חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

המטרה הכוללת של מודל קוקולטורה פשוט זה במבחנה היא לחקות את המאפיינים של מיקרו-סביבת גידול in vivo, להעשיר אוכלוסיות תאים בודדות ולחקור אופנים שונים של תקשורת בין-תאית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הסרטן והרדיוביולוגיה, במיוחד לגבי הגורמים העומדים בבסיס יצירת פיברובלסטים הקשורים לסרטן והתגובות לחומרים טיפוליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת יצירת אוכלוסיות תאים בודדות מתרבית תאים מעורבת ללא תיוג פלואורסצנטי או מיון תאים המעוררים מתח.

התחל בשטיפת תרבית התאים המעניינת פעמיים עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר הכביסה השנייה, נתק את התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרוו את התגובה עם תשעה מיליליטר של מדיום גידול שלם, והעבירו בעדינות את המדיום על פני הבקבוק 10 פעמים כדי לנתק את התאים.

לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לריכוז של 2.5 כפול 10 עד חמישי למיליליטר במדיום טרי, ולהעביר את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. סובב את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה במצע גידול טרי בתוספת סרום בקר עוברי של 50% ב-2.5 פעמים 10 עד התאים החמישיים לכל 70 מיקרוליטר של ריכוז בינוני. לאחר מכן, העבירו תוספות בגודל הנקבוביות הניסיוני המתאים מאריזתן לבארות בודדות של צלחת מרובת בארות וכסו את המנה.

לאחר מכן החזיקו את המנה בשתי ידיים, הפכו בעדינות את המנה עד שתחתיות התוספת פונות כלפי מעלה. הסר את תחתית המנה. בעזרת מלקחיים סטריליים ביד אחת, החזק תוספת אחת במקומה והשתמש ביד השנייה כדי לשאוב לאט 70 מיקרוליטר תאים לקצה מיקרופיפטה.

לאחר מכן הוציא לאט את התאים על פני השטח של מה שהוא עכשיו הצד העליון של התוספת. לאחר זריעת כל אחד מהתוספות, החליפו בזהירות את תחתית הכלי ודגרו את המנה ההפוכה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בלחות למשך 30 עד 45 דקות. בתום הדגירה, בארון בטיחות ביולוגי בזרימה למינרית הפוך בזהירות את המנה כך שתחתית התוספות פונות כעת כלפי מטה.

לאחר מכן טבלו לאט ובזהירות את החלק התחתון של כל תוספת בשני מיליליטר של מדיום שלם שחומם מראש, והניחו את המנה בחזרה לחממה הלחה. לאחר 48 שעות, החלף את המדיום בתחתית כל באר בשני מיליליטר של מדיום גידול טרי. לאחר שכל המדיום עבר רענון, זרעו 2.5 פעמים 10 עד התאים החמישיים של האוכלוסייה השנייה המעניינת על החלק העליון של התוספות במיליליטר אחד של מדיום טרי, והחזירו את המנה לחממה.

24, 48 ו-96 שעות לאחר מכן, החלף את המדיום בחלק העליון של כל תוספת במיליליטר אחד של מדיום שלם טרי. והמדיום בתחתית כל באר עם שני מיליליטר של מדיום שלם טרי. לאחר 120 שעות של קוקולטורה, העבירו תוספת אחת בכל פעם לכלי תרבית תאים בודדים בגודל 35 מילימטר המכילים מיליליטר אחד של PBS.

ושטפו את התחתית והצדדים העליונים של התוספות עם מיליליטר אחד של PBS. כדי לאסוף את התאים הגדלים בתחתית התוספת, הנח את התוספות בצד התחתון כלפי מטה לתוך 200 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר. לאחר שתי דקות בטמפרטורת החדר, עצרו את התגובה עם 800 מיקרוליטר של מדיום גידול שלם.

לאחר מכן החזיקו את התוספת בזווית קלה, פיפטו בעדינות את הסופרנטנט על פני התאים 10 פעמים, ואספו את התאים בצלחת. לאחר שכל התוספות הופשטו, השעו מחדש את התאים בריכוז של פי שניים פי 10 עד חמישית תאים למיליליטר של מצע גידול. והוסף 250 מיקרוליטר של תאים על כיסויי זכוכית בודדים סטריליים.

הנח את הכיסויים בחממה הלחה למשך שעה. בתום הדגירה, בארון בטיחות ביולוגי בזרימה למינרית, הוסיפו בזהירות שני מיליליטר של מדיום גידול שלם לתבשיל ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% אחוז פחמן דו חמצני עם לחות למשך 48 שעות. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.

לאחר הכביסה השלישית, יש לתקן את התאים בפורמלדהיד 4% ב-PBS למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חמש שטיפות עם מי מלח עם טריס. לאחר השטיפה האחרונה, יש לחדור לתאים עם 0.25% טריטון X-100 בתוספת 0.1 ספונין למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סמנו את הדגימות עם הנוגדן העיקרי המעניין בחסימת התמיסה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת בבוקר, הסר את הנוגדן הלא קשור עם שלוש דקות שטיפות בתמיסת שטיפה, ולאחר מכן דגירה של שעה בטמפרטורת החדר בנוגדנים המשני המתאים בתמיסת החסימה. בתום הדגירה, שטפו את הנוגדן המשני הלא קשור כפי שהודגם זה עתה והרכיבו את החלקות הכיסוי על שקופיות בודדות עם מדיום הרכבה נגד דהייה המכיל DAPI. אטום את קצוות הכיסוי עם לק שקוף.

לאחר מכן דמיין את התאים בהגדלת שמן פי 63 במיקרוסקופ הפוך המצויד במקור אור חיצוני לעירור פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת לגדל שתי אוכלוסיות תאים שונות משני צידי הממברנות הנקבוביות של תוספות תרבית תאים למשך 120 שעות לפחות, תוך שמירה על טוהר של יותר מ-99% באוכלוסיות התאים משני צידי הממברנה, כאשר משתמשים בתוספות עם נקבוביות של 0.4 או מיקרון אחד. תוספות עם נקבוביות של שלוש מיקרון, לעומת זאת, גדולות מספיק כדי לאפשר לתאים לנדוד על פני הממברנה, כפי שנצפה בניסוי זה באמצעות קו תאי סרטן שד אנושי חיובי ל-GFP.

תוספות נקבוביות של 0.4 מיקרון מגבילות גם את היווצרות צמתי הפער התפקודי בין תרביות התאים משני צידי התוספת, ומגבילות את התקשורת לגורמים המופרשים. תוספות עם נקבוביות של מיקרון אחד ושלושה מיקרון, לעומת זאת, מאפשרות צימוד פונקציונלי של תאים דרך צמתי הפער כפי שמצוין על ידי העברת התווית הפלואורסצנטית על פני הממברנה בקורבציות אלה. חשוב לציין, ניתן להשתמש במערכת זו כדי לייצר ביעילות פיברובלסטים הקשורים לסרטן מפיברובלסטים דיפלואידים אנושיים רגילים בעקבות תרבובתם המשותפת עם תאי סרטן השד, כפי שמעיד הביטוי המופחת של caveolin-1 על הפיברובלסטים שהתרבו יחד עם תאי סרטן השד האנושיים.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לבחור תוספות עם גודל נקבוביות המתאים לשאלה הנחקרת. ולראות את אוכלוסיית התאים הראשונה בצד התחתון של התוספת במדיום המאפשר את ההתקשרות שלהם. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונובלוטינג, אימונופלואורסצנציה באתר, או רוב הבדיקות האחרות מבוססות התאים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי שינויים בביטוי חלבונים, שינויים בפלישה ובנדידה או הבדלים בתגובות לחומרים טיפוליים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן וביולוגיה של הקרינה לחקור את הגורמים התורמים להתפתחות, להתפתחות המיקרו-סביבה של הגידול, ובמקרה שלנו להתפשטות ההשפעות המזיקות של קרינה מייננת מתאים ממוקדים עם קרינה לתאים מהצד בסביבה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין קוקולטורה של תאים מעורבים, לשמור על הקוקולטורה ולקצור אוכלוסיות תאים מועשרות בטוהר גבוה מהקומקולטורה להמשך ניתוח. אל תשכח שעבודה עם זני תאים אנושיים או קווי תאים עלולה להיות מסוכנת וכי יש ללבוש את ציוד ההגנה האישי המתאים ולהקפיד על תקנות הבטיחות הביולוגית המתאימות בעת ביצוע הליך זה.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.