Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

המטרה הכוללת של מתודולוגיית הביודפוס המיקרופלואידית הזו היא ליצור מבנה רקמה מvסקולרי (בעל כלי דם). שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח בביו-פבריקציה של רקמות מvסקולריות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא ורסטיליות ביצירת תעלת כלי דם תלת-ממדית מבוקרת להנדסה של רקמות מvסקולריות באמצעות תהליך משני של זריעת תאים.

למרות שפרוטוקול זה מספק תובנות לגבי הנדסה של רקמות לב מvסוולריזציה (vascularized), ניתן ליישמו גם על סוגי רקמות רבים אחרים כגון כבד, עור ואפילו סרטנים. אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, כיוון שהגדרת המדפסת הביולוגית עשויה להיות מורכבת. כדי להתחיל בהליך זה, יש להרכיב ראש הדפסה מיקרופלואידי קונצנטרי דו-שכבתי על ידי החדרת מחט קהה קטנה יותר, המשמשת כליבה, למרכזה של מחט קהה גדולה יותר, המשמשת כמעטפת.

ודאו שהמחט הליבנית בולטת מהמעטפת החיצונית בכ-1 מילימטר. לאחר מכן, הכניסו מחט בכיול 23 gauge לתוך גוף המחט המרכזית בכיוון ההפוך. צרו חור בצד גוף המחט החיצונית והכניסו מחבר מתכת בגודל תואם.

יש לאטום באמצעות דבק אפוקסי. התקן את האקסטרודר על ראש של מדפסת ביולוגית (bioprinter), באמצעות מחזיק מפולימתיל מטאקרילט או PMMA. לאחר מכן, להזרקה של הדיו הביולוגי (bioink) ותמיסת הצמירה (crosslinking solution) דרך שני צינורות PVC בנפרד, חבר את פתחי הכניסה של ראש ההדפסה למשאבת מזריקה בעלת שני ערוצים.

הכינו את הדיו הביולוגי באמצעות תערובת של alginate, gelMA ופוטו-איניציאטור. המיסו בבופר HEPES בריכוז 25 millimolar, המכיל 10% fetal bovine serum או FBS. לאחר מכן, הכינו תמיסה של calcium chloride בריכוז 0.3 molar בבופר HEPES המכיל 10% FBS, שתשמש כנוזל נשא לקשירה הצולבת.

ממש לפני ההדפסה הביולוגית, בצעו טריפסינציה לתאי אנדותל של וריד טביליות אנושי (HUVECs) למשך חמש עד 10 דקות. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 800 RPM למשך חמש דקות במבחנה של 15 milliliter. השביו את התאים בתוך הדיו הביולוגי בריכוז של חמש עד 10 פעמים 10⁶ תאים ל-milliliter על ידי פיפטינג איטי של חמש עד 10 פעמים.

בשלב הבא, השתמש במשאבת מזרקים בעלת שני תעלות כדי להתחיל את ההזרקה של הדיו הביולוגי הטעון ב-HUVECs דרך תעלה אחת, ואת נוזל הצמירה (crosslinking fluid) דרך התעלה השנייה, בקצב זרימה של 5 µL לדקה. אפשר לזרימה להמשיך ברציפות למשך עד דקה אחת עד להתייצבותה. לאחר מכן, התחל את תנועת ראש ההדפסה תוך שמירה על מהירות השבצה של המדפסת הביולוגית של כ-4 mm לשנייה.

ביו-הדפסה זו אמורה להוביל לג'לציה יונית מהירה של רכיב האלגינאט ולהשקעה של פיגום מיקרו-סיבי. לאחר הדפסת הפיגום, בצע קישור צולב פוטו-כימי לרכיב ה-gelMA באמצעות אור UV בעוצמה של 5 עד 10 milliwatts per square centimeter למשך 20 עד 30 שניות כדי להשלים את הג'לציה הכימית. לאחר מכן, הסר את עודפי סידן כלוריד מהפיגום על ידי שטיפה עדינה ב-PBS חמים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

תרבתו את הפיגום הזה במצע גידול לתאי אנדותל בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% CO2, למשך עד 16 ימים. החליפו את המצע לפחות אחת ליומיים. במהלך תקופת התרבית, עקבו אחר תאי ה-HUVECs תחת מיקרוסקופ עד אשר ינדדו להיקפים של מיקרוסיבי הפיגום וייצרו מבנים דמויי לומן.

לאחר מכן, הסר בזהירות את כל המצע מהחלל הבין-רקמתי (intrastitial space) של הפיגום באמצעות כוח קפילרי בעזרת פיסת נייר סינון סטרילי. הוסף באופן מיידי טיפה מתליה של סוג תא שני, כגון cardiomyocytes, על גבי הפיגום, כדי לאפשר לתאים לחלחל לכל החלל הבין-רקמתי. לאחר מכן, דגור את הפיגום באינקובטור למשך 30 דקות עד שעתיים, כדי לאפשר לתאים להיצמד למיקרוסיבים הבודדים.

הסר תאים שאינם נצמדים על ידי שטיפה עדינה של הפיגום ב-PBS. תרבט פיגום זה במצע מתאים עד להיווצרות הרקמה המועורקת הרצויה. הביודפוס מיקרופלואידי המתואר כאן, מאפשר ביודפוס ישיר של פיגומים מיקרו-סיביים באמצעות ביו-דיו בעל צמיגות נמוכה.

ניתן להדפיס ביו-דו-ממד של פיגום בגודל של 6x6x6 מילימטרים מעוקב, המכיל יותר מ-30 מיקרוסיבים, בתוך 10 דקות. מבטים מלמעלה ומצדדים של מיקרוגרפים של הפיגום מראים שלמות מבנית מצוינת במהלך תהליך ההדפסה הביולוגית. תוצאה זו הושגה באמצעות קשירה יונית מיידית של רכיב האלגינאט עם calcium chloride.

לאחר אקסטרוזיה מיקרופלואידית של הדיו הביולוגי, קשירה צולבת יונית וקשירה צולבת פוטו-כימית, תאי HUVECs שמרו על חיוניות גבוהה יחסית. התאים התרבו ונדדו מההתפלגות ש הייתה אקראית בתחילה ביום אפס, אל ההיקפים של המיקרוסיבים ביום 16. תאי שריר לב (cardiomyocytes) של חולדות רכים שנזרעו על הפיגום הבשילו ומילאו את הפיגום.

הם הראו ביטוי חזק של סמנים ביולוגיים לבביים תפקודיים, כגון sarcomeric alpha actinin ו-connexin 43. מיקרוסקופיה קונפוקלית של פיגום מיקרו-סיבי הודפס ביולוגית, שאוכלס בתאי שריר לב (cardiomyocytes), חשפה קיום משותף של HUVECs ותאי שריר לב.

תאי HUVECs נמצאים בעיקר בגבולות של המיקרוסיבים, בעוד שהקרדיומיוציטים מקיפים את החלק החיצוני של המיקרוסיבים. התאים הצליחו לשמור על פעימות ספונטניות ומסונכרנות למשך תשעה עד 28 ימים, בהתאם למקור התאים ולתצורת הפיגומים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על אופן ייצור רקמות מvaskularized באמצעות טכניקת הדפסה ביו-מיקרופלואידית, וכן על ייצור ראש ההדפסה ותפעול המדפסת הביולוגית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן ייצור ראש ההדפסה ותפעול המדפסת הביולוגית עשויים להיות מורכבים עבור אנשים שלא השתמשו בהם בעבר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להבטיח שהמחטים השתיים בראש ההדפסה יהיו קונצנטריות ולאפשר לזרימה להתייצב לפני תחילת ההדפסה הביולוגית.

עם פיתוחה של טכניקה זו, עומד כעת לרשותם של חוקרים בתחומי הנדסת הרקמות והביו-פבריקציה כלי מאפשר נוסף ליצירת מבני רקמה מvסכולריים, הן למטרות רגנרציה in vivo והן למטרות מידול רקמות in vitro.