הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי גזע מזנכימליים חיוביים ל-Sca1 מרכיסות שומן שונות של עכבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות מיון תאים המבוסס על חרוזי אימונומגנטים, ניתן להעשיר ביעילות תאי גזע ממקור שומני ממאגרי שומן שונים עבור ניסויים המשך. בדרך כלל, חוקרים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי, שכן יש לאפטמי את עוצמתו ומשך הזמן של עיכול הרקמה המתוּוך על ידי קולגנאז כדי להשיג מספר תאים מספיק למיון.

כדי לבודד את כריות השומן התת-עוריות, התחילו בהנחת העכבר על לוח ניתוח מספוג במצב שכיבה על הגב (supine) והתיז את החיה ב-70% ethanol. לאחר קיבוע הכפות ללוח, בצעו חתך קטן בעור הבטן התחתונה. לאחר מכן, אחזו בראש החתך בעזרת פינצטה, והשתמשו במספריים כדי להפריד את העור ואת הצפק (peritoneum) מהבטן ועד לחזה.

בצעו חיתוכים לטרליים בעור, לאורך צד הגוף, וקלפו את העור מהפריטונאום לכיוון הראש. לאחר מכן, משכו לאחור את שארית העור תוך החזקת השומן האינגווינלי הרחק מהגוף, והשתמשו במחטים בכיל 22 gauge כדי להצמיד את העור ללוח. בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס כרית שומן אינגווינלית אחת במקור שלה סמוך לפריטונאום, והשתמשו במספריים עדינים כדי לגזור בין העור לשומן האינגווינלי, תוך התקדמות לעבר המפשעה ומניעת זיהום של כרית השומן התת-עורית בעור.

לאחר מכן, העבירו את רקמת השומן המפשית (inguinal fat pad) המבודדת לצלחית של 60 מילימטר המסומנת כ-SQ ומכילה מצע תרבית בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, ואספו את רקמת השומן המפשית מהצד השני של בעל החיים באופן דומה. כדי לבודד את רקמות השומן הוויסרליות (visceral fat pads), חתכו את הפריטונאום כדי לחשוף את רקמות השומן הוויסרליות ואת המעיים. לאחר מכן, הזיזו את המעיים הצידה, לכיוון בית החזה.

תפסו את כרית השומן הוויסרלי (שומן פנימי) בקצה הדיסטלי, משכו בעדינות כלפי מעלה את רקמת השומן, והוציאו אותה תוך הקפדה להשמיט את רקמת האפידידימיס. לאחר מכן, הניחו את כרית השומן בצלחת של 60 מילימטר המסומנת ב-VIS ומכילה מצע גידול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר איסוף כל כריות השומן, העבירו את הצלחות למCב תרביות רקמה, ושאבו את המצע.

השתמשו במספריים מעוקלים כדי לקצץ את הרפידות. לאחר מכן, העבירו את חתיכות השומן למבחנות בנפח 50 milliliter המכילות קולגנז freshly prepared. לאחר מכן, נערה את המבחנות במהירות של 300 RPM ובטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10 עד 20 דקות, עד לעיכול הרקמות.

ייתכן שחלקים מרקמת כרית השומן התת-עורית עדיין יהיו גלויים. הוסף 20 milliliters של מצע תרבית לתמיסת הקולגנאז כדי להפסיק את העיכול, והשתמש בפיפטה סרולוגית של 10 milliliter כדי לשאוב ולהעביר את תערובת הרקמה 10 פעמים כדי לפרק לחלוטין את הרקמות שעברו עיכול. סנן את התאים דרך מסנני תאים של 100 micron, וסבב את הרקמות בצנטריפוגה.

לאחר מכן, שפכו בזהירות את המצע, תוך הקפדה שלא להפריע למשקעים, והשעו בעדינות את שתי קבוצות התאים בחמישה מיליליטרים של מים סטריליים. המתינו שתי דקות עד להליסת האריתרוציטים. לאחר מכן, עצרו את התגובה בכל מבחנה באמצעות 25 מיליליטרים של מצע מועשר ב-FBS.

סננו את שתי אוכלוסיות האדיפוציטים דרך מסנני תאים חדשים של 100 מיקרון, צנטריפוגו אותם שוב, ולאחר מכן השעיקו את המשקעים ב-1 עד 3 מיליליטר של מצע גידול. לאחר ספירה בשיטת הדחה של trypan blue, זרעו בנפרד 1x10⁶ תאים מרפיד שומן תת-עורי ותאים ויסרליים לבארים נפרדות של פלטת תרבית תאים בעלת שש בארות. לאחר טריפסינציה של התאים, דללו את הטריפסין ב-1 מיליליטר של בופר הפרדה, ולאחר מכן צנטריפוגו את פלטות התרבית.

אנו תולה את התאים ב-500 microliters למבחנה של תמיסת הפרדה, וסובב את התאים שוב בצנטריפוגה. כעת, השהה מחדש את התאים ב-90 microliters למבחנה של תמיסת הפרדה, ומערבב 10 microliters של נוגדן ראשוני anti-Sca1 FITC לתוך תרחיף התאים. לאחר 10 דקות של דגירה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בחשיכה, שוטפים את התאים במיליליטר אחד של תמיסת הפרדה למבחנה.

לאחר הצנטריפוגה, יש לרספנדות את התאים ב-80 µL של תמיצת הפרדה לכל סספנסיית תאים. לאחר מכן, ערבבו 20 µL של Anti-FITC Microbeads לתוך כל באר, והניחו את הפלטות בטמפרטורה של 4 °C, בהגנה מאור, למשך 15 דקות. בסיום הדגירה, שטפו את התאים ב-1 mL של תמיצת הפרדה, ורספנדו את התאים ב-500 µL של תמיסה רעננה לכל מבחנה.

כעת, הניחו עמודה במחזיק המגנטי, ושטפו את העמודה עם 500 µl של תמיסת הפרדה. העבירו את התאים מתרבית הרקמה של פדי השומן התת-עורי אל העמודה, תוך הקפדה להימנע מבועות, ואספו את התאים הבלתי-מסומנים השליליים ל-Sca1 לשפופרת קונית של 15 ml. לאחר שכל התאים עברו, שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 500 µl של תמיסת הפרדה.

לאחר מכן, העבירו את העמודה מהמגנט לשפופרת קונית חדשה בנפח 15 מיליליטר, והעבירו מיליליטר אחד של תמיסת הפרדה טרייה דרך העמודה כדי להדיף את התאים החיוביים ל-Sca1. לבסוף, סבבו במערבל צנטריפוגי את שתי פראקציית התאים, החיוביים והשליליים ל-Sca1, ותלו את המשקעים במיליליטר אחד של מצע גידול. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים בכל פראקציה, והעבירו אותם לבאריים נפרדים בתוך פלטת תרבית תאים חדשה בעלת שישה בארים.

תאי סטרומה וסקולריים שבודדו משומן תת-עורי מציגים צורה תאית מתוחה דמוית פיברובלסט, ללא קשר לרמת הביטוי של Sca1 שבהם. בדומה לתאים בעלי ביטוי גבוה של Sca1 המופקים משומן מותני תת-עורי, תאים בעלי ביטוי גבוה של Sca1 המופקים משומן ויסרלי של האפידידימיס מציגים צורה תאית מתוחה דמוית פיברובלסט. זאת בעוד שתאי VIS בעלי ביטוי נמוך של Sca1 מציגים צורה אפיתלואידית.

תאי Sca1 high שבודדו מעכברי Sca1-GFP מבודדים מזוהים בקלות כתאים חיוביים ל-GFP בתרבית רקמה. למעשה, כאשר תאים אלו נבחנים באמצעות ציטומטריית זרימה, נמצא כי רוב התאים החיוביים ל-GFP מקודדים כבעלי ביטוי של חלבוני Sca1 על פני השטח של התא, כפי שהזוהו על ידי נוגדן anti-Sca1. בשילוב עם ניתוחי real-time PCR, ניתן להוכיח את הביטוי הדיפרנציאלי של מטאלופרוטיאנזות מטריקס קולגנוליטיות בין תאי גזע ממקור אדיפוציטרי עם ביטוי Sca1 high שבודדו משומן מפשעי (inguinal) לעומת שומן מהאפידידימיס (epididymal).

בנוסף, כאשר נעשה שימוש בג'לים של קולגן מסוג I המסומנים בפיב Lorentz-פלואורסצאין להערכת פעילות פירוק פרי-צלולרית, נצפית פעילות משמעותית מוגברת של עיצוב מחדש של קולגן המתווכת על ידי תאי גזע מודרמיים מהרקמה השומנית של האיברים הפנימיים עם ביטוי גבוה של Sca1. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את בידוד התאים מרפידת השומן תוך שעתיים אם הפעולה מבוצעת כראוי. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על שדה ניתוח נקי ומאורגן כדי להבטיח בידוד יעיל של רפידת השומן.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת פירוק קולגן, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לשחזור רקמה המתווך על ידי תאי גזע מהרקמה השומנית. לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההשמנה וביולוגיית המטריקס לבחון את תפקידם של תאי גזע מהרקמה השומנית בשחזור ובבקיאות של רקמה שומנית בעכברים ובבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד להשיג ולהעשיר תאי Sca1 חיוביים ראשוניים ממאגרי רקמה שומנית.