Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle
10 ביולי 2016
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.
המטרה הכוללת של הליך זה, היא להדגים טכנולוגיית טיהור מיקרופלואידית נוחה, יעילה ותפוקה גבוהה, להפרדת ננו-חלקיקים חופשיים מהתאים, בעקבות הנדסת תאים עם הננו-חלקיקים. הצורך העיקרי של טכנולוגיה זו הוא לאפשר הסרה מהירה ויעילה של ננו-חלקיקים בלתי קשורים לאחר הליך עבודת התא, אנו אוספים את כל החומרים שלנו. טכנולוגיית טיהור תאים מיקרופלואידית זו משיגה הפרדה יעילה מבוססת גודל בשל השפעות המיקוד האינרציאלי הדיפרנציאלי של תאים וננו-חלקיקים במיקרו-מכשיר ספירלי.
זה יכול לעבד עד 10 מיליון תאים לריכוז מיל וזה שימושי מאוד לרפואה רגנרטיבית, כמו גם לעיבוד תאי נפח תפס. טכנולוגיה זו מבוקשת מאוד לתחום הנדסת התאים, שלעתים קרובות משתמש בננו-חלקיקים לעבודה של תאים, למטרת הדמיה או בקרת תפקוד. ידגימו את ההליך הוי מין טאי, עוזר מחקר מהמעבדה שלי, כמו גם דוקטור דיוויד יאו, עמית מחקר פוסט-דוקטורט ממעבדתו של פרופסור שי.
תרבית תאי גזע מזנכימליים ליותר מ-80% מפגש על צלחת שש בארות לפני תיוג התאים עם הננו-חלקיקים. באופן דומה תרבית תאי THP-1 לצפיפות של מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, ממיסים מיליגרם אחד של ננו-חלקיקי סיליקה עם מיליליטר אחד של מאתיים תמיסת צבע סידן מיקרו-מולרי.
ומערבבים את החלקיקים למשך הלילה. כמו כן, לייצר ננו-חלקיקי PLGA סידן AM בשיטות המתוארות בהפניה המוצגת כאן. מערבבים מיליגרם אחד של ננו-חלקיקי סידן AM PLGA או 150 מיקרוגרם של ננו-חלקיקי סידן סיליקה בתמיסת פולי-ליזין 01% במים על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה למשך דקה אחת.
ואז תן לו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הננו-חלקיקים. הסר את עודפי הסופרנטנט של פולי-ליזין והשהה מחדש את הננו-חלקיקים במיליליטר אחד של מדיום התרבית המתאים לסוג התא שיש לסמן.
הוסף 1 מיליגרם של ננו-חלקיקים מסומנים למיליליטר אחד של מדיום לכל מיליון תאים בתרבית. פיפטה את תערובת התאים, הננו-חלקיקים והמדיום ביסודיות למשך דקה אחת. ואז דוגרים על התערובת למשך כ- 24 שעות.
לאחר התווית, נתקו וקצרו את תאי הגזע, והשעו אותם מחדש לריכוז של בין 100,000 ל-1,000,000 תאים למיליליטר לעיבוד מיקרופלואידי. השתמש בתאי THP-1 מסומנים באותו ריכוז. על מנת לייצר את מכשיר הספירלה המיקרופלואידי, הכינו תחילה תבנית מאסטר פרוסות סיליקון באמצעות טכניקות מיקרו-ייצור סטנדרטיות.
לאחר מכן, מערבבים היטב 30 גרם של הבסיס PDMS prepolymer ושלושה גרם של חומר ריפוי בסירת שקילה. הסר את התערובת בוואקום למשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר. יוצקים את תערובת ה-PDMS על תבנית המאסטר, בדוגמת עיצוב התעלה הספירלית, בזהירות לגובה של חמישה עד 10 מילימטרים.
לאחר מכן הסירו את התערובת למשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר. חזור על תהליך זה עד שכל הבועות מסולקות. לאחר מכן, הכניסו את הוופל לתנור, וודאו שהרקיק אינו מוטה במהלך הריפוי, כדי להבטיח גובה מכשיר קבוע.
רפאו את ה-PDMS ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שהתקרר, גזרו את מכשיר הספירלה PDMS באמצעות אזמל וקילפו בזהירות את לוח ה-PDMS מתבנית המאסטר. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לקצץ את קצוות המכשיר כדי להבטיח משטח חלק להדבקה.
לאחר מכן, השתמש באגרוף ביופסיה של 1.5 מילימטר כדי ליצור שני חורים לכניסות, ושני חורים לשקעים. שטפו את המכשיר עם איזופרופנול כדי להסיר פסולת. וייבש את המכשיר בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר מכן, השתמש בנייר דבק כדי לנקות את המשטח התחתון של מכשיר ה-PDMS וצד אחד של מגלשת זכוכית. הנח בזהירות את מגלשת הזכוכית ומכשיר ה-PDMS לתוך תא פלזמה כשהמשטחים הנקיים חשופים. הפעל את עוצמת הפלזמה למקסימום, הורד את לחץ התא עד שהתא הופך לצבע ורוד, וחשוף את הרכיבים למשך 60 שניות.
לאחר מכן, הסר את השקופית והתקן ה-PDMS מהתא. וחבר אותם יחד על ידי לחיצה חזקה על המשטחים החשופים לפלזמה. ודא שאין בועות כלואות בין שני המשטחים.
מחממים את המכשיר המודבק על פלטה חמה המכוונת ל-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לחיזוק הקשר. חותכים שתי חתיכות צינורות באורך 15 עד 20 סנטימטרים לכניסות, ומחברים מחט בגודל 23 בקצה אחד של כל צינור. לאחר מכן, חותכים שני חלקים מאותו צינור באורך של חמישה עד 10 סנטימטרים לשקעים, ומחברים אותם לחורי היציאה של המכשיר.
לפני הפעלת הדגימה, יש להפעיל את המכשיר באופן ידני עם מזרק המכיל 70% אתנול עד שהוא זורם מצינור היציאה. אפשר לאתנול לשבת במכשיר לפחות 30 שניות כדי לעקר אותו. לאחר מכן, טען 30 מיליליטר PBS מסונן עם 1% BSA למזרק של 60 מיליליטר.
כמו כן, טען שלושה מיליליטר של תאים מסומנים למזרק של שלושה מיליליטר ובדוק שאין בועות אוויר כלואות באף אחד מהמזרקים. הסר בועות אוויר על ידי הוצאה עדינה של כמה טיפות נוזל מהזרבובית. חבר את קצות מזרק הכניסה והצינורות למזרקים ואבטח את המזרקים למשאבות המזרק.
הכנס את הצינורות לכניסות המכשיר המתאימות להם, וודא שאין בועות לאורך הצינור. כאשר הנוזלים מוגדרים כעת, הרכיב את המכשיר על מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך להדמיה בזמן אמת במהלך תהליך מיון התאים. אבטח פסולת קטנה ושני צינורות של 15 מיליליטר קרוב למכשיר על במת המיקרוסקופ.
הנח את צינורות היציאה משני שקעי המכשיר לתוך הפסולת. כעת, הגדר את יחס הזרימה עבור מאגר הדגימה לנדן לאחד עד 10 על ידי הגדרת קצב הזרימה של מזרק הדגימה ל-120 מיקרוליטר לדקה ומזרק הנדן ל-1,200 מיקרוליטר לדקה. הפעל את המכשיר למשך דקה וחצי כדי לתת לקצב הזרימה סיכוי להתייצב.
השתמש במצלמה במהירות גבוהה כדי לאשר את נוכחותם של תאים ממוקדים אינרטיים ליד הקיר הפנימי של הערוץ תחת שדה בהיר עם ניגודיות פאזה. לאחר השגת זרימת מצב יציב, והמכשיר פועל כהלכה, מקם את צינורות היציאה בבקבוקונים שונים כדי לאסוף חומרים נפרדים משקע התא ומשקע הפסולת. מכשיר זה מסוגל למיין נכון תרחיף מסומן של תאים מונוציטים THP-1 מננו-חלקיקי סיליקה פלואורסצנטיים.
יעילות הפרדה גבוהה הושגה כפי שאושר הן על ידי הדמיה במהירות גבוהה והן על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית הטיהור החד-שלבית מאפשרת התאוששות רציפה של תרחיף מסומן ותאים דבקים התלויים בתמיסת חיץ טרייה ללא צורך בצנטריפוגה. המכשיר מסוגל להפריד ביעילות גבוהה עם ננו-חלקיקי סיליקה ו-PLGA ויכול להפריד עד 10 מיליון תאים למיליליטר באותה יעילות גבוהה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג תאים עם ננו-חלקיקים. וכיצד לטהר את התאים המסומנים על ידי הסרת חלקיקים עודפים לא קשורים באמצעות המכשיר המיקרופלואידי המיוחד שלנו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכנולוגיית טיהור מיקרופלואידית שנועדה להפריד ביעילות ננו-חלקיקים חופשיים מתאים מהונדסים. השיטה משתמשת במיקרופלואידיקה אינרציאלית כדי להשיג הפרדה מבוססת גודל, מה שהופך אותה למועילה במיוחד ברפואה רגנרטיבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- הנדסת תאים
- טיהור ננו-חלקיקים
רקע
- הנדסת תאים כוללת לעיתים קרובות שימוש בננו-חלקיקים.
- הסרה יעילה של ננו-חלקיקים שאינם קשורים היא קריטית להשגת תוצאות מדויקות.
- טכנולוגיה זו מאפשרת עיבוד של תאים בתפוקה גבוהה.
- הוא יכול להכיל ריכוזים של עד 10 מיליון תאים למיליליטר.
מטרת המחקר
- להדגים שיטת טיהור נוחה ויעילה.
- לשפר את ההפרדה של תאים מהונדסים מננו-חלקיקים שאינם קשורים.
- לתמוך בהתקדמות ברפואה רגנרטיבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרופלואידיקה אינרציאלית להפרדה מבוססת גודל.
- מיקרו-מכשיר ספירלי למיקוד אינרציאלי דיפרנציאלי.
- יכולות עיבוד בספיקת ייצור גבוהה.
- הדגמה על ידי צוותי מחקר ממעבדות מסונפות.
תוצאות עיקריות
- טיהור מוצלח של תאים מהונדסים מננו-חלקיקים חופשיים.
- הוכחת יעילות בעיבוד נפחים גדולים של תאים.
- תיקוף של יעילות הטכנולוגיה המיקרופלואידית.
- יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית ובהנדסת תאים.
מסקנות
- שיטת הטיהור המיקרופלואידית היא יעילה ואפקטיבית.
- טכנולוגיה זו יכולה לסייע באופן משמעותי ביישומים של הנדסת תאים.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש בה בתחומי ביו-רפואה שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ננו-חלקיקים שאינם קשורים לאחר סימון תאים יוצרים רעש רקע והשפעות חוץ-מטרה הפוגעות בשלמות הנתונים ובבטיחות הטיפולית בתהליכי הנדסת תאים המבוססים על ננו-חלקיקים. אסטרטגיית החלפת התמיסות במיקרופלואידיקה זו מאפשרת הפרדה בתפזורת גבוהה של תאים מסומנים מננו-חלקיקים חופשיים על בסיס גודל, ובכך תומכת ביישומים נטולי הפרעות ברפואה רגנרטיבית ובפיתוח טיפולים תאיים. גישה זו פותרת צוואר בקבוק קריטי בתהליך הטיהור, ובכך משפרת את רמת הוודאות החזיונית במבחנים תפקודיים וביישומי הדמיה בשלבי העבודה הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של תאים המסומנים בננו-חלקיקים על ידי הסרת אותות מטעות מחלקיקים שאינם קשורים.
- ערך תפעולי: מספק שיטה ללא צנטריפוגה לניקוי מהיר של אוכלוסיות תאים מהונדסים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק תרחיפי תאים מטוהרים בבופר טרי לקבלת קריאות עקביות עם רעש נמוך בסריקות פנוטיפיות ותפקודיות.
- ערך תפעולי: תומך בעיבוד בתפוקה גבוהה בקצב של 106 cells/min, מה שמאפשר הכנה ניתנת להרחבה של בדיקות למחקרי נפח גדול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על השלמות הפנוטיפית של תאי THP-1 ותאי MSCs מהונדסים במהלך הניקוי, ובכך תומך בהערכה פרה-קלינית מהימנה.
- ערך תפעולי: מקל על המעבר משלב הגילוי למסלולי עבודה פרה-קליניים על ידי אספקת מוצרי תאים נקיים מהפרעות עבור מחקרי התהפצות ביולוגית ויעילות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת בזרימת העבודה של הנדסת תאים באמצעות ננו-חלקיקים לאחר השלב של הסימון ולפני השלב של האנליזה, ומאפשרת מעבר נקי לשלבי תיקוף תפקודי, דימוי או בדיקות טיפוליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי סילוק רקע שמקורו בננו-חלקיקים, שעלול להסוות תגובות תאיות אמיתיות.
- סריקה: מבטיחה מוכנות של הבדיקה באמצעות סילוק הדיר ריפרודוסבילי של ננו-חלקיקי סיליקה ו-PLGA שאינם קשורים (>95% דה-פלציה).
- אנליטיקה: מאפשרת ציטומטריה זרימה וכבידה כמותיות עם הפחתה של אותות חיוביים שגויים מצבע חופשי או מננו-חלקיקים טעונים בצבע.
- מחקר תרגומי: מקדמת רצף על ידי העברת תאים בבופר טרי המתאים למעקב in vivo או למחקרי מנגנון.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב של התקן מיקרופלואידי ספירלי הניתן לשימוש חוזר מאפשר סטנדרטיזציה בין סוגי תאים ופורמולציות שונות של ננו-חלקיקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מננו-חלקיקים בתאים שכנים שאינם תאי מטרה.
- ערך תפעולי: משיג התאוששות של תאים מעל 90% וסלקה של ננו-חלקיקים מעל 95% בשלב אחד, ובכך משפר את יעילות זרימת העבודה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור עיבוד של נפחים גבוהים ללא צורך במחזורי צנטריפוגציה מרובים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי שיפור מהימנות הנתונים בזיהוי מובילים ובבחירת מועמדים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור והפעלה של התקנים מיקרופלואידיים, כולל הדבקת PDMS והגדרת משאבת מזרקים.
- תלוי בגישה לכלים לייצור מיקרו-ערוצים ספירליים ובדימות במהירות גבוהה לצורך תיקוף.
- מחייב סטנדרטיזציה של קצבי הזרימה (יחס של 1:10 בין הדגימה למעטפת) בין צוותים שונים להשגת הפרדה הניתנת לשחזור.
- ייתכן שיידרש התאמה עבור גדלי תאים משתנים או סוגי ננו-חלקיקים מעבר לסיליקה ו-PLGA.
- מגבלה מעשית: סיכון לסתימה של ההתקן בריכוזי תאים גבוהים מאוד או במקרה של צברים, דבר המחייב סינון מוקדם.
