Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

המטרה הכוללת של הליך זה, היא להדגים טכנולוגיית טיהור מיקרופלואידית נוחה, יעילה ותפוקה גבוהה, להפרדת ננו-חלקיקים חופשיים מהתאים, בעקבות הנדסת תאים עם הננו-חלקיקים. הצורך העיקרי של טכנולוגיה זו הוא לאפשר הסרה מהירה ויעילה של ננו-חלקיקים בלתי קשורים לאחר הליך עבודת התא, אנו אוספים את כל החומרים שלנו. טכנולוגיית טיהור תאים מיקרופלואידית זו משיגה הפרדה יעילה מבוססת גודל בשל השפעות המיקוד האינרציאלי הדיפרנציאלי של תאים וננו-חלקיקים במיקרו-מכשיר ספירלי.

זה יכול לעבד עד 10 מיליון תאים לריכוז מיל וזה שימושי מאוד לרפואה רגנרטיבית, כמו גם לעיבוד תאי נפח תפס. טכנולוגיה זו מבוקשת מאוד לתחום הנדסת התאים, שלעתים קרובות משתמש בננו-חלקיקים לעבודה של תאים, למטרת הדמיה או בקרת תפקוד. ידגימו את ההליך הוי מין טאי, עוזר מחקר מהמעבדה שלי, כמו גם דוקטור דיוויד יאו, עמית מחקר פוסט-דוקטורט ממעבדתו של פרופסור שי.

תרבית תאי גזע מזנכימליים ליותר מ-80% מפגש על צלחת שש בארות לפני תיוג התאים עם הננו-חלקיקים. באופן דומה תרבית תאי THP-1 לצפיפות של מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, ממיסים מיליגרם אחד של ננו-חלקיקי סיליקה עם מיליליטר אחד של מאתיים תמיסת צבע סידן מיקרו-מולרי.

ומערבבים את החלקיקים למשך הלילה. כמו כן, לייצר ננו-חלקיקי PLGA סידן AM בשיטות המתוארות בהפניה המוצגת כאן. מערבבים מיליגרם אחד של ננו-חלקיקי סידן AM PLGA או 150 מיקרוגרם של ננו-חלקיקי סידן סיליקה בתמיסת פולי-ליזין 01% במים על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה למשך דקה אחת.

ואז תן לו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הננו-חלקיקים. הסר את עודפי הסופרנטנט של פולי-ליזין והשהה מחדש את הננו-חלקיקים במיליליטר אחד של מדיום התרבית המתאים לסוג התא שיש לסמן.

הוסף 1 מיליגרם של ננו-חלקיקים מסומנים למיליליטר אחד של מדיום לכל מיליון תאים בתרבית. פיפטה את תערובת התאים, הננו-חלקיקים והמדיום ביסודיות למשך דקה אחת. ואז דוגרים על התערובת למשך כ- 24 שעות.

לאחר התווית, נתקו וקצרו את תאי הגזע, והשעו אותם מחדש לריכוז של בין 100,000 ל-1,000,000 תאים למיליליטר לעיבוד מיקרופלואידי. השתמש בתאי THP-1 מסומנים באותו ריכוז. על מנת לייצר את מכשיר הספירלה המיקרופלואידי, הכינו תחילה תבנית מאסטר פרוסות סיליקון באמצעות טכניקות מיקרו-ייצור סטנדרטיות.

לאחר מכן, מערבבים היטב 30 גרם של הבסיס PDMS prepolymer ושלושה גרם של חומר ריפוי בסירת שקילה. הסר את התערובת בוואקום למשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר. יוצקים את תערובת ה-PDMS על תבנית המאסטר, בדוגמת עיצוב התעלה הספירלית, בזהירות לגובה של חמישה עד 10 מילימטרים.

לאחר מכן הסירו את התערובת למשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר. חזור על תהליך זה עד שכל הבועות מסולקות. לאחר מכן, הכניסו את הוופל לתנור, וודאו שהרקיק אינו מוטה במהלך הריפוי, כדי להבטיח גובה מכשיר קבוע.

רפאו את ה-PDMS ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שהתקרר, גזרו את מכשיר הספירלה PDMS באמצעות אזמל וקילפו בזהירות את לוח ה-PDMS מתבנית המאסטר. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לקצץ את קצוות המכשיר כדי להבטיח משטח חלק להדבקה.

לאחר מכן, השתמש באגרוף ביופסיה של 1.5 מילימטר כדי ליצור שני חורים לכניסות, ושני חורים לשקעים. שטפו את המכשיר עם איזופרופנול כדי להסיר פסולת. וייבש את המכשיר בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, השתמש בנייר דבק כדי לנקות את המשטח התחתון של מכשיר ה-PDMS וצד אחד של מגלשת זכוכית. הנח בזהירות את מגלשת הזכוכית ומכשיר ה-PDMS לתוך תא פלזמה כשהמשטחים הנקיים חשופים. הפעל את עוצמת הפלזמה למקסימום, הורד את לחץ התא עד שהתא הופך לצבע ורוד, וחשוף את הרכיבים למשך 60 שניות.

לאחר מכן, הסר את השקופית והתקן ה-PDMS מהתא. וחבר אותם יחד על ידי לחיצה חזקה על המשטחים החשופים לפלזמה. ודא שאין בועות כלואות בין שני המשטחים.

מחממים את המכשיר המודבק על פלטה חמה המכוונת ל-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לחיזוק הקשר. חותכים שתי חתיכות צינורות באורך 15 עד 20 סנטימטרים לכניסות, ומחברים מחט בגודל 23 בקצה אחד של כל צינור. לאחר מכן, חותכים שני חלקים מאותו צינור באורך של חמישה עד 10 סנטימטרים לשקעים, ומחברים אותם לחורי היציאה של המכשיר.

לפני הפעלת הדגימה, יש להפעיל את המכשיר באופן ידני עם מזרק המכיל 70% אתנול עד שהוא זורם מצינור היציאה. אפשר לאתנול לשבת במכשיר לפחות 30 שניות כדי לעקר אותו. לאחר מכן, טען 30 מיליליטר PBS מסונן עם 1% BSA למזרק של 60 מיליליטר.

כמו כן, טען שלושה מיליליטר של תאים מסומנים למזרק של שלושה מיליליטר ובדוק שאין בועות אוויר כלואות באף אחד מהמזרקים. הסר בועות אוויר על ידי הוצאה עדינה של כמה טיפות נוזל מהזרבובית. חבר את קצות מזרק הכניסה והצינורות למזרקים ואבטח את המזרקים למשאבות המזרק.

הכנס את הצינורות לכניסות המכשיר המתאימות להם, וודא שאין בועות לאורך הצינור. כאשר הנוזלים מוגדרים כעת, הרכיב את המכשיר על מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך להדמיה בזמן אמת במהלך תהליך מיון התאים. אבטח פסולת קטנה ושני צינורות של 15 מיליליטר קרוב למכשיר על במת המיקרוסקופ.

הנח את צינורות היציאה משני שקעי המכשיר לתוך הפסולת. כעת, הגדר את יחס הזרימה עבור מאגר הדגימה לנדן לאחד עד 10 על ידי הגדרת קצב הזרימה של מזרק הדגימה ל-120 מיקרוליטר לדקה ומזרק הנדן ל-1,200 מיקרוליטר לדקה. הפעל את המכשיר למשך דקה וחצי כדי לתת לקצב הזרימה סיכוי להתייצב.

השתמש במצלמה במהירות גבוהה כדי לאשר את נוכחותם של תאים ממוקדים אינרטיים ליד הקיר הפנימי של הערוץ תחת שדה בהיר עם ניגודיות פאזה. לאחר השגת זרימת מצב יציב, והמכשיר פועל כהלכה, מקם את צינורות היציאה בבקבוקונים שונים כדי לאסוף חומרים נפרדים משקע התא ומשקע הפסולת. מכשיר זה מסוגל למיין נכון תרחיף מסומן של תאים מונוציטים THP-1 מננו-חלקיקי סיליקה פלואורסצנטיים.

יעילות הפרדה גבוהה הושגה כפי שאושר הן על ידי הדמיה במהירות גבוהה והן על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית הטיהור החד-שלבית מאפשרת התאוששות רציפה של תרחיף מסומן ותאים דבקים התלויים בתמיסת חיץ טרייה ללא צורך בצנטריפוגה. המכשיר מסוגל להפריד ביעילות גבוהה עם ננו-חלקיקי סיליקה ו-PLGA ויכול להפריד עד 10 מיליון תאים למיליליטר באותה יעילות גבוהה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג תאים עם ננו-חלקיקים. וכיצד לטהר את התאים המסומנים על ידי הסרת חלקיקים עודפים לא קשורים באמצעות המכשיר המיקרופלואידי המיוחד שלנו.