Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג'ל Bioink

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים גישה רב-תכליתית לתכנון דיו ביולוגי הידרוג'ל שניתן להוציא באמצעות התקני הדפסה ביולוגית. לאחר מכן ניתן להשתמש בדיו הביולוגי לייצור מבני רקמות תלת מימדיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההדפסה הביולוגית, כגון כיצד לשלוט בתכונות המכניות הדרושות על מנת לספק חומר שניתן להוציא באמצעות מדפסת ביולוגית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו משתמשים ברכיבים זמינים מסחרית המשולבים בצורה מודולרית ליצירת דיו הידרוג'ל פשוט ויעיל הניתן להדפסה ביולוגית. היישומים של טכנולוגיות אלו כוללים יצירת אורגנואידים תלת מימדיים של רקמות שניתן להשתמש בהם כדי לדגמן במדויק את ההשפעות של תרופות, רעלים ומחלות. למרות ששיטה זו יכולה לספק מסגרת להדפסה ביולוגית של מבני כבד תלת מימדיים, ניתן ליישם אותה גם על סוגי רקמות אחרים כגון שרירים, ריאות ומעי גס.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שישנם מספר ריאגנטים שונים המשמשים ליצירת הדיו הביולוגי של ההידרוג'ל, אך למעשה זה די פשוט. מי שתדגים את ההליך תהיה יאנג-ג'ון סאול, פוסט-דוקטורנטית בצוות שלנו. כדי להתחיל, הכינו עיכול מטריצה חוץ-תאית ספציפית לרקמה שישמש בניסוח ההידרוג'ל כמתואר במקום אחר.

לאחר מכן, ממיסים פוטו-יוזם במים ביחס משקל לנפח של 0.1%כדי ליצור את הדיו הביולוגי של הידרוג'ל, ראשית ממיסים את רכיבי חומר הבסיס מערכות ההידרוג'ל של החומצה ההיאלורונית לתוך אליקוטים בודדים של תמיסת פוטו-יוזם המים. לאחר מכן, שלב את תמיסת ה-ECM, החומצה ההיאלורונית התיאולונית 2%, הג'לטין התיולטי 2%, הקישוריות הצולבות ומצע תרבית הפטוציטים ביחסים המוצגים כאן. כדי לשפר את תכונות האקסטרוזיה של הדיו הביולוגי, הוסף לתערובת 1.5 מיליגרם למיליליטר של חומצה היאלורונית ללא שינוי ו -30 מיליגרם למיליליטר ג'לטין.

לאחר מכן, מערבל את התערובת המתקבלת על גבוה במשך עשר שניות לפני השימוש. לפני בדיקת הדיו הביולוגי במכשיר הדפסה ביולוגית, בדוק תחילה את מאפייני האקסטרוזיה על ספסל המעבדה. בעזרת מזרק רגיל, זרוק דגימה של הדיו הביולוגי ולאחר מכן חבר מחט בגודל 20 עד 30 למזרק.

אפשר לדיו הביולוגי להצטלב, ולאחר מכן דחף את הדיו הביולוגי דרך המחט כדי להשיג חוטי הידרוג'ל שחולצו בצורה חלקה. אם הניסוח מסוגל ליצור נימה עם מעט בליטות, אז הוא מוכן להדפסה ביולוגית. כדי לטעון את תכשירי הדיו הביולוגי במדפסת ביולוגית, פיפטה את הדיו הביולוגי למחסניות מדפסת מעוקרות.

אפשר להם לשבת במשך 30 דקות לפני האקסטרוזיה מכיוון שהדיו הביולוגי יעבור שלב ראשון ספונטני של קישור צולב בתוך המחסנית. לאחר מכן, טען את המחסנית במערך ההדפסה וחבר מקור לחץ פנאומטי למחסנית. הכן תבנית פשוטה, כמו רשת של שבעה על שבעה מילימטרים של קווים מקבילים, להדפסה על מנת להעריך את תאימות האקסטרוזיה שלה.

בזמן שראש ההדפסה נע במישור ה-XY במהירות של כ-300 מילימטרים לדקה, הפעל לחץ של 20 קילופסקל על המחסנית כדי להוציא את הדיו הביולוגי. אם החומרים המוחצנים הם גושים או לא סדירים, הפחיתו את כמות הקישור המוצלב שנוספה על מנת לרכך את השלב הראשון של חומר מקושר. ניסוח דיו ביולוגי מוכן כהלכה אמור לבלוט בצורה חלקה, ולאפשר תצהיר וארכיטקטורות מדויקים.

הכן ספרואידים תלת מימדיים של כבד תאים ראשוניים בצלחת 96 בארות בשיטת הטיפה התלויה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר שלושה ימים בתרבית, אספו את כדורי הכבד מצלחת הטיפה התלויה באמצעות פיפטה, והעבירו אותם לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. תן לספרואידים להתיישב בתחתית הצינור החרוטי למשך דקה עד שתיים.

לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיה בעזרת פיפטה. העבר 110 עד 125 אחוז מנפח הבנייה התלת-ממדי המודפס הרצוי של תמיסת הדיו הביולוגית הטרייה של הידרוג'ל שהוכנה לצינור החרוטי המכיל את הספרואידים. לאחר מכן, פיפטה בזהירות את הספרואידים למעלה ולמטה כדי לתלות אותם מחדש בתמיסת הדיו הביולוגית של ההידרוג'ל.

לאחר ההשעיה השווה, העבר את תמיסת הספרואיד למחסנית מדפסת ביולוגית באמצעות פיפטה ואפשר לתמיסה לעבור את שלב ההצלבה הראשון למשך 30 דקות. לאחר שלב הצלבה, השתמש במכשיר הדפסה ביולוגית כדי ליצור את מבני ההידרוג'ל הרצויים המכילים את הספרואידים הראשוניים של הכבד. לאחר כל שכבת תצהיר, חשוף את הדיו המודפס לאור UV למשך שתיים עד ארבע שניות כדי להפעיל את מנגנון הקישור המשני.

זה ייצב את המבנים ויגביר את הנוקשות לרמה הרצויה. ריכוז ה-PEG אלקין בתמיסה הוא מה ששולט בצפיפות ההצלבה הכוללת, ולכן שולט בעיקר בקשיחות המבנה הסופי. לאחר הדפסה ביולוגית, נצפתה כדאיות תאים גבוהה במבני הכבד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

בתנאים סביבתיים אופטימליים, הכדאיות צריכה להיות מעל 85% בנוסף, כאשר המבנים נצבעו לסמנים המעידים על רקמת כבד, נצפו כולם ביטוי חיובי של CYP3A4, איזופורם ציטוכרום P450, אלבומין תוך-תאי, E-cadherin, חלבון הידבקות של תא אפיתל ו-DPP4, חלבון המתבטא מאוד בכבד. כאשר נבדקה המדיה התרבית לרמות אוריאה ואלבומין, נמצא כי המבנה הפריש גם אוריאה וגם אלבומין ברמות קבועות במהלך 14 הימים. זה עוד מצביע על כך שדיו ההידרוג'ל הספציפי לרקמה מסייע בשמירה על תפקוד תאי הכבד.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים מתחילתה ועד סופה אם היא מבוצעת כראוי. עם זאת, לעתים קרובות זה תלוי במכשיר ההדפסה הביולוגית הספציפי שבו משתמשים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלעתים קרובות יש להתאים את השלבים המודגמים כך שיתאימו לסוגי רקמות אחרים או להתקני הדפסה ביולוגית.

בעקבות הליך זה, ניתן ליצור ניסוחים אחרים של דיו ביולוגי הידרוג'ל על מנת לתמוך בהדפסה ביולוגית של סוגי רקמות אחרים. פיתוח הטכנולוגיות הללו עזר לסלול את הדרך ליצירת פלטפורמות מרובות אורגנואידים, גוף על שבב לסינון תרופות ומודלים של מחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתחיל לתכנן חומרים שניתן להשתמש בהם להדפסה ביולוגית של מבני רקמות תלת מימד באמצעות קישור צולב רב-שלבי.

אל תשכח שעבודה עם אור אולטרה סגול עלולה להיות מסוכנת ביותר לראייה, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש במשקפי מגן UV בעת ביצוע הליך זה.