Name: שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של תסיסנית קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למדו שיטת אלקטרודה חדה להקלטת תגובות חשמליות מתוך-תאיות מקולטני אור ונוירונים ביניים ב-Drosophila. טכניקה זו מאפשרת הקלטות איכותיות לטווח ארוך עם נזק מינימלי לתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למיק סוואן, כריס אסקהם ומרטין גוטרי על תרומתם החשובה בתכנון ובנייה של רכיבים חשמליים ומכניים רבים של האסדות. המחקר הנוכחי של MJ נתמך על ידי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (מענק BBSRC: BB/M009564/1), קרן המחקר הפתוחה של מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח הקוגניטיביים ולמידה (סין), מענק מומחים זרים מתקדם (סין), מלגת קרן ג'יין ואטוס ארקו (פינלנד), ומענק קרן Leverhulme (RPG-2012-567).

למחברים אין מה לחשוף

הצגנו את שלבי המפתח הבסיסיים כיצד להשתמש במיקרו-אלקטרודות קונבנציונליות חדות כדי לתעד תגובות תוך-תאיות של קולטני אור R1-R6 ו-LMCs בעיני זבוב שלמות. שיטה זו עברה אופטימיזציה, יחד עם כלי חומרה ותוכנה מותאמים אישית, במהלך 18 השנים האחרונות כדי לספק הקלטות באיכות גבוהה לאורך זמן כדי לענות על מגוון רחב של שאלות ניסיוניות. על ידי השקעת זמן ומשאבים לבניית מערכי ניסוי חזקים ומדויקים, וייצור מיקרואלקטרודות בעלות תכונות חשמליות חיוביות, הקלטות באיכות גבוהה יכולות להפוך לנורמה בכל מעבדה העוסקת בנוירופיזיולוגיה חזותית של דרוזופילה . בעוד שמערכות הקלטה וגירוי אור מתוכננות היטב חשובות לביצוע מהיר של פרדיגמות ניסיוניות שונות, ישנם שלושה שלבים פרוצדורליים שהם קריטיים עוד יותר להשגת הקלטות מוצלחות: (i) לבצע את הכנת הזבוב עם נזק מינימלי לעיניים, (ii) למשוך מיקרו-אלקטרודות עם התכונות החשמליות הנכונות, ו-(iii) להניע את אלקטרודת ההקלטה לתוך העין מבלי לשבור את קצה. בסופו של דבר, כדי לתעד נתונים משמעותיים, החוקר צריך להבין את הבסיס הפיזיקלי של האלקטרופיזיולוגיה וכיצד לייצר מיקרו-אלקטרודות מתאימות לסוגי התאים הממוקדים.
לכן, המגבלות של טכניקה זו נקבעות בעיקר על ידי הסבלנות, הניסיון והיכולת הטכנית של החוקר. מכיוון שטכניקה זו יכולה לקחת זמן רב לשלוט בתאי דרוזופילה קטנים, מומלץ לאלקטרופיזיולוגים מתלמדים להתאמן תחילה עם עיני חרקים גדולות יותר, כגון זבוב36 או ארבה35, תוך שימוש באותו מתקן. ברגע שביצוע הקלטות תוך-תאיות באיכות גבוהה מקולטני האור והאינטרנוירונים הגדולים יותר הופך לשגרה, הגיע הזמן לעבור לעין הדרוזופילה . מגבלה נוספת של הטכניקה נוגעת לזיהוי תאי. ניתן לטעון תאי דרוזופילה שחדרו באופן אלקטרופורטי בצבעים, כולל צהוב לוציפר או נוירוביוטין. עם זאת, בגלל גודל הקצה הקטן של המיקרואלקטרודות, אלקטרופורזה פועלת בצורה פחות יעילה מאשר עם אלקטרודות התנגדות נמוכות יותר, כגון אלקטרודות תיקון. יתר על כן, למיקרו-אלקטרודות המלאות בצבע יש באופן אופייני תכונות חשמליות פחות חיוביות, מה שמקשה הרבה יותר על תיעוד תגובות באיכות גבוהה איתן מקולטני אור ו-LMC של דרוזופילה .
בעיה טכנית שמתרחשת לפעמים היא אות כניסה לא יציב, או היעדר מוחלט שלו. זה קשור לעתים קרובות לכך שאות המתח נסחף כל הזמן או גבוה / נמוך מטווח ההקלטה של המגבר. ברוב המקרים, התנהגות זו נגרמת על ידי חסימת אלקטרודת ההקלטה (או שהקצה שלה דק מדי - בעל התנגדות גבוהה מדי או קיבול תוך-מורלי - כדי לבצע כראוי שינויי אות מהירים). למרות שאפשר לנסות לבטל את חסימת הקצה על ידי זמזום קיבול האלקטרודה, מה שלפעמים עובד, לעתים קרובות המצב נפתר בצורה הטובה ביותר על ידי החלפת אלקטרודת ההקלטה. זה עשוי לדרוש התאמות פרמטרים במכשיר מושך המיקרו-אלקטרודות כדי להוריד את התנגדות הקצה של האלקטרודות החדשות. קצה האלקטרודה יכול גם להיחסם בתכשירים, שעבורם לקח יותר מדי זמן לכסות את חור הקרנית על ידי ג'לי נפט. מגע אוויר ממושך יכול לייבש את רקמת הרשתית שנחשפה זה עתה, ולהפוך את שכבת פני השטח שלה לחומר דמוי דבק. אם זה המקרה, החוקר בדרך כלל רואה כתם אדום של רקמה תקוע על אלקטרודת ההקלטה כאשר הוא מושך אותה מהעין. הפתרון היחיד כאן הוא לעשות הכנה חדשה. ג'לי נפט עשוי לספק יתרונות רבים לרישומים אלקטרופיזיולוגיים: (i) הוא מונע את קרישת המולימפה שעלולה לשבור את קצה האלקטרודה; (ii) הוא מצפה את קצה האלקטרודה ומפחית את הקיבול התוך-מורלי שלה, מה שמוריד את קבוע הזמן של האלקטרודה, ובכך יש לו פוטנציאל לשפר את הרזולוציה הזמנית של האותות העצביים המוקלטים40,41; (iii) הוא שומר על קצה האלקטרודה נקי, ומקל על חדירה; ולאחר החדירה, (iv) זה עשוי אפילו לעזור לאטום את קצה האלקטרודה לקרום התא42. 
האות יכול להיות לא יציב או ללכת לאיבוד כאשר חוט הכסף-כלוריד של מחזיק האלקטרודה נשבר או נטול כלור; במקרה כזה פשוט החלף או כלור מחדש את החוט הישן. האות החסר יכול לנבוע גם מכך שאחד (או שניהם) ממחזיקי האלקטרודות אינו מחובר היטב לשקעים שלהם. עם זאת, זה יוצא דופן ביותר שציוד לא יהיה תקין. אם האות אינו ניתן לגילוי וכל האפשרויות האחרות מוצו, בדוק שכל חלק במנגנון ההקלטה, כולל הבמה הראשית, המגבר, מסנני מעביר נמוך וממירי AD/DA, מחוברים כראוי ומתפקדים כרגיל. אחת הדרכים להשיג זאת היא להחליף כל מכשיר באחר מאסדה שידועה כפועלת כרגיל. לחלופין, השתמש במחולל אותות כדי לבדוק את ביצועי הרכיבים האלקטרוניים בזה אחר זה.
אך אולי הבעיה הטכנית הנפוצה ביותר העומדת בפני האלקטרופיזיולוג היא זו של הקלטת רעש. באופן כללי, הקלטת רעש היא הפעילות החשמלית הנצפית מלבד התגובה העצבית הישירה לגירוי נתון. מכיוון שהכנת הזבובים, כאשר היא נעשית כהלכה, היא יציבה מאוד, הרעש הנצפה (מעבר לשונות הטבעית של התגובות) נובע לרוב מלולאות קרקע בציוד ההקלטה, או נקלט ממכשירים חשמליים סמוכים. רעש כזה הוא בדרך כלל זמזום רשת של 50/60 הרץ וההרמוניות שלו; אך לפעמים מורכב מצורות גל מורכבות יותר. כדי לפענח את מקור הרעש, הסר את מחזיק הכנת הזבובים מההגדרה, חבר את אלקטרודות ההקלטה והייחוס דרך טיפת רינגר זבוב (או הנח אותן באמבט תמיסת רינגר קטן; ראה שלב 1.2.6) והקלט את האות במצב CC או גשר. אם ניתן להבחין ברעש באות המוקלט, סביר להניח שמשמעות הדבר היא שהרעש חיצוני להכנת הזבוב.
בדיקה טובה נוספת לזיהוי מקור הרעש היא החלפת מחזיקי האלקטרודות בדגם תא חשמלי המחובר למגבר. בהגדרה מוגדרת ומקורקעת באופן אידיאלי, האות המוקלט צריך להיות כעת כמעט נטול רעשים, ומציג רק רעש סיביות סטוכסטי מממיר ה-AD (במקרה הטוב אפילו לא זה!). אם עדיין קיים רעש, בדוק שוב שכל ציוד האסדה מקורקע כהלכה. גישה נוחה לאיתור לולאות הארקה היא: (i) לנתק את כל חוטי ההארקה מכל החלקים בתוך האסדה; (2) לוודא שלאחר ביצוע פעולה זו, כל חלק בודד מבודד למעשה מהקרקע, באמצעות מד אוהם; (3) לחבר את החלקים, בזה אחר זה, לקרקע המרכזית ישירות, לא דרך כל חלק אחר של האסדה. נסה גם לשנות את תצורות הציוד. לדוגמה, לפעמים הזזת המחשב והצג רחוק יותר מהאסדה יכולה להפחית את הרעש; עם זאת, במקרים אחרים, הזזת המחשב בתוך ארון הציוד מפחיתה את הרעש. כדאי גם לנתק את הציוד הסמוך כדי לראות אם הרעש מופחת, או להגן על רכיבים נוספים. יתר על כן, נסה לנתק או להחליף רכיבים שונים של ציוד ההקלטה, במיוחד כבלי BNC (שיכולים להיות בעלי חיבורי הארקה פגומים). אם נצפה רק רעש סיביות בעת שימוש במודל התא, מקור הרעש הראשוני הוא האלקטרודות או הכנת הזבוב עצמה. לדוגמא, יכול להיות שאלקטרודת הייחוס נוגעת בטעות בעצב מוטורי או בסיבי שריר פעילים בתוך קפסולת הראש (או מפריעה לשרירי התעופה בבית החזה - אם היא מונחת שם). בדרך כלל הכי פשוט להכין זבוב חדש להקלטה, תוך הקפדה על מזעור הנזק לזבוב. אבל אם הרעש נמשך והוא פס רחב, סביר להניח שהאלקטרודות אינן אופטימליות לניסויים; חד/עדין מדי (ולכן רועש מדי) או סתם לא נכון למטרה; ראינו אפילו אלקטרודות קוורץ הפועלות כאנטנות - קולטות אותות שידור חלשים! למרות שאיטרציה של הגדרות הפרמטר של מכשיר המושך כדי ליצור את המיקרו-אלקטרודות הנכונות להקלטות עקביות באיכות גבוהה מסוגי תאים ספציפיים יכולה לדרוש מאמץ רב, זה שווה את זה. ברגע שאלקטרודות ההקלטה מותאמות היטב לניסויים, הן יכולות לספק הקלטות ארוכות טווח באיכות יוצאת דופן.
ניתן ליישם טכניקות הקלטת מיקרואלקטרודות חדות באופן דומה לחקר עיבוד מידע עצבי במספר רב של תכשירים, כולל שכבות עיבוד שונות בעיני החרקים ובמוח43,44. מכיוון שקצות המיקרו-אלקטרודות יכולות להיות עדינות מאוד, אלה בדרך כלל פוגעות בתאים שנחקרו פחות מרוב יישומי ה-Patch-Clamp. חשוב לציין, מגברי המיקרו-אלקטרודות המודרניים של דגימה והחזקה מאפשרים שליטה טובה בתכונות החשמליות של הקצוות40,45-47. לפיכך, כאשר היא מיושמת כהלכה, טכניקה זו יכולה לספק נתונים אמינים הן מתכשירים in vivo3,5,7-10,44 והן במבחנה48 עם יחס אות לרעש גבוה ברזולוציה של תת-אלפית השנייה. דיוק כזה יהיה בלתי אפשרי עם טכניקות ההדמיה האופטיות של ימינו, שהן רועשות ואיטיות יותר. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטה כדי לאפיין את תכונות הממברנה החשמלית של תאים קטנים הן בתצורות מהדק זרם והן בתצורות מהדק מתח5,29,33,36,40-42,49, ומספקת נתונים חשובים לגישות מודלים ביופיזיקליות ואמפיריות7,8,11,33,49-54 המקשרות ניסויים לתיאוריה.

זבוב הפרות (תסיסנית) העין מורכבת הוא מערכת מודל מצוינת לחקור את הארגון הפונקציונלי של מערכי קולטי אור ואת interneuron לדגימת תמונה עצבית ועיבוד, ועל חזון חיה. המערכת כוללת בתרשים החיווט השלם ביותר 1,2 והוא חביב כלפי מניפולציות גנטיות וניטור פעילות עצבית מדויק (של אות לרעש גבוה יחס ברזולוציה הזמן) 3-10. עין תסיסנית היא מודולרית, המכיל ~ 750 מבנים רגילים לכאורה הכתיר עדשה נקראים האומטידיה, שביחד מספקים את לטוס שדה ראייה פנורמי המכסה כמעט לכל כיוונים סביב הראש שלה. המידע הראשוני של עין יחידות במדגם הם קולטני אור rhabdomeric שלה 7,8,11. כל אומטידיום מכיל שמונה תאי קולטי אור (R1-R8), אשר חולקים את אותה העדשה פן אבל מיושרים שבעה לכיוונים שונים. בעוד קולטני האור החיצוני ar R1-R6הדואר ביותר רגיש לאור כחול-ירוק, רגישויות הספקטרלית של התאים הפנימיים R7 ו R8, אשר שקרו על גב אחד את השני מצביע לאותו הכיוון, תערוכת שלוש תת-סוגים: חיוורות, צהוב הגבה אזור שולים (DRA) 12 15. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> איור 1. ארגון פונקציונלי של תסיסנית עיניים. (א) שני הגרעינים הראשונים אופטיים, הרשתית lamina, מודגשים באפור בתוך העין לטוס. R1-R6 רשתית photoreceptors ותאי monopolar הגדולים lamina (LMCs: L1-L3) נגיש בקלות in vivo להקלטות microelectrode חד קונבנציונליות. האלקטרודה סכמטי מדגיש את הנתיב הרגיל להקליט R1-R6 ברשתית. נתיב אחד להקליט LMCs ב lamina הוא להסיט את האלקטרודה במקביל לשמאל. (ב) Lamina הוא מטריצה ​​של איבר retinotopicallyמחסניות ized, שכל אחד מהם הוא ארוז עם נוירונים שמעבד מידע מאזור קטן ספציפי את המרחב החזותי. בשל סופרפוזיציה עצבי, שש קולטניות אור מן האומטידיה שכנות שונה לשלוח האקסונים שלהם (R1-R6) למחסנית lamina אותו, ויוצר סינפסות פלט histaminergic כדי L1-L3 ו תא amacrine (Am). (ג) הפצת המידע העצבי בין מסופי האקסון R1-R6 ואת interneurons חזותית (כולל L4, L5, Lawf, C2, C3 ו- T1), בתוך מחסנית lamina היא מורכבת. (ד) אקסונים קולטי האור R1-R6 לקבל פידבקים הסינפטי מתאי monopolar L2 ו L4. (ב) ו- (ג) שונה מן ריברה-alba ואח 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> עין תסיסנית היא מן הסוג סופרפוזיציה העצבי 16. משמעות הדבר היא tכובע האותות העצביים של שמונה קולטני אור שייך שבע שכנת האומטידיה, שנראה באותה הנקודה בחלל, הם אספו יחד מחסנית עצבית אחד בשני neuropils הבא: את lamina ומדולה. בעוד שש קולטני האור החיצוני פרויקט R1-R6 מסופי האקסון שלהם לעמודות עצביות lamina (איור 1), תאי R7 ו R8 לעקוף שכבה זו וליצור קשרים סינפטיים עם המקבילים שלהם לשד עמודת 17-19. חשמלית המדויקת אלה מייצרים מצע העצבי של מיפוי retinotopic ראייה לטוס מוקדם, ואז כל lamina (איורים 1 א-ג) ועמודת לשד (מחסנית) מייצגת נקודה אחת במרחב. תשומות ישירות מ קולטני אור R1-R6 מתקבלות על ידי תאי monopolar הגדולים (LMCs: L1, L2 ו- L3) ואת תא amacrine (Am) ב lamina 1,2,20. מתוך אלה, L1 ו- L2 הוא התאים הגדולים, בתיווך מסלולי מידע מרכזי (איור 1D), WHI<html> ch להגיב על מאזני וחוץ-נע קצוות, ובכך יוצרים בסיס החישוב של גלאי תנועה 21,22. ניסויים התנהגותיים עולה כי ב בניגוד ביניים, שני מסלולים להקל בתפיסת התנועה של בכיוונים מנוגדים: גב אל החזית L1 וקדימה אל גב בתאים L2 23,24. קישוריות נוספת מרמזת כי נוירונים L4 עשויים לשחק תפקיד קריטי לתקשורת הצדדית בין מחסניות שכנות 25,26. סינפסות גומלין נמצאו בין תאי L2 ו L4 הממוקמים באותו שתי מחסניות סמוכות. Downstream, כל תא L2 ותאי L4 השלוש הקשורים אליו להקרין האקסונים שלהם אל יעד משותף, הנוירון TM2 ב הלשד, שם תשומות ממחסניות שכנות הם האמינו להיות משולב לעיבוד מול אל גב התנועה 27. למרות נוירונים L1 לקבל קלט מאותה מחסנית L2S באמצעות שני צמתים הפער וסינפסות, הם אינם מחוברים ישירות מחסניות lamina L4s ומכאן הסמוך. class = &quot;jove_content&quot;&gt; פידבקים Synaptic אקסונים קולטי האור R1-R6 ניתנים רק על ידי נוירונים השייכים מעגלים L2 / L4 אבל לא 1,2 מסלול L1 (1D איור). בעוד קשרים בין בני אותו מחסנית הם סלקטיבי L2 כדי R1 ו- R2 ומן L4 כדי R5, כל קולטני האור R1-R6 לקבל משוב הסינפטי מ L4 של אחד מהם או שניהם מחסניות השכנה. יתר על כן, ישנם קשרים סינפטיים חזקים בבוקר עד R1, R2, R4 ו R5, ותאי גליה הם גם synaptically מחוברים לרשת ועשויים ובכך להשתתף בעיבוד תמונה עצבי 6. לבסוף,-צומת פער אקסונלית, מקשר שכנת R1-R6 ובין R6 ו R7 / R8 קולטני אור ב lamina, לתרום ייצוג מידע אסימטרי ועיבוד בכל מחסנית 14,20,28. הקלטות מתח תאיות מ קולטני אור פרט interneurons החזותי כמעט ללא פגע תסיסנית לספק אות לרעש גבוה ratio נתונים ברזולוציה משנה אלפית השנייה 3,5,7-10,29, אשר הוא הכרחי עבור ביצוע תחושה של חישובים עצביים במהירות בין הנוירונים המחוברים. רמת הדיוק זה בלתי אפשרית על ידי שיטות הדמיה אופטיות נוכחיות, אשר הם רועשים משמעותיים ובדרך כלל לפעול ב 10 - 100 רזולוצית msec. זאת ועוד, מאחר האלקטרודות יש מאוד טיפים קטנים וחדים, השיטה אינה מצטמצמת אך גופי תא, אבל יכולה לספק הקלטות ישירות מבנים עצביים פעילים קטנים; כמו העצים הדנדריטים &#39;LMCs או אקסונים קולטי האור, אשר לא ניתן להגיע על ידי טיפים הרבה יותר גדול של אלקטרודות תיקון- clamp. חשוב לציין כי השיטה היא גם מבני פחות פולשני ניזק מאשר ברוב יישומי תיקון- clamp, וכך משפיעה פחות דגימה המילייה ומידע התאית &#39;למדו התאים. לפיכך, טכניקות microelectrode חד קונבנציונליות תרמו, ולשמור על תורמים, תגליות בסיסיות ותובנה מקוריות לתוך אינפור עצביעיבוד mation על ציר הזמן המתאים; שיפור הבנת מכניסטית שלנו ראיית 3-10. מאמר זה מסביר כיצד בהקלטות תאיות vivo מ תסיסנית R1-R6 קולטני אור ואת LMCs מבוצעים במעבדת Juusola. פרוטוקול זה יתאר כיצד לבנות אסדת אלקטרופיזיולוגיה מתאימה, להכין לטוס, ולבצע את ההקלטות. כמה נתוני נציג מוצגים, וכמה בעיות נפוצות ופתרונות אפשריים נדונות שעשויים להיות נתקלו בעת השימוש בשיטה זו.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ זום סטריאו להכנת הכנת הזבובים</td> עיניות <td>אולימפוס</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H/22</td><td>מסוגל להגדלה של ~150X עם מרחק עבודה ארוך; מעמד לשולחן פלדה כבד בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ במערך התוך תאי</td><td>&middot; &nbsp; אולימפוס</td><td>אולימפוס SZX7; עיניות: WHN30x-H/22</td><td>30X יש צורך בעיניות כדי לראות היטב את השתקפויות קצה האלקטרודה בעת העברתה דרך חור הקרנית הקטן לתוך העין</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניקון</td><td>Nikon SMZ645; עיניות: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן נגד רעידות</td><td>Melles Griot</td><td>עם חורי M6 מטריים על לוח</td> <td>הלחםלאסדות המותאמות אישית שלנו יש חור גדול שנקדח דרך לוח הלחם העבה שמכניס את מוט פלטפורמת הכנת הזבובים (מכיל גוף קירור נחושת עם אלקטרוניקה) מתחת</td></tr> למיקרומניפולטורים <tr><td>של ניופורט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>במערכים התוך-תאיים שלנו, מערכות מיקרו-מניפולטור שונות משמשות להנעת אלקטרודות הקלטת ה-shap לתוך עין הזבוב. כל המניפולטורים הרשומים מספקים בהצלחה הקלטות יציבות לאורך זמן מקולטני האור של דרוזופילה ו-LMCs.</td></tr><tr><td>ציר האקסלי ברטרם</td><td>האקסלי xyz עם שליטה</td><td></td><td></td>ידנית עדינה</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex ציר</td><td></td><td></td>משולש</tr><tr><td>M&auml; rzh&auml; משתמש</td><td>M&auml; rzh&auml; משתמש DC-3K עם צעד פייזו נוסף בציר x ובקר</td><td></td><td></td>MS 314</tr><tr><td>מעמדים מגנטיים</td><td>כל בסיס מגנטי עם מתג הפעלה/כיבוי יעשה</td><td></td><td>למשלample, לניהול כבלים בתוך כלוב פאראדיי</td></tr><tr><td>מחזיקי אלקטרודות</td><td>מכשירי הרווארד</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>קוטר 0.3 - 0.5 מ"מ; צריך להיות כלוריד עבור מחזיקי האלקטרודות</td></tr><tr><td>מקור אור סיבים אופטיים</td><td>רבים שונים, כולל</td> חבילות סיבים אופטיים אולימפוס <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>טכנולוגיית</td><td></td> UltraFine <td>כדי לספק את גירוי אור ה-LED למערכת הזרוע של קרדן. אנו משתמשים במדריכי אור נוזליים וקוורץ (נעים בין UV ל-IR)</td></tr> <tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td>P80-50P 50 מ"ל Cent. צינור PP., חבילה של 100 יחידות</td><td>חותכים את התחתית החרוטית מצינור צנטריפוגה מפלסטיק 50 מ"ל ומדביקים עליו קצה פיפטה של 1 מ"ל.</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישה דיגיטלית</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר מיקרואלקטרודה זרם/מתח-מהדק אלקטרודה יחיד</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>ביצועים יוצאי דופן!</td></tr><tr>סטנדרט <td>ראשי</td><td>(+/- 150 nA)</td><td>עבור npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>מקורות אור LED ודרייברים</td><td>OptoLED דו-ערוצי (Cairn Research Ltd., בריטניה)</td><td></td><td>רבות ממערכות התמריצים שלנו נבנות בבית&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנה לרכישה וניתוח בעיצוב עצמי ובנייה</td><td></td><td></td>עצמית חברות רבות לבחירה מבין <td></td> Biosyst; מערכת מבוססת Matlab כתובה בהתאמה אישית לעבודה ניסויית ותיאורטית במעבדת Juusola</tr><tr><td>מחשב אישי או Mac</td><td></td><td></td><td>לוודא ש-PC או Mac תואמים למערכת איסוף נתונים ותוכנה</td></tr> מערכת <tr><td></td> זרוע קרדן&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>עיצוב עצמי ובנוי</td><td></td><td>מתן מיקום מדויק x,y,z של גירוי האור</td></tr><tr><td>מערכת בקרת טמפרטורה פלטייר&nbsp;</td><td>כלוב</td> פאראדיי בעיצוב עצמי ובנוי <td></td><td></td></tr> עצמי <tr><td></td><td></td><td>מיגון רעש אלקטרומגנטי</td>נימי זכוכית בורוסיליקט חוטים קוטר חיצוני: 1 מ"מ קוטר פנימי: 0.5 - 0.7 מ"מ נימי זכוכית קוורץ חוטים קוטר חיצוני: 1 מ"מ קוטר פנימי: 0.5 -<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.7 מ"מ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מושך פיפטה</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>דגם P-2000 לייזר בוער/חום מיקרופיפטה חולץ</td><td>עבור אלקטרודות ייחוס בורוסיליקט, השתמש בתוכנית המוגדרת מראש #11 (אלקטרודות תיקון): חום = 350; נימה = 4; מהירות 36; עיכוב = 200).1.2.1). עבור אלקטרודות הקלטת בורוסיליקט, השתמש בתוכנית המוגדרת מראש #12 (זה בדרך כלל מושך חדים קונבנציונליים טובים &nbsp; להקלטות קולטני אור): חום = 355; נימה = 4; מהירות 50; עיכוב = 225; משיכה = 150. עבור הקלטות LMC, הדורשות אלקטרודות עם קצוות עדינים יותר, יש להתאים ערכים אלה. למשיכת נימי קוורץ, מדריך P-2000 מציע תוכניות למיקרו-אלקטרודות עדינות. תוכניות אלה" פרמטרים מוגדרים מראש משמשים כנקודות התחלה שימושיות לשינויים שיטתיים ליצירת אלקטרודות עם הצלחת חדירה טובה ורעש הקלטה נמוך.</td></tr><tr><td>תמיסת רינגר חוץ-תאית לאלקטרודת הייחוס</td><td>כימיקלים מבית Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, סוכרוז</td><td>ראה את המתכון בסעיף הפרוטוקול</td></tr><tr><td>3 M תמיסת KCl למילוי המיקרואלקטרודה המקליטה החוטים</td><td>מלחים מבית Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי נפט</td><td>וסלין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סכיני</td><td></td><td></td><td></td>גילוח ללא נירוסטה</tr><tr><td>מחזיק להב / מפסק</td><td>כלי מדע עדינים מאת Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 ס"מ</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>לחלופין, השתמש בחימר דפוס</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools מאת Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (טיפים עדינים במיוחד)</td></tr></tbody></table>

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; in vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

ניתן לרשום במדויק תגובות מתח של קולטני אור חרקים ואינטרנוירונים חזותיים באמצעות מיקרו-אלקטרודות חדות קונבנציונליות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחוקר למדוד תגובות תוך-תאיות באיכות גבוהה לאורך זמן (מדקות עד שעות) מקולטני אור בודדים של דרוזופילה R1-R6 ותאים חד-קוטביים גדולים (LMCs) לגירוי אור. מכיוון שלמערכת ההקלטה יש רעש נמוך, ניתן להשתמש בה כדי לחקור שונות בין תאים בודדים בעין הזבוב, וכיצד התפוקות שלהם משקפות את התכונות הפיזיקליות של סביבת הראייה. אנו מתארים את כל שלבי המפתח בביצוע טכניקה זו. מתוארים השלבים הבסיסיים בבניית מערך אלקטרופיזיולוגיה מתאים להקלטה, כגון תכנון ובחירת ציוד הניסוי. אנו גם מסבירים כיצד להתכונן להקלטה על ידי ביצוע הקלטה מתאימה (חדה) ואלקטרודות ייחוס (בוטות). ניתנים פרטים כיצד לתקן זבוב שלם במחזיק זבובים בהתאמה אישית, להכין חלון קטן בעינו ולהכניס אלקטרודת הקלטה דרך חור זה במינימום נזק. אנו מסבירים כיצד למקם את מרכז שדה הקליטה של התא, להתאים את התא הנחקר לחושך או לאור, ולתעד את תגובות המתח שלו לגירוי אור דינמי. לבסוף, אנו מתארים את הקריטריונים להקלטות נורמליות יציבות, מראים תגובות מתח אופייניות באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור שונים, ומגדירים בקצרה כיצד לכמת את ביצועי האיתות שלהם. היבטים רבים של השיטה מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים תרגול וסבלנות כדי לשלוט בהם. אך לאחר שנלמד ומותאם למטרות הניסוי של החוקר, הוא מעניק נתונים נוירופיזיולוגיים יוצאי דופן in vivo.

שיטת הרישום בה microelectrode חדה, כפי שהותאם כאן העין תסיסנית, שניתן להשתמש בם כדי לכמת דגימת מידע עצבית באופן מהימן ועיבוד בתאי רשתית lamina, ותקשורת ביניהם 4,5,7,8,10,33. באמצעות אותו ללמוד קידוד במניות wild-type שונים, מוטציות או זנים מהונדסים גנטית זבוב, השיטה הוכיחה את תמורתו; לא רק בכימות ההשפעות של מוטציה, טמפרטורה, דיאטה או ביטוי שנבחר 3,4,6,9,10,14,30,34, אלא גם חושפים סיבות מכניסטי התנהגויות ויזואלית שונות 14,34. השיטה היא גם ישים בקלות הכנות חרקים אחרות 35,36, העצמת מחקרי חזון neuroethological. הבא אנחנו להציג כמה דוגמאות של היישומים המוצלחים שלה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> מתח איור 7.<html> תגובות של זבוב פרותי R1-R6 קולטי אור כדי פולסו אור ב -20 ו -25 מעלות צלסיוס בגלל חדירות microelectrode חד הם לעתים קרובות מאוד יציבות, אפשר להקליט תגובות מתח של קולטי האור R1-R6 אותה לגירוי אור שניתן בטמפרטורות סביבה שונות התחממות או קירור לטוס. בשינה להגדיר הקופצים שלנו, בעל הזבוב מושם על מערכת טמפרטורת שליטה קרובה לולאת פלטייה אלמנט מבוססת. זה מאפשר לנו לשנות את טמפרטורת ראשו של הזבוב בתוך שניות. טמפרטורה גבוהה מאיצה את תגובות מתח ובאורח אופיינית מורידה את מתח המנוחה של קולטני אור R1-R6 (כפי שצוינה על ידי חצים אדומים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לימוד השפעת הטמפרטורה על פלט קולטי אור יפ-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; עם מערכת הקלטה מעוצבת היטב מבודד רטט, השיטה יכולה לשמש למדידת השפעת הטמפרטורה על התפוקה העצבית של תאים בודדים על ידי התחממות או קירור לטוס. הדוגמא שניתנה תערוכות תגובות מתח דופק 10 msec ארוך בהיר, שנרשמו קולטי אור R1-R6 אותו ב 20 ו 25 מעלות צלסיוס (איור 7). כפי לכמת לפני 4,9, התחממות מורידה מתח מנוחה של קולטי אור בחושך, ומאיצה תגובות המתח שלה. <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> איור 8. ביצועי מאותת על זבוב הפירות R1-R6 קולטי האור משפר עם עוצמת אור (א) פלט קולטי האור לעמעם (להלן) ובהיר. (לעיל; 10,000 פעמים אור בהיר) חזר עוצמת האור נטורליסטי סדרות עתיות שרשמה אותו microelectrodeבאותו תא ב 20 o C. תגובות ל הגירוי הבהיר הן גדולות יותר, משום שהם לשלב דגימות יותר, תגובות יסודיות (בליטות) כדי פוטונים בודדים 4,5,7,8. (ב) 20 תגובות מתח חד שני ארוכות רצופות מורכבות. תגובות בודדות (אפור בהיר) נלקחו לאחר המגמות אדפטיבית (חץ א) נסוג (תיבה מקווקות א). אמצעי התגובה הדומה (האותות) הם העקבות הכהות. ההבדל בין האות לבין התגובות הבודדות הוא הרעש. (ג) התאים &#39;ביצועי איתות היה לכמת ידי ההקלטות &quot;יחסי אות לרעש (SNR) באמצעות השיטות הסטנדרטיות 4,5,7,8. פלט קולטי אור יש כ 64 הרץ טווח רחב יותר של איתות אמינה על הגירוי הבהיר ( &#39;≥1 המואר, עד 84 הרץ מאשר בבית העמום (SNR SNR)&#39; דים ≥1, עד 20 הרץ), עם היםignal לרעש יחס שיפור משמעותי; מ SNR דים MAX = 87 עד SNR מוארת MAX = 1,868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לימוד הסתגלות וקידוד עצבי על ידי חוזרים גירוי Noninvasiveness של השיטה, גרימת ניזק מועט יחסית במבני רשתית lamina, הופך אותו לאידיאלי ללימוד ביצועי האיתות של תאים בודדים לגירויים באור שונים במצב הפיזיולוגי הטבעי ליד שלהם in vivo. איור 8 מציג תגובות מתח של R1- R6 קולטי אור לגירוי סדרת זמן עוצמת אור נטורליסטי חזר עמום ובהיר ב 20 מעלות צלסיוס, ואילו איור 9 </strong&gt; תערוכות תגובות של אחר קולטי אור R1-R6 ו LMC לגירוי נטורליסטי שונה ב 25 o C. ההקלטות טרום postsynaptic בוצעו בנפרד משני זבובים שונים כי הקלטות תאיות סימולטני על ידי שני microelectrodes חד באותה הזבוב, אחד ברשתית והשני lamina, קשות מכדי להיות בת קיימא 30. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> תגובות מתח איור 9. של זבוב הפירות R1-R6 קולטי האור ואת LMC כדי נאטורליסטי חוזרות גירוי ב 25 מעלות צלסיוס (א) R1-R6 (אפור) LMC (שחור) פלטי שרשמה microelectrodes שונה זבובים שונים. (ב) 20 מראש רצופים אור-התאמה מלאה (למעלה) ו postsynaptic (להלן) תגובות לאותו דפוס גירוי נטורליסטי עם תגובות בודדות, שמוצג אפור בהירד אמצעי התגובה המתאים (אותות) כעקבות הכהות. ההבדל בין האות לבין התגובות הבודדות הוא הרעש. (ג) התאים &#39;ביצועי איתות היה לכמת ידי ההקלטות &quot;יחסי אות לרעש (SNR). פלט LMC יש בערך 10 הרץ טווח רחב יותר של איתות אמינה (SNR &#39;≥1 LMC, עד 104 הרץ) מאשר תפוקת R1-R6 (SNR&#39; R ≥1, עד 94 הרץ). יחסי אות לרעש שניהם גבוהים (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), וכפי רעש ההקלטה היה נמוך, ההבדלים ביניהם משקפים הבדלי קידוד בזמן בין התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> לאחר הופעת הגירוי, ההקלטות טיפוסיותly מהר להראות התאמת מגמות להתפוגג בעיקר בתוך 5-6 שניות. מכאן ואילך, התאים לייצר תגובות ומתואמות היטב לכל מצגת גירוי 1 שניות ארוכות (כל תיבה מקווקות סוגרת 20 של אלה). את הדירות מהתגובות הופכות להיות ברורות כאשר אלה מורכבים (איור 8B והאיור 9B). תגובות בודדות הן העקבים אפורים הדקים, אינו אומר העקבות הכהות העבות. התגובה הממוצעת נלקחת כמו האות העצבי, ואילו הרעש העצבי ההבדל בין הממוצע וכל 4,5,9,37,38 בתגובת פרט. אות לרעש בהתאמה יחסים בתחום תדר (האיור 8C ואיור 9 ג) התקבלו על ידי פורייה- הפיכת נתחי נתוני אותות ורעש לתוך ספקטרום כוח, חלוקת ספקטרום הספק האות הממוצעת עם ספקטרום הספק רעש הממוצע המתאים 4, 5,9,37,38. אופייני, אות לרעש המרבי היחסים of התפוקות העצביות רשמו לגירוי נטורליסטי הן גבוהות (100 - 1000), וכן בהכנות הכי היציבות עם רעש הקלטה נמוך מאוד יכול להגיע לערכי &gt;&gt; 1,000 (למשל, איור 8C.). שימו לב גם ההתחממות שמתרחב התאים &#39;רוחב הפס של אמין איתות 4 (SNR&#39; ברייט ≥ 1); למשל, את ההבדל היחסי בין שתי-R6s R1 איורים 8 ו -9, בהתאמה, הוא 10 הרץ (84 ב ג &#39;20 o ו -94 הרץ 25 מעלות צלסיוס). אפשר עוד מעריכים בכל שיעור התא של העברת מידע בין אות לרעש שלה יחס באמצעות המשוואה שאנון 32, או על ידי חישוב ההפרש בין שיעורי אנטרופיה אנטרופיה רעש &#39;התגובות דרך ושיטת הניפוח משולשת 39. פרטים נוספים על ניתוחים תיאורטיים מידע, והשימוש בהם והגבלותs במיוחד בשיטה זו ניתנות בפרסומים הקודמים 7,8,39. <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> תגובות איור 10. מתח של רוצח Fly R1-R6 קולטי אור ואת LMC חוזר נאטורליסטי גירוי ב 19 מעלות צלסיוס (א) R1-R6 (אפור) LMC (שחורה) פלטים שרשמו אותו microelectrode מאותו הזבוב; postsynaptically הראשון ובהמשך Presynaptically, כמו האלקטרודה כפי שהוצעה בעיניים. (ב) 20 מראש רצוף (לעיל) postsynaptic (להלן) תגובות (עקבות אפורות בהירות) לאותו דפוס גירוי נטורליסטי נתפסו לאחר הסתגלות ראשונית (תיבה מקווקות א). אמצעיהם הם האותות (העקבות הכהות על גבי), ואילו ההבדלים שלהם אל התגובות הבודדות לתת הרעש. (ג) סינייה המקבילl לרעש יחסי (SNR) חושבו איורים 8C ו 9 ג. פלט LMC יש כ למגוון רחב יותר של 100 הרץ של איתות אמין (SNR &#39;LMC MAX ≥1, עד 234 הרץ) מאשר התפוקה R1-R6 (SNR&#39; R MAX ≥1, עד 134 הרץ). יחסי אות לרעש שניהם גבוהים (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), וכפי אותה microelectrode שמש הקלטות, ההבדלים ביניהם משקפים הבדלים של ממש פלטים העצביים טרום postsynaptic. תוצאות אלו מרמזות כי מערכת ההקלטה הייתה רעש נמוך, והשפעתה על הניתוחים הייתה שולית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מחקרי חזון Neuroethological </p&gt; השיטה יכולה לשמש גם כדי להקליט תגובות מתח טרום postsynaptic מעיני התרכובת של מינים שונים של חרקים 7,8,35,36 (איור 10), המתיר מחקרי neuroethological השוואתיים של עיבוד מידע חזותי. עבור מערכת ההקלטה הציגה, העיבוד הנדרש היחיד הוא בעלי הכנה חדשים, כל אחד עם פתיחה כראוי בגודל המין למד. הקלטות למופת אלה הן מן של רוצח הנקבה לעוף (attenuata Coenosia). הם מראים תגובות מתח תאיות של קולטי אור R1-R6 ו LMC לגירוי אור חוזרות זהה, כפי שמוצג על עמיתיהם תסיסנית באיור 9, אבל בגיל 19 o C. במקרה זה, הוא לפני ואחרי נתוני postsynaptic נרשמו מאותו הזבוב; בזו אחר זו, עם אותה אלקטרודה הקלטה (מלא 3 KCl M) הראשון לקידום דרך lamina לרוחב לפני להיכנסing הרשתית חזיתית. לשם השוואה לנתונים תסיסנית במהירות של 25 מעלות צלסיוס, נתוני Coenosia - אפילו בטמפרטורה הקרירה - תערוכות תגובות עם דינמיקה מהר; הרחבת סל האיתות אמינה (יחס אות לרעש &gt;&gt; 1) על פני טווח תדר רחב יותר. כזה עיבודים תפקודיים קידוד עצבי של גירויים נטורליסטי עולים בקנה אחד עם אורח חיים טורפים של Coenosia 36, אשר דורשים מידע spatiotemporal דיוק גבוה כדי להשיג התנהגויות ציד אוויריות מהר.

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד תגובות חשמליות תוך תאיות של קולטני אור דרוזופילה ואינטרנוירונים חזותיים לגירוי אור מבוקרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקידוד העצבי, כגון כיצד גירוי אור יקודד אותו לאחת מתגובותיו, או כיצד המידע החזותי וקולטני האור והאינטרנוירונים שלו מפיקים מגירוי אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הקלטות ארוכות טווח ואיכותיות מהמחקר עם נזק מועט לסביבה התוך-תאית ודגימת מידע.תכונת ההדגמה שהדבר עשוי להשפיע היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד לבצע את השלבים השונים שלה בצורה נכונה מבלי לראות אותם. משוך מיקרואלקטרודה ייחוס מבורוסיליקט נימה, או מצינורות זכוכית קוורץ באמצעות מושך פיפטה רגיל. נסה להשיג הפחתה קצרה והדרגתית.ההגדרות המדויקות משתנות בין מכשירים. גודל הנקבוביות בקצה אינו קריטי מכיוון שהוא יישבר לניסויים. לאחר מכן משוך אלקטרודת הקלטה מאותו צינור זכוכית ונסה להשיג התחדדות הדרגתית עדינה באורך של 10 עד 15 מילימטרים.במיקרוסקופ אור, הרכיבו את האלקטרודה על צד זכוכית עם דבק מרובה והשתמשו במטרת אוויר פי 40 כדי לבדוק את קצהו. אלקטרודה טובה מתחדדת בצורה חלקה לקצה קטן בלתי נראה, שסביבו ניתן לראות דפוסי הפרעה מקבילים כהים ובהירים יותר. רגע לפני הניסוי, מלאו מחדש את אלקטרודת הייחוס בצלצולי זבובים, באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר המחובר למסנן חלקיקים, עם קצה פלסטיק עדין.לניסויים בקולטני אור, טען את אלקטרודת ההקלטה עם 3 אשלגן כלורי מולארי עד שנוצרת טיפה בקצה הגדול שלה. זה ימזער את הרעש מצומת הנוזל במהלך ההקלטה. כדי לעבוד עם LMCs היסטמינרגיים, מלאו את אלקטרודות ההקלטה ב-3 מולרי אשלגן אצטט, 0.5 מילי-מולרי אשלגן כלורי כדי למזער את ההשפעה על סוללת הכלוריד של התא.התחל בהעמסת בקבוקון זבוב טרי עם זבובים בני חמישה עד 10 ימים. זבובים צעירים יותר שבירים יותר, אך ניתן לתעד אותם. בחר את הזבוב הראשון לאלקטרופיזיולוגיה.הכי קל לעבוד עם נקבות גדולות. כאשר הם נמצאים בצינור התפיסה, נצלו את הנטייה הטבועה שלהם לטפס כלפי מעלה לתוך קצה הפיפטה ולכסות את הקצה הקטן יותר. לאחר מכן, חבר מזרק של 100 מיליליטר עם צינור פלסטיק גמיש לקצה הפיפטה, המוגדל רק כדי לאפשר לדרוזופילה לעבור ולחבר את הקצה השני לקצה פיפטה גדול המחובר למחזיק הזבובים.לאחר מכן סחטו נפח קטן של אוויר מהמזרק כדי להוציא את הזבוב לתוך מחזיק הזבובים. הביטו דרך המיקרוסקופ הסטריאו והזרימו בעדינות יותר אוויר עד שראש הזבוב בולט מהקצה החרוטי של מחזיק הזבוב. ודא שהזבוב לכוד היטב על ידי בית החזה שלו.ואז אבטח את הזבוב בשעוות דבורים. השתמש בטמפרטורה הנמוכה ביותר של תנור השעווה כדי להמיס בצורה נקייה את השעווה, שתיראה שקופה. אם הוא חם מדי, השעווה תישרף.קבעו את ראש הזבוב על ידי מריחת מעט שעוות דבורים על הפרובוסקיס ועל זווית העין הימנית, תוך הימנעות מהקרנית. קבע את שתי הנקודות הללו למחזיק הזבובים. סיים שלב זה במהירות כדי למנוע שריפת הזבוב.לאחר מכן, הרכיבו משקפי מגן וייצרו מיקרו-סכין. מהדקים סכין גילוח שאינו מנירוסטה עם שני מחזיקי להבי אחיזה שטוחים וסדקים רצועה קטנה בקצה החד שלו. באופן אידיאלי, צור קצה חד כתער הדומה לצריח.כעת, בזהירות ועם תשומת לב רבה לפרטים, השתמשו במיקרו-סכין כדי לפתוח כמה אומטידיות של העין השמאלית של הזבוב, כמו למשל בארבע עד חמש אומטידיות מהקוטיקולה הגבית ממש מעל קו המשווה של העין. זה יספק את המעבר למיקרואלקטרודת ההקלטה. זה די מאתגר, דורש סכין עשויה היטב, ויש ללמוד אותו בתרגול.לאחר מכן הסר בעדינות את חתיכת הקרנית הקטנה מהפתח, וחשוף את הרשתית שמתחתיה. כעת בעזרת השיער הדק של מוליך ג'לי הנפט, כסה במהירות את החור בגוש זעיר של ג'לי נפט. לג'לי יש יתרון נוסף של הפחתת הקיבול התוך-מוראלי של הפיפטה.הימנע ממריחת העין מכיוון שהדבר מטשטש את האופטיקה. בעת הפעלת המיקרואלקטרודה ampחיים יותר, תמיד להיות מקורקע על ידי נגיעה במשטח המתכת של כלוב פאראדיי או שולחן נגד רעידות כדי למנוע מטענים סטטיים. אבטח את הזבוב המותקן לעמוד פלטפורמת הכנת הזבובים.סובב את מחזיק הזבוב כך שעינו השמאלית של הזבוב פונה ישירות לחוקר. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מניפולטור קטן כדי להכניס את אלקטרודת הייחוס הקהה בעדינות דרך האוקלי של הזבוב לתוך קפסולת הראש. ודא שהזבוב עדיין נראה בריא והזז אותו אנטנות.ההכנה חייבת להיות מעולה כדי להצדיק הקלטה ממנה. כעת הכניסו את המיקרו-אלקטרודת ההקלטה החדה לעין שמאל דרך הפתח המצופה ג'לי. כשהוא נכנס לרקמה, מיקום קצה האלקטרודה צריך להיות ברור על ידי דפוס ההשתקפות שלו.קצה האלקטרודה השברירי חייב להיות מונחה בצורה מושלמת אחרת הוא יישבר, וזה מאתגר מאוד. בהתאם לסוג התא שממנו נרשם, ראש הזבוב צריך להיות מכוון מעט אחרת. כשהאלקטרודות במקומן, הפעל את מגבר המיקרואלקטרודה.לאחר מכן כבה את מקור האור הקר, נתק אותו מהחשמל וחבר אותו להארקה המרכזית כדי למזער רעש חשמלי הנגרם מלולאת הארקה. לאחר מכן, כוונן את מכווני האור של צוואר האווז כך שניתן יהיה להזיז את מערכת זרוע הקרדן בחופשיות סביב הזבוב. לאחר מכן כבה את אורות החדר כדי להכניס את הכנת הזבוב לחושך יחסי.כעת מדוד את ההתנגדות של אלקטרודת ההקלטה בעין. זה חייב להיות בין 100 ל -260 מגה-אוהם. לפעמים הקצה חסום וניתן לנקות אותו באמצעות פונקציות הזמזום הקיבולי ופולס הזרם של המגבר.אם זה לא עוזר, השתמש באלקטרודה חדשה. לאחר מכן, הגדר את המגבר למהדק זרם או גשר ואפס את המתח בין האלקטרודות. לאחר שהזבוב הסתגל לחושך למשך מספר דקות, הכניסו את קצה אלקטרודת ההקלטה לתוך העין בצעדים של 0.1 עד מיקרון אחד באמצעות צעד פייזו או באמצעות סיבוב עדין של כפתור הרזולוציה העדינה.בכל שלב, גרו את העין עם הבזק אור של 1 עד 10 אלפיות השנייה. כל הבזק אור יגרום לירידה קצרה בכרךtage או ב-ERG. כאשר קצה האלקטרודה נכנס ללמינה ונסגר על ה-LMCs, ה-ERG מתהפך.לאחר מכן המשך בביצוע מדידות. בשל הלא-פולשניות, ניתן לחקור את ביצועי האותות של תאים בודדים במצבם הטבעי הקרוב. תגובת המתח על ידי קולטן אור R1-R6 לאור עמום ובהיר נמדדה ב-20 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, קולטן אור R1-R6 הושווה ל-LMC ב-25 מעלות צלזיוס. כל אחד מהם נמדד על זבוב אחר מכיוון שהקלטות תוך-תאיות על ידי שתי מיקרו-אלקטרודות חדות באותו זבוב קשות מכדי להיות קיימות. יכולת החזרה של התגובות הופכת ברורה כאשר הנתונים מונחים על גבי זה.יחסי אות לרעש בתחום התדרים הושגו על ידי ארבע שנים בהפיכת נתחי נתוני האות והרעש לספקטרום הספק, ולאחר מכן חלוקת ספקטרום הספק האות הממוצע בספקטרום הספק הרעש הממוצע המתאים. התוצאה יכולה להיות רגישה מאוד לאותות בתכשירים הטובים ביותר. ניתן להשתמש בטכניקה כדי להקליט עבור מינים רבים.זבובי Coenocia קיבלו את אותו גירוי אור נטורליסטי שחוזר על עצמו ב-19 מעלות צלזיוס. הנתונים נלקחו לפני ופוסט-סינפטי מאותו זבוב על ידי קידום אלקטרודת ההקלטה. הדינמיקה המהירה יותר של התיעוד עולה בקנה אחד עם האופי הטורף של מין זה.לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת הקלטות ארוכות ואיכותיות תמיד אם היא מבוצעת כראוי. תוך כדי ניסיון בהליך זה חשוב להבין, אני מתכוון שזה כמו ללמוד לנגן בפסנתר. ככל שתתרגלו יותר, כך תשיגו תוצאות טובות יותר.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון התערבויות תרופתיות כדי לענות על שאלות נוספות כמו תפקידם של נוירומודולטורים בעיצוב התגובות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביופיזיקה לחקור כיצד לייעל מידע אור, ללכוד ולהעביר, בתוספת התגובות הביוכימיות הקאוסטיות במנגנון התמרת הצילום ובמדעים הביולוגיים הבאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את הדרוזופילה לניסויים תוך-תאיים וכיצד להעיר תגובות נוירולוגיות מקולטני האור והאינטרנוירונים שלה.

electrophysiological-method-for-recording-intracellular-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לרישום אלקטרופיזיולוגי של פעילות קולטני אור בעין של דרוזופילה משותקת, המאפשר מדידה מדויקת של שינויי מתח בתגובה לגירויי אור.

רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות מתח של פוטורצפטורים ברשתית דרוזופילה לגירויי אור

הסרטון מדגים רישום פעילות חשמלית בנוירונים קולטי האור של אומטידיום של דרוזופילה על ידי קביעת תצורה של תא שלם. הוא מדגיש את ההפעלה של ערוצים פוטנציאליים של קולטן חולף על ידי פולסי אור, וכתוצאה מכך בליטות קוונטיות מדידות.

הקלטות מהדק מתח של תא שלם מפוטורצפטורים של דרוזופילה

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

פיתחנו שתי שיטות ללימוד ההשפעות של רמזים חזותיים על התנהגות בהיעדר רמזים משושי כימיים. שיטה אחת כרוכה התגובות בווידיאו של סרטנים על קירות רעיוני באקווריום, והשני בוחן את ההשפעות של תשומות חזותיים הניתנים על ידי סרטנים חי מאחורי מחיצה שקופה.

הקלטה תגובות התנהגותיות כדי השתקפות של סרטן הנהרות

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

ציפוי האלקטרודה שונה משפיע על ביצועי הקלטה עצביים דרך שינויים במאפיינים אלקטרוכימיים, כימיים ומכאניים. השוואה של אלקטרודות במבחנה היא פשוטה יחסית, עם זאת השוואה של תגובת in vivo היא מסובכת בדרך כלל על ידי שינויים במרחק אלקטרודה / נוירון ובין בעלי החיים. מאמר זה מספק שיטה חזקה כדי להשוות אלקטרודות הקלטה עצביות.

שיטה לאלקטרוכימי שיטתי ואלקטרו הערכה של אלקטרודות הקלטה עצביות

למדו שיטת אלקטרודה חדה להקלטת תגובות חשמליות מתוך-תאיות מקולטני אור ונוירונים ביניים ב-Drosophila. טכניקה זו מאפשרת הקלטות איכותיות לטווח ארוך עם נזק מינימלי לתאים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של

גלה סרטונים נוספים