שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של תסיסנית קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים In vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד תגובות חשמליות תוך תאיות של קולטני אור דרוזופילה ואינטרנוירונים חזותיים לגירוי אור מבוקרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקידוד העצבי, כגון כיצד גירוי אור יקודד אותו לאחת מתגובותיו, או כיצד המידע החזותי וקולטני האור והאינטרנוירונים שלו מפיקים מגירוי אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הקלטות ארוכות טווח ואיכותיות מהמחקר עם נזק מועט לסביבה התוך-תאית ודגימת מידע.

תכונת ההדגמה שהדבר עשוי להשפיע היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד לבצע את השלבים השונים שלה בצורה נכונה מבלי לראות אותם. משוך מיקרואלקטרודה ייחוס מבורוסיליקט נימה, או מצינורות זכוכית קוורץ באמצעות מושך פיפטה רגיל. נסה להשיג הפחתה קצרה והדרגתית.

ההגדרות המדויקות משתנות בין מכשירים. גודל הנקבוביות בקצה אינו קריטי מכיוון שהוא יישבר לניסויים. לאחר מכן משוך אלקטרודת הקלטה מאותו צינור זכוכית ונסה להשיג התחדדות הדרגתית עדינה באורך של 10 עד 15 מילימטרים.

במיקרוסקופ אור, הרכיבו את האלקטרודה על צד זכוכית עם דבק מרובה והשתמשו במטרת אוויר פי 40 כדי לבדוק את קצהו. אלקטרודה טובה מתחדדת בצורה חלקה לקצה קטן בלתי נראה, שסביבו ניתן לראות דפוסי הפרעה מקבילים כהים ובהירים יותר. רגע לפני הניסוי, מלאו מחדש את אלקטרודת הייחוס בצלצולי זבובים, באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר המחובר למסנן חלקיקים, עם קצה פלסטיק עדין.

לניסויים בקולטני אור, טען את אלקטרודת ההקלטה עם 3 אשלגן כלורי מולארי עד שנוצרת טיפה בקצה הגדול שלה. זה ימזער את הרעש מצומת הנוזל במהלך ההקלטה. כדי לעבוד עם LMCs היסטמינרגיים, מלאו את אלקטרודות ההקלטה ב-3 מולרי אשלגן אצטט, 0.5 מילי-מולרי אשלגן כלורי כדי למזער את ההשפעה על סוללת הכלוריד של התא.

התחל בהעמסת בקבוקון זבוב טרי עם זבובים בני חמישה עד 10 ימים. זבובים צעירים יותר שבירים יותר, אך ניתן לתעד אותם. בחר את הזבוב הראשון לאלקטרופיזיולוגיה.

הכי קל לעבוד עם נקבות גדולות. כאשר הם נמצאים בצינור התפיסה, נצלו את הנטייה הטבועה שלהם לטפס כלפי מעלה לתוך קצה הפיפטה ולכסות את הקצה הקטן יותר. לאחר מכן, חבר מזרק של 100 מיליליטר עם צינור פלסטיק גמיש לקצה הפיפטה, המוגדל רק כדי לאפשר לדרוזופילה לעבור ולחבר את הקצה השני לקצה פיפטה גדול המחובר למחזיק הזבובים.

לאחר מכן סחטו נפח קטן של אוויר מהמזרק כדי להוציא את הזבוב לתוך מחזיק הזבובים. הביטו דרך המיקרוסקופ הסטריאו והזרימו בעדינות יותר אוויר עד שראש הזבוב בולט מהקצה החרוטי של מחזיק הזבוב. ודא שהזבוב לכוד היטב על ידי בית החזה שלו.

ואז אבטח את הזבוב בשעוות דבורים. השתמש בטמפרטורה הנמוכה ביותר של תנור השעווה כדי להמיס בצורה נקייה את השעווה, שתיראה שקופה. אם הוא חם מדי, השעווה תישרף.

קבעו את ראש הזבוב על ידי מריחת מעט שעוות דבורים על הפרובוסקיס ועל זווית העין הימנית, תוך הימנעות מהקרנית. קבע את שתי הנקודות הללו למחזיק הזבובים. סיים שלב זה במהירות כדי למנוע שריפת הזבוב.

לאחר מכן, הרכיבו משקפי מגן וייצרו מיקרו-סכין. מהדקים סכין גילוח שאינו מנירוסטה עם שני מחזיקי להבי אחיזה שטוחים וסדקים רצועה קטנה בקצה החד שלו. באופן אידיאלי, צור קצה חד כתער הדומה לצריח.

כעת, בזהירות ועם תשומת לב רבה לפרטים, השתמשו במיקרו-סכין כדי לפתוח כמה אומטידיות של העין השמאלית של הזבוב, כמו למשל בארבע עד חמש אומטידיות מהקוטיקולה הגבית ממש מעל קו המשווה של העין. זה יספק את המעבר למיקרואלקטרודת ההקלטה. זה די מאתגר, דורש סכין עשויה היטב, ויש ללמוד אותו בתרגול.

לאחר מכן הסר בעדינות את חתיכת הקרנית הקטנה מהפתח, וחשוף את הרשתית שמתחתיה. כעת בעזרת השיער הדק של מוליך ג'לי הנפט, כסה במהירות את החור בגוש זעיר של ג'לי נפט. לג'לי יש יתרון נוסף של הפחתת הקיבול התוך-מוראלי של הפיפטה.

הימנע ממריחת העין מכיוון שהדבר מטשטש את האופטיקה. בעת הפעלת המיקרואלקטרודה ampחיים יותר, תמיד להיות מקורקע על ידי נגיעה במשטח המתכת של כלוב פאראדיי או שולחן נגד רעידות כדי למנוע מטענים סטטיים. אבטח את הזבוב המותקן לעמוד פלטפורמת הכנת הזבובים.

סובב את מחזיק הזבוב כך שעינו השמאלית של הזבוב פונה ישירות לחוקר. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מניפולטור קטן כדי להכניס את אלקטרודת הייחוס הקהה בעדינות דרך האוקלי של הזבוב לתוך קפסולת הראש. ודא שהזבוב עדיין נראה בריא והזז אותו אנטנות.

ההכנה חייבת להיות מעולה כדי להצדיק הקלטה ממנה. כעת הכניסו את המיקרו-אלקטרודת ההקלטה החדה לעין שמאל דרך הפתח המצופה ג'לי. כשהוא נכנס לרקמה, מיקום קצה האלקטרודה צריך להיות ברור על ידי דפוס ההשתקפות שלו.

קצה האלקטרודה השברירי חייב להיות מונחה בצורה מושלמת אחרת הוא יישבר, וזה מאתגר מאוד. בהתאם לסוג התא שממנו נרשם, ראש הזבוב צריך להיות מכוון מעט אחרת. כשהאלקטרודות במקומן, הפעל את מגבר המיקרואלקטרודה.

לאחר מכן כבה את מקור האור הקר, נתק אותו מהחשמל וחבר אותו להארקה המרכזית כדי למזער רעש חשמלי הנגרם מלולאת הארקה. לאחר מכן, כוונן את מכווני האור של צוואר האווז כך שניתן יהיה להזיז את מערכת זרוע הקרדן בחופשיות סביב הזבוב. לאחר מכן כבה את אורות החדר כדי להכניס את הכנת הזבוב לחושך יחסי.

כעת מדוד את ההתנגדות של אלקטרודת ההקלטה בעין. זה חייב להיות בין 100 ל -260 מגה-אוהם. לפעמים הקצה חסום וניתן לנקות אותו באמצעות פונקציות הזמזום הקיבולי ופולס הזרם של המגבר.

אם זה לא עוזר, השתמש באלקטרודה חדשה. לאחר מכן, הגדר את המגבר למהדק זרם או גשר ואפס את המתח בין האלקטרודות. לאחר שהזבוב הסתגל לחושך למשך מספר דקות, הכניסו את קצה אלקטרודת ההקלטה לתוך העין בצעדים של 0.1 עד מיקרון אחד באמצעות צעד פייזו או באמצעות סיבוב עדין של כפתור הרזולוציה העדינה.

בכל שלב, גרו את העין עם הבזק אור של 1 עד 10 אלפיות השנייה. כל הבזק אור יגרום לירידה קצרה בכרךtage או ב-ERG. כאשר קצה האלקטרודה נכנס ללמינה ונסגר על ה-LMCs, ה-ERG מתהפך.

לאחר מכן המשך בביצוע מדידות. בשל הלא-פולשניות, ניתן לחקור את ביצועי האותות של תאים בודדים במצבם הטבעי הקרוב. תגובת המתח על ידי קולטן אור R1-R6 לאור עמום ובהיר נמדדה ב-20 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, קולטן אור R1-R6 הושווה ל-LMC ב-25 מעלות צלזיוס. כל אחד מהם נמדד על זבוב אחר מכיוון שהקלטות תוך-תאיות על ידי שתי מיקרו-אלקטרודות חדות באותו זבוב קשות מכדי להיות קיימות. יכולת החזרה של התגובות הופכת ברורה כאשר הנתונים מונחים על גבי זה.

יחסי אות לרעש בתחום התדרים הושגו על ידי ארבע שנים בהפיכת נתחי נתוני האות והרעש לספקטרום הספק, ולאחר מכן חלוקת ספקטרום הספק האות הממוצע בספקטרום הספק הרעש הממוצע המתאים. התוצאה יכולה להיות רגישה מאוד לאותות בתכשירים הטובים ביותר. ניתן להשתמש בטכניקה כדי להקליט עבור מינים רבים.

זבובי Coenocia קיבלו את אותו גירוי אור נטורליסטי שחוזר על עצמו ב-19 מעלות צלזיוס. הנתונים נלקחו לפני ופוסט-סינפטי מאותו זבוב על ידי קידום אלקטרודת ההקלטה. הדינמיקה המהירה יותר של התיעוד עולה בקנה אחד עם האופי הטורף של מין זה.

לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת הקלטות ארוכות ואיכותיות תמיד אם היא מבוצעת כראוי. תוך כדי ניסיון בהליך זה חשוב להבין, אני מתכוון שזה כמו ללמוד לנגן בפסנתר. ככל שתתרגלו יותר, כך תשיגו תוצאות טובות יותר.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון התערבויות תרופתיות כדי לענות על שאלות נוספות כמו תפקידם של נוירומודולטורים בעיצוב התגובות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביופיזיקה לחקור כיצד לייעל מידע אור, ללכוד ולהעביר, בתוספת התגובות הביוכימיות הקאוסטיות במנגנון התמרת הצילום ובמדעים הביולוגיים הבאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את הדרוזופילה לניסויים תוך-תאיים וכיצד להעיר תגובות נוירולוגיות מקולטני האור והאינטרנוירונים שלה.