הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1 ^גבוה בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי גזע מזנכימליים חיוביים Sca1 מרפידות שומן שונות של עכברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי שימוש במיון תאים מבוססי חרוזים אימונומגנטיים, ניתן להעשיר תאי גזע שמקורם בשומן ממאגרי שומן שונים לניסויים הבאים. בדרך כלל, חוקרים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לייעל את חוזק ומשך עיכול הרקמות בתיווך קולגנאז כדי להשיג מספר מספיק של תאים למיון.

כדי לבודד את רפידות השומן התת עוריות, התחל בהנחת העכבר על קרש חיתוך קצף במצב שכיבה וריסוס החיה באתנול 70%. לאחר הצמדת הכפות ללוח, בצע חתך קטן בעור הבטן התחתונה. לאחר מכן, אוחזים בחלק העליון של החתך בעזרת מלקחיים, השתמשו במספריים כדי להפריד את העור והצפק מהבטן לבית החזה.

ביצוע חתכים רוחביים בעור, לאורך צד הגוף, משקפים את העור הרחק מהצפק לכיוון הראש. לאחר מכן, משוך לאחור את העור שנותר, הרחק את השומן המפשעתי מהגוף, והשתמש במחטים בגודל 22 כדי להצמיד את העור ללוח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לתפוס כרית שומן מפשעתית אחת במקורה ליד הצפק, והשתמש במספריים עדינים כדי לחתוך בין העור לשומן המפשעתי, להתקדם לכיוון המפשעה, ולהימנע מזיהום כרית השומן התת עורית בעור.

לאחר מכן, הניחו את כרית השומן המפשעתי המבודדת בצלחת 60 מילימטר המסומנת ב-SQ המכילה מדיום תרבית של 37 מעלות צלזיוס, וקצרו את כרית השומן המפשעתי מהצד השני של החיה באותו אופן. כדי לבודד את רפידות השומן הקרביים, חתוך את הצפק כדי לחשוף את רפידות השומן הקרביים והמעיים. לאחר מכן הזיזו את המעיים הצידה, לכיוון בית החזה.

אוחזים בכרית השומן הקרביים בקצה הדיסטלי, מושכים בעדינות את רקמת השומן ומנתחים אותה, תוך הקפדה להוציא את רקמת האפידידימלית. לאחר מכן מניחים את כרית השומן בכלי 60 מילימטר המסומן ב-VIS המכיל מדיום תרבית של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שנאספו כל רפידות השומן, העבירו את הכלים למכסה המנוע של תרבית רקמות, ושאבו את המדיום.

השתמש במספריים מעוקלים כדי לטחון את הרפידות. לאחר מכן, הוסיפו את חתיכות השומן לצינורות בודדים של 50 מיליליטר המכילים קולגנאז טרי. לאחר מכן, יש לנער את הצינורות ב -300 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 20 דקות, עד שהרקמות מתעכלות.

חתיכות מסוימות של רקמת כרית שומן תת עורית עשויות עדיין להיות גלויות. הוסף 20 מיליליטר של מדיום תרבית לתמיסת הקולגנאז כדי לעצור את העיכול, והשתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לשאוב ולהוציא את תרחיץ הרקמות 10 פעמים כדי לנתק לחלוטין את הרקמות המעוכלות. סנן את התאים דרך מסנני תאים של 100 מיקרון, וצנטריפוגה את הרקמות.

לאחר מכן שפכו בזהירות את המדיום, הקפידו לא להפריע לכדורים, והשעו בעדינות את שתי קבוצות התאים בחמישה מיליליטר מים סטריליים. המתן שתי דקות עד שהאריתרוציטים יעברו ליזה. לאחר מכן עצרו את התגובה בכל צינור עם 25 מיליליטר מדיום בתוספת FBS.

סנן את שתי אוכלוסיות השומנים דרך מסנני תאים חדשים של 100 מיקרון, סובב אותם שוב למטה ולאחר מכן השהה מחדש את הכדורים באחד עד שלושה מיליליטר של מדיום. לאחר ספירה על ידי אי הכללה כחולה של טריפאן, צלחת בנפרד אחת כפול עשר עד תאי כרית השומן התת עורית השישית ותאי הקרביים לבארות בודדות של צלחת תרבית תאים בת שש בארות. לאחר ניסיון התאים, יש לדלל את הטריפסין במיליליטר אחד של מאגר הפרדה, ולאחר מכן לצנטריפוגה את לוחות התרבות.

אנו משעים את התאים ב-500 מיקרוליטר לכל צינור של חוצץ הפרדה, ומצנטריפוגה שוב את התאים. כעת, השעו מחדש את התאים ב-90 מיקרוליטר לכל צינור של מאגר הפרדה, וערבבו 10 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני anti-Sca1 FITC לתוך תרחיף התא. לאחר 10 דקות של דגירה בארבע מעלות צלזיוס בחושך, שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר הפרדה לכל צינור.

לאחר הסיבוב, התאים מושעים מחדש ב-80 מיקרוליטר של מאגר הפרדה לכל תרחיף תא. לאחר מכן מערבבים 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד FITC לכל באר, ומניחים את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור למשך 15 דקות. בתום הדגירה, שטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר הפרדה, והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של חיץ טרי לכל צינור.

כעת, הנח עמוד במחזיק המגנטי ושטוף את העמוד עם 500 מיקרוליטר מאגר ספרטון. העבירו את התאים מתרבית רקמת כרית השומן התת עורית אל העמודה, תוך הקפדה על הימנעות מבועות, ואספו את התאים השליליים Sca1 הלא מסומנים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כאשר כל התאים עברו דרכם, שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר הפרדה.

לאחר מכן העבירו את העמודה מהמגנט לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר, וצללו מיליליטר אחד של מאגר הפרדה טרי דרך העמודה כדי לחסל את התאים החיוביים Sca1. לבסוף, סובב כלפי מטה את חלקי התאים החיוביים והשליליים של Sca1, והשהה מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מדיום תרבית. לאחר מכן ספרו את מספר התאים בכל שבר, וצלחו את השברים בבארות בודדות של צלחת תרבית תאים חדשה בת שש בארות.

תאי סטרומה וסקולריים המבודדים משומן תת עורי מציגים צורת תא מתוחה דמוית פיברובלסטים ללא קשר לרמת הביטוי שלהם Sca1. בדומה לתאים גבוהים Sca1 שמקורם בשומן מפשעתי תת עורי, תאים גבוהים Sca1 שמקורם בשומן אפידידימלי קרביים מציגים צורת תא דמוית פיברובלסטים מתוחה. ואילו תאים נמוכים VIS Sca1 מציגים צורה אפיתלואידית.

תאים גבוהים Sca1 שבודדו מעכברי Sca1-GFP מבודדים מזוהים בקלות כתאים חיוביים ל-GFP בתרבית רקמות. ואכן, כאשר תאים אלה מוערכים על ידי ציטומטריית זרימה, רוב התאים החיוביים ל-GFP מאושרים לבטא חלבוני Sca1 על פני התא שלהם, כפי שזוהה על ידי נוגדן נגד Sca1. יחד עם ניתוחי PCR בזמן אמת, ניתן להדגים את הביטוי הדיפרנציאלי של המטריצה הקולגנוליטית מטאלופרוטאינאזות בין תאי גזע Sca1 שמקורם בשומן גבוה Sca1 מפשעתי ואפידידימלי.

יתר על כן, כאשר משתמשים בג'ל קולגן מסוג I עם תווית פלואורסצאין כדי להעריך את פעילות הפירוק הפרי-תאי, נצפתה פעילות מוגברת באופן ניכר של שיפוץ קולגן בתיווך תאי גזע קרביים שמקורם בשומן גבוה Sca1. לאחר השליטה, ניתן להשלים את בידוד תאי כרית השומן תוך שעתיים אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שדה כירורגי נקי ומאורגן כדי להבטיח בידוד יעיל של כריות השומן.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו בדיקת פירוק קולגן, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי שיפוץ רקמות בתיווך תאי גזע שמקורם בשומן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השמנת יתר וביולוגיה מטריצית לחקור את תפקידם של תאי גזע שמקורם בשומן בעיצוב מחדש ותפקוד רקמת שומן בעכברים ובבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש ולהעשיר תאים חיוביים ראשוניים של Sca1 ממאגרי רקמות שומן.