שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של תסיסנית קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים In vivo
19 ביוני 2016
מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד תגובות חשמליות תוך תאיות של קולטני אור דרוזופילה ואינטרנוירונים חזותיים לגירוי אור מבוקרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקידוד העצבי, כגון כיצד גירוי אור יקודד אותו לאחת מתגובותיו, או כיצד המידע החזותי וקולטני האור והאינטרנוירונים שלו מפיקים מגירוי אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הקלטות ארוכות טווח ואיכותיות מהמחקר עם נזק מועט לסביבה התוך-תאית ודגימת מידע.
תכונת ההדגמה שהדבר עשוי להשפיע היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד לבצע את השלבים השונים שלה בצורה נכונה מבלי לראות אותם. משוך מיקרואלקטרודה ייחוס מבורוסיליקט נימה, או מצינורות זכוכית קוורץ באמצעות מושך פיפטה רגיל. נסה להשיג הפחתה קצרה והדרגתית.
ההגדרות המדויקות משתנות בין מכשירים. גודל הנקבוביות בקצה אינו קריטי מכיוון שהוא יישבר לניסויים. לאחר מכן משוך אלקטרודת הקלטה מאותו צינור זכוכית ונסה להשיג התחדדות הדרגתית עדינה באורך של 10 עד 15 מילימטרים.
במיקרוסקופ אור, הרכיבו את האלקטרודה על צד זכוכית עם דבק מרובה והשתמשו במטרת אוויר פי 40 כדי לבדוק את קצהו. אלקטרודה טובה מתחדדת בצורה חלקה לקצה קטן בלתי נראה, שסביבו ניתן לראות דפוסי הפרעה מקבילים כהים ובהירים יותר. רגע לפני הניסוי, מלאו מחדש את אלקטרודת הייחוס בצלצולי זבובים, באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר המחובר למסנן חלקיקים, עם קצה פלסטיק עדין.
לניסויים בקולטני אור, טען את אלקטרודת ההקלטה עם 3 אשלגן כלורי מולארי עד שנוצרת טיפה בקצה הגדול שלה. זה ימזער את הרעש מצומת הנוזל במהלך ההקלטה. כדי לעבוד עם LMCs היסטמינרגיים, מלאו את אלקטרודות ההקלטה ב-3 מולרי אשלגן אצטט, 0.5 מילי-מולרי אשלגן כלורי כדי למזער את ההשפעה על סוללת הכלוריד של התא.
התחל בהעמסת בקבוקון זבוב טרי עם זבובים בני חמישה עד 10 ימים. זבובים צעירים יותר שבירים יותר, אך ניתן לתעד אותם. בחר את הזבוב הראשון לאלקטרופיזיולוגיה.
הכי קל לעבוד עם נקבות גדולות. כאשר הם נמצאים בצינור התפיסה, נצלו את הנטייה הטבועה שלהם לטפס כלפי מעלה לתוך קצה הפיפטה ולכסות את הקצה הקטן יותר. לאחר מכן, חבר מזרק של 100 מיליליטר עם צינור פלסטיק גמיש לקצה הפיפטה, המוגדל רק כדי לאפשר לדרוזופילה לעבור ולחבר את הקצה השני לקצה פיפטה גדול המחובר למחזיק הזבובים.
לאחר מכן סחטו נפח קטן של אוויר מהמזרק כדי להוציא את הזבוב לתוך מחזיק הזבובים. הביטו דרך המיקרוסקופ הסטריאו והזרימו בעדינות יותר אוויר עד שראש הזבוב בולט מהקצה החרוטי של מחזיק הזבוב. ודא שהזבוב לכוד היטב על ידי בית החזה שלו.
ואז אבטח את הזבוב בשעוות דבורים. השתמש בטמפרטורה הנמוכה ביותר של תנור השעווה כדי להמיס בצורה נקייה את השעווה, שתיראה שקופה. אם הוא חם מדי, השעווה תישרף.
קבעו את ראש הזבוב על ידי מריחת מעט שעוות דבורים על הפרובוסקיס ועל זווית העין הימנית, תוך הימנעות מהקרנית. קבע את שתי הנקודות הללו למחזיק הזבובים. סיים שלב זה במהירות כדי למנוע שריפת הזבוב.
לאחר מכן, הרכיבו משקפי מגן וייצרו מיקרו-סכין. מהדקים סכין גילוח שאינו מנירוסטה עם שני מחזיקי להבי אחיזה שטוחים וסדקים רצועה קטנה בקצה החד שלו. באופן אידיאלי, צור קצה חד כתער הדומה לצריח.
כעת, בזהירות ועם תשומת לב רבה לפרטים, השתמשו במיקרו-סכין כדי לפתוח כמה אומטידיות של העין השמאלית של הזבוב, כמו למשל בארבע עד חמש אומטידיות מהקוטיקולה הגבית ממש מעל קו המשווה של העין. זה יספק את המעבר למיקרואלקטרודת ההקלטה. זה די מאתגר, דורש סכין עשויה היטב, ויש ללמוד אותו בתרגול.
לאחר מכן הסר בעדינות את חתיכת הקרנית הקטנה מהפתח, וחשוף את הרשתית שמתחתיה. כעת בעזרת השיער הדק של מוליך ג'לי הנפט, כסה במהירות את החור בגוש זעיר של ג'לי נפט. לג'לי יש יתרון נוסף של הפחתת הקיבול התוך-מוראלי של הפיפטה.
הימנע ממריחת העין מכיוון שהדבר מטשטש את האופטיקה. בעת הפעלת המיקרואלקטרודה ampחיים יותר, תמיד להיות מקורקע על ידי נגיעה במשטח המתכת של כלוב פאראדיי או שולחן נגד רעידות כדי למנוע מטענים סטטיים. אבטח את הזבוב המותקן לעמוד פלטפורמת הכנת הזבובים.
סובב את מחזיק הזבוב כך שעינו השמאלית של הזבוב פונה ישירות לחוקר. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מניפולטור קטן כדי להכניס את אלקטרודת הייחוס הקהה בעדינות דרך האוקלי של הזבוב לתוך קפסולת הראש. ודא שהזבוב עדיין נראה בריא והזז אותו אנטנות.
ההכנה חייבת להיות מעולה כדי להצדיק הקלטה ממנה. כעת הכניסו את המיקרו-אלקטרודת ההקלטה החדה לעין שמאל דרך הפתח המצופה ג'לי. כשהוא נכנס לרקמה, מיקום קצה האלקטרודה צריך להיות ברור על ידי דפוס ההשתקפות שלו.
קצה האלקטרודה השברירי חייב להיות מונחה בצורה מושלמת אחרת הוא יישבר, וזה מאתגר מאוד. בהתאם לסוג התא שממנו נרשם, ראש הזבוב צריך להיות מכוון מעט אחרת. כשהאלקטרודות במקומן, הפעל את מגבר המיקרואלקטרודה.
לאחר מכן כבה את מקור האור הקר, נתק אותו מהחשמל וחבר אותו להארקה המרכזית כדי למזער רעש חשמלי הנגרם מלולאת הארקה. לאחר מכן, כוונן את מכווני האור של צוואר האווז כך שניתן יהיה להזיז את מערכת זרוע הקרדן בחופשיות סביב הזבוב. לאחר מכן כבה את אורות החדר כדי להכניס את הכנת הזבוב לחושך יחסי.
כעת מדוד את ההתנגדות של אלקטרודת ההקלטה בעין. זה חייב להיות בין 100 ל -260 מגה-אוהם. לפעמים הקצה חסום וניתן לנקות אותו באמצעות פונקציות הזמזום הקיבולי ופולס הזרם של המגבר.
אם זה לא עוזר, השתמש באלקטרודה חדשה. לאחר מכן, הגדר את המגבר למהדק זרם או גשר ואפס את המתח בין האלקטרודות. לאחר שהזבוב הסתגל לחושך למשך מספר דקות, הכניסו את קצה אלקטרודת ההקלטה לתוך העין בצעדים של 0.1 עד מיקרון אחד באמצעות צעד פייזו או באמצעות סיבוב עדין של כפתור הרזולוציה העדינה.
בכל שלב, גרו את העין עם הבזק אור של 1 עד 10 אלפיות השנייה. כל הבזק אור יגרום לירידה קצרה בכרךtage או ב-ERG. כאשר קצה האלקטרודה נכנס ללמינה ונסגר על ה-LMCs, ה-ERG מתהפך.
לאחר מכן המשך בביצוע מדידות. בשל הלא-פולשניות, ניתן לחקור את ביצועי האותות של תאים בודדים במצבם הטבעי הקרוב. תגובת המתח על ידי קולטן אור R1-R6 לאור עמום ובהיר נמדדה ב-20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, קולטן אור R1-R6 הושווה ל-LMC ב-25 מעלות צלזיוס. כל אחד מהם נמדד על זבוב אחר מכיוון שהקלטות תוך-תאיות על ידי שתי מיקרו-אלקטרודות חדות באותו זבוב קשות מכדי להיות קיימות. יכולת החזרה של התגובות הופכת ברורה כאשר הנתונים מונחים על גבי זה.
יחסי אות לרעש בתחום התדרים הושגו על ידי ארבע שנים בהפיכת נתחי נתוני האות והרעש לספקטרום הספק, ולאחר מכן חלוקת ספקטרום הספק האות הממוצע בספקטרום הספק הרעש הממוצע המתאים. התוצאה יכולה להיות רגישה מאוד לאותות בתכשירים הטובים ביותר. ניתן להשתמש בטכניקה כדי להקליט עבור מינים רבים.
זבובי Coenocia קיבלו את אותו גירוי אור נטורליסטי שחוזר על עצמו ב-19 מעלות צלזיוס. הנתונים נלקחו לפני ופוסט-סינפטי מאותו זבוב על ידי קידום אלקטרודת ההקלטה. הדינמיקה המהירה יותר של התיעוד עולה בקנה אחד עם האופי הטורף של מין זה.
לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת הקלטות ארוכות ואיכותיות תמיד אם היא מבוצעת כראוי. תוך כדי ניסיון בהליך זה חשוב להבין, אני מתכוון שזה כמו ללמוד לנגן בפסנתר. ככל שתתרגלו יותר, כך תשיגו תוצאות טובות יותר.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון התערבויות תרופתיות כדי לענות על שאלות נוספות כמו תפקידם של נוירומודולטורים בעיצוב התגובות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביופיזיקה לחקור כיצד לייעל מידע אור, ללכוד ולהעביר, בתוספת התגובות הביוכימיות הקאוסטיות במנגנון התמרת הצילום ובמדעים הביולוגיים הבאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את הדרוזופילה לניסויים תוך-תאיים וכיצד להעיר תגובות נוירולוגיות מקולטני האור והאינטרנוירונים שלה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להקלטת תגובות חשמליות תוך-תאיות מפוטורצפטורים ומנוירוני ביניים חזותיים של Drosophila למגיבים של אור מבוקר. הטכניקה מאפשרת הקלטות מתח באיכות גבוהה עם נזק מינימלי לתאים, דבר ההופך אותה למתאימה לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים מורכבות של חרקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- פיזיולוגיה של חרקים
רקע
- הבנת הקידוד העצבי בתגובה לגירויים חזותיים היא קריטית במדעי המוח.
- *Drosophila* משמשת כאורגניזם מודל לחקר העיבוד החזותי.
- מיקרו-אלקטרודות חדות הן חיוניות להשגת הקלטות מדויקות.
- שיטות קודמות עלולות לגרום לנזק תאי משמעותי, המשפיע על התוצאות.
מטרת המחקר
- להדגים טכניקה להקלטה מפוטורספטורים ונוירונים ביניים של Drosophila.
- לחקור כיצד מידע חזותי מקודד על ידי תאים אלו.
- לספק פרוטוקול מפורט המאפשר לחוקרים לשחזר את השיטה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מיקרואלקטרודות חדות מזכוכית בורוסיליקט או קוורץ.
- מילוי האלקטרודות בתמיסות ספציפיות להפחתת רעשים.
- קיבוע של Drosophila להקלטות יציבות.
- החדרת אלקטרודות לעין להקלטת תגובות מתח.
תוצאות עיקריות
- הקלטות מוצלחות של תגובות מתח מפוטורצפטורים בודדים.
- הדגמה של יעילות השיטה במזעור נזקים תאיים.
- תובנות לגבי קידוד של גירויים חזותיים על ידי נוירונים של Drosophila.
- ביסוס של פרוטוקול מהימן למחקרים עתידיים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חסונה לחקר תגובות עצביות ב-Drosophila.
- היא משפרת את הבנתנו את עיבוד המידע החזותי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקה זו כדי לחקור היבטים אחרים של קידוד עצבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
שיטה אלקטרופיזיולוגית זו מאפשרת הקלטה תוך-תאית ברמת דיוק גבוהה מפוטורצפטורים ונוירונים מקשרים (interneurons) של Drosophila, ובכך מספקת חלון מכניסטי להבנת התהליכים של העברה סיגנלית חזותית. על ידי לכידה של תגובות מתח ארוכות-טווח עם רעש נמוך in vivo, הטכניקה תומכת בהפחתת סיכונים (de-risking) של מטרות בשלבי גילוי מוקדמים, באמצעות קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לפלט נוירונלי תפקודי. רמת השחזור והדיוק הכמותי שלה מגבירות את הביטחון החזוי בתיקוף מסלולים ובמוכנות של בדיקות (assays) לסריקת תרופות נוירותרפויטיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידת תגובות מתח כמדדים תפקודיים לשלמות מסלול הפוטוטרנסדוקציה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה כמותית וישירה של עירור עצבי ודיוק אותות בהקשר של רקמה מקורית.
- ערך אסטרטגי: מסייע בביטחון חיזוי במודולציה של המטרה על ידי מתאם בין פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים לשינויים מושריים על ידי תרכובות או שינויים גנטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר עקומות מתח ברזולוציה גבוהה ובמניטורינג זמני המשמשות כמשתנים תלויים כמותיים לאפיון קינטי או למערך תגובה למינון.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הקלטות תוך-תאיות יציבות עם פרמטרים מוגדרים של קלט (גירוי אור) ופלט (תגובת מתח).
- ערך אסטרטגי: תומך בפלטפורמות סריקה ניתנות להרחבה על ידי אספקת קריאה אלקטרופיזיולוגית הניתנת לשחזור, המתאימה לאוטומציה ולהשוואה בין מעבדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות על מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול של מנגנוני פוטוטרנסדוקציה שמורים, הישימים לתיקוף מטרות בביולוגיה של מערכת העצבים החושית.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לעבודה הפרה-קלינית, על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית בביצועים שלםים ומותאמים לאור.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים, באמצעות הפחתת סיכונים מנגנונית של מטרות המעורבות ברשראי אותות עצביים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים ככלי לתיקוף תפקודי לאחר זיהוי המטרה ולפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה, כאשר תגובות מתח נוירונליות משמשות כסמנים ביולוגיים מכניסטיים למעורבות של המסלול.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת השערות ובבירור מסלולים על ידי פתרון השאלה כיצד מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות משנות את דינמיקת המתח התוך-תאי בפוטורצפטורים ובנוירונים ביניים.
- סריקה: מספק מוכנות של בדיקות באמצעות הקלטות עקביות ובנאמנות גבוהה, המאפשרות הערכה אמינה של תרכובות אל מול תגובות מתח המושרות על ידי אור.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות כגון יחס אות לרעש וקינטיקה של התגובה, המאפשרות השוואה אובייקטיבית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור פיזיולוגיה תאית קרובה למצב הטבעי, ובכך תומך בהסברה למערכות חושיות של יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה אלקטרופיזיולוגית רב-פעמית לתיקוף חוזר של מטרות במספר פרויקטים במדעי העצב של הראייה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי עיבוד חזותי באמצעות מדידה ישירה של מתח.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להכנת אלקטרודות, קיבוע וגירוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת נתונים כמותיים ואובייקטיביים על מעורבות המטרה ותפקוד נוירונלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי מטרות בעלות תיקוף אלקטרופיזיולוגי חזק ורעש פונקציונלי נמוך.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, מיקרו-כירורגיה וטיפול ב-Drosophila כדי להשיג רישומים תוך-תאיים יציבים.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מושכי מיקרו-אלקטרודות, מגברים, מעוררי פיזו ומערכות מבוקרות תאורה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי יעדי התנגדות האלקטרודה (100–260 MΩ), תזמון הגירוי ופרוטוקולים של הסתגלות לחושך.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את השיטה למיני חרקים אחרים או מכינים שורות טרנסגניות עם פוטוטרנסדוקציה שונתה.
- מוגבל על ידי האתגר הטכני של החדרת האלקטרודה ושמירה על דגימות חיות לאורך מפגשי רישום ממושכים.
