כדי להפריד את ה-imidazole ששימש לאלוציה מהאנזים.

לבסוף, קבעו את טוהר החלבון ואת ריכוזו כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל בהליך הביו-טרנספורמציה, הוסיפו תחילה 10% מחומר פעילי שטח כגון tergitol ו-28.4 milligrams של חומצה סטארית למים מזוקקים כדי להכין 10 milliliters של תמיסת מלאי בריכוז 10 millimolar. חממו את התמיסה בתא חימום, בטמפרטורה של 60 degrees celsius עד להמסה מלאה של החומצה הסטארית.

השתמשו בתמיסה זו להכנת תערובת ריאקציה בהתאם לפרוטוקול הבא. הוסיפו FMN, EDTA, בופר וחומצה סטאיארית לשתי מבחנות זכוכית שקופות וערבבו במקלחית במעלה של 25 °C. המשיכו בהוספה של 200 µg/mL של האנזים המטוהר או התמצית הגולמית למבחנות.

האירה אותם באמצעות נורת LED שקופה ממרחק של שני סנטימטרים. לאחר מכן, קח דגימות של 200 microliter בנקודות זמן ספציפיות לתוך מבחנות שמולאו מראש ב-20 microliters של 37% hydrochloric acid כדי לעצור את התגובות. לאחר מכן, הוסף חמישה microliters של תמיסת myristic acid בריכוז 10 millimolar לכל דגימה כסטנדרט פנימי.

כדי לנתח את תוצרי התגובה, הוסיפו פעמיים 500 µL של ethyl acetate למבחנות. הפכו את המבחנות כדי לערבב אותן וסובבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-13,000 ×g. לאחר מכן, העבירו 400 µL מהעל-נוזל (supernatants) למבחנות מיקרו-צנטריפוגה ואדו אותם לחלוטין על ידי נשיפה עדינה על המבחנות באמצעות אוויר דחוס. הוסיפו 200 µL של MSTFA למבחנות.

דגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 דקות כדי לבצע דריבטיזציה לדגימות לפני הניתוח. נתחו את תוצרי התגובה על ידי הזרקת דגימה של 4 µL לכרומטוגרף גז המצויד בגלאי יינון להבה (FID), תוך שימוש בפרופיל הטמפרטורה המתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, קבעו את היחס בין heptadecane לבין beta hydroxy acid שנוצרו בכל דגימת תגובה באמצעות כרומטוגרף גז המצומד לספקטרומטר מסות.

השתמש בטמפרטורת התנור ובהגדרות ספקטרומטר המסות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הזרק 1 µL מכל דגימה לכרומטוגרף הגזים והקלט את הכרומטוגרמה. לבסוף, עקב אחר כרומטוגרמות ה-GCMS של כל דגימה ונתח אותן בהתאם לפרוטוקול היצרן.

המשקלים המולקולריים של התוצרים מהתגובות האנזימטיות נקבעו באמצעות כרומטוגרף גז המחובר לספקטרומטר מסות. עבור חומצות שומן בעלות שרשראות אציל ארוכות יותר, האנזים OleT מקטליז באופן מועדף את דה-קרבוקסילצייתן לאולפינים באורכים שונים. דגימות מתגובת הביוטרנספורמציה נותחו באמצעות כרומטוגרף גז המצויד בגלאי יינון להבה.

הוכח כי דה-קרבוקסילציה של חומצה סטארית מתרחשת במהירות הגבוהה פי שלושה מתגובת ההידרוקסילציה, כאשר 99% מהחומצה הסטארית הומרה לתערובת ביחס של 3.3:1 של הפטדקאן אחד ל-2-הידרוקסי חומצה סטארית. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הביוקטליזה המונעת על ידי אור תוך מספר שעות, במידה שהתהליך מבוצע כראוי. בקטליזה של אור, האתגר טמון בקישור תגובות מועילות לקציר האור.

במקרה שלנו, אנו משתמשים באור בתוך המולקולה FMN כפוטוסנסיטיזטור ומקשרים אותה לאנזים שלנו באמצעות מולקולת מעבר שהיא מימן פחמני (hydrogen peroxide).