Name: חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטת תרבית משותפת פשוטה לחקירת microenvironment הגידול ותקשורת בין-תאית. השיטה מאפשרת העשרת אוכלוסיות תאים ללא תיוג פלואורסצנטי מלחיץ, ומסייעת בחקר פיברובלסטים הקשורים לסרטן ותגובות לטיפולים תרופתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת ניו ג'רזי לחקר הסרטן (מלגת קדם-דוקטורט DFHS13PPCO17), המכונים הלאומיים לבריאות (CA049062) ומינהל האווירונאוטיקה והחלל הלאומי (NNX15AD62G).

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או סותרים.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, להתאמה בהליך במבחנה (איור 1) אשר מנצל להכניס קרום microporous חדיר ליצור אוכלוסיות תאים בודדות מועשר מתוך שיתוף תרבות של תאי heterotypic. באופן משמעותי, המודל מתאים חוקרת מצבים שונים של תקשורת בין תאית. השלבים הקריטיים כוללים בחירת הכנס נקבובי בגודל המתאים עניין ניסוי ספציפי (ים), זריעת אוכלוסיית התא הראשונה בצד התחתון של להכניס במדיום השלים עם 50% FBS, זריעת אוכלוסיית התא השנייה בצד העליון של הכנס, ושיתוף culturing שתי אוכל...

במיקרו-סביבה של הגידול (TME) הוא מערכת מורכבת מאוד מורכבת תאי קרצינומה כי להתקיים ולהתפתח לצד stroma המארח. רכיב סטרומה זה בדרך כלל מורכב פיברובלסטים, myofibroblasts, לתאי אנדותל, רכיבי חיסון שונים, כמו גם תאי מטריקס 1. מרכיב משמעותי, לעתים קרובות רוב stroma זה, הם פיברובלסטים מופעלים, מכונים לעתים קרובות כמו פיברובלסטים סרטן קשור או פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (CAF) 2,3. בניגוד נורמלי, פיברובלסטים שאינם מופעל, cafs לתרום התחלה של גידול, התקדמות, אנגיוגנזה, פלישה, גרורות, והישנות 4-11 במגוון רחב של גידולים סרטניים, כולל סרטן שד, ערמונית, ריאות, לבלב, עור, מעי גס, ושט, השחלה 5,6,12-17. עם זאת, על טבעם המדויק של תרומת cafs ברחבי בפתוגנזה הסרטן נשאר מוגדר היטב. יתר על כן, עדות קלינית הוכיחה ערך פרוגנוסטי של cafs, התאמת נוכחותם ממאירות בדרגה גבוהה, כישלון הטיפול, 10,18,19 פרוגנוזה גרועה הכוללת. ברור, שיפור הבנתנו את האירועים ליזום בפיתוח CAF, כמו גם התקשורת בין התאית בתיווך תפקידם בתוך TME, עשוי לספק מטרות טיפוליות חדשות ומלהיבות ואסטרטגיות משופרות שיכולים לשפר את תוצאות מטופל. כדי להשיג מטרה זו, כמה in vivo ו במודלים חוץ גופית פותחו. בעוד גישות in vivo הן מהורהרות יותר של &#39;TME החולה, יש להם מגבלות, כולל את המורכבות העצומות ואת ההטרוגניות הן בתוך ובין גידולים. יתר על כן, דגימות גידולים מ בבני אדם לעתים קרובות מאוד מייצגות שפותחו TME ואינן מאפשרות הבנה של האירועים ליזום TME. מחקרים בבעלי חיים ניסוייים מציעים כמה יתרונות, אולם הכללה של נתונים בעלי חיים לבני אדם צריך להיעשות בזהירות בשל הבדלי physiology בין בני אדם ובעלי חיים כמו מכרסמים (למשל, כימיה תיאול 20, קצב חילוף החומרים 21, סובלנות להדגיש 22, וכו &#39;). יתר על כן, בניגוד לאוכלוסיה האנושית, שהיא גנטית הטרוגנית בטבע, בחיות מעבדה בדרך כלל הם התרבו הומוגניות. כמו כן, הוא לעתים קרובות קשה לבחון וריאציות פיסיולוגיות חולפות ושינויי התא פנוטיפ, כמו גם לשלוט על פרמטרים ספציפיים ניסוי באמצעות בעלי חיים כמו מכרסמים. לפיכך, במבחנה 2 ו 3 ממדים (2D and 3D) מודלים בתרבית רקמה מנוצלים לעתים קרובות כדי לקדם את ההבנה הבסיסית של פיתוח TME. למרות חוסר של תיאור מדויק של המורכבות של מערכות in vivo, מודלים אלה מציעים יתרונות המאפשרים חקירות מכניסטית מאוד. חוץ גופית מודלים לאפשר פשוטה יותר, ממוקד, יעיל וחסכוני ניתוח TME, לפיה מובהקות סטטיסטית ניתן להפיק נתוניםתאים ללא וריאציות מערכתיות המתעוררות אצל בעלי חיים. ישנם כמה סוגים של מערכות במבחנה. שני הנפוץ ביותר TME במבחנה מודלים מורכבים בשכבה מעורבת או בתרביות תאים אליפטית. שתי השיטות התרבות הם יתרון לימודי יסוד של אינטראקציות בין תאית (למשל, תאים נורמליים עם תאים סרטניים) ו לניתוח שינויים פנוטיפ תאים שונים TME ספציפיים (למשל, הופעתה של פיברובלסטים סרטן הקשורים מן fibroblasts נורמלי). בנוסף, spheroids מסוגל ליצור מבנה מרקמה דמוית מהורהר יותר של TME, והוא יכול להיות נציג של ההטרוגניות גידול 23. עם זאת spheroids לעתים קרובות לייצר הדרגתי מתח חמצן מגוון הרחב של נפחים פני שכבות, אשר עלול לסבך מסקנות ניסוי 24. למרבה הצער, שני הדגמים מוגבלים מאוד ביכולתם לבודדת אוכלוסיות תאים טהורות עבור אפיון נוסף והלימוד הבא שיתוףתַרְבּוּת. לשם כך ידרוש לפחות סוג תא אחד להיות fluorescently-tagged או מתויג עם יצרנית זיהוי, ולאחר מכן חשיפת המעורבות ושיתוף תרבות מיון עיבוד התא נרחב להפריד בין אוכלוסיות תאים. בעוד סדרן תא הוא מסוגל לבודד אוכלוסיית תא טהורה למדי, אחד חייב להיות מודע של מתח הסלולר זיהום מיקרוביאלי פוטנציאל סיכוני 25. כדי להקל על ההבנה של תקשורת בין תאית, מאמצים רבים הוקדשו לקראת פיתוח ואופטימיזציה במערכות חוץ גופית כי מקרוב לחקות את הסביבה vivo, תוך התרת גישה פשוטה. כלי אחד כזה הוא להכניס microporous חדיר, מצע קרום אשר פותחה הראשון בשנת 1953 26 ובהמשך מותאם ליישומים ומחקרים מגוונים (למשל, הקוטביות בתא 27, אנדוציטוזה 28, תחבורה התרופה 29, דוגמנות רקמת 30, FERTilization 31, עובר אורח אפקט 32,33, וכו &#39;). מערכת זו מאפשרת את הצמיחה של תאים עם אנטומיים in vivo-כמו והבחנה פונקציונלית, כמו גם ביטוי של רבי in vivo סמני 34,35 שאינם נצפו כאשר בתרבית על plasticware בלתי חדיר. יתר על כן, הקרום הנקבובי מאוד דק (10 מיקרומטר העבה) מתיר דיפוזיה מהירה של מולקולות ושעות איזון, המדמה את סביבת vivo ומאפשרת תפקוד הסלולר עצמאי בשני תחומי תא apical ו basolateral. יתרון נוסף של השירות של הכנס כמערכת TME הוא ההפרדה הפיסית של שתי אוכלוסיות תאי heterotypic גדלו משני צדי הממברנה באותם תנאים סביבתיים, תוך שמירה על מצבים שונים של תקשורת בין תאית הדרך הנקבובית הממברנה. למרות מופרדים פיסיים, שתי אוכלוסיות התאים הם מצמידים מטבולית באמצעות אלמנטים המופרשים על ידם, כמו דהscribed כאן, גם בערוצים-junctional הפער. בנוסף, על ידי שמירה על ההכנסות ב in vivo מתח חמצן חלקי (PO 2), המודל מפחית את הסיבוכים של הדרגתיים חמצן כימיים שנצפו מערכות אחרות. במקום זאת, היא מגדילה את ההבנה של מנגנונים טבעיים שליטה על TME. יש לציין, כי שתי אוכלוסיות התאים יכולות להיות מבודדות בקלות עם טוהר גבוה, ללא תיוג ניאון ו / או מיון התא הבא פרקי שיתוף התרבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול במבחנת TME מורכב תאים אנושיים שד קרצינומה ו fibroblasts האנושי גדל, בהתאמה, משני הצדים להכניס קרום microporous חדיר, אבל עדיין בתקשורת מתמדת דו-כיוונית הדרך הנקבובית הממברנה. אנו מראים כי באמצעות ממברנות עם גדלים נקבוביים שונים, תרומת סוג מסוים של תקשורת בין תאית (למשל, גורמים המופרשים לעומת צומת פער) לפיתוחיכול להיחקר של TME.

<table><tbody><tr><td><חזק>לתרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (כלומר, AG1522) פיברובלסט דיפלואידי אנושי</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passage 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 קו תאי אדנוקרצינומה של השד</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>קו הורים: ATCC (#HTB-26)</td></tr> <tr><td>MDA-MB-231/GFP קו תאי אדנוקרצינומה של השד</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's minimal essential medium (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS),</td> תוסף <td>סיגמא</td><td>F6178-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג גלוטגרו מוסמך (200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין)</td> <td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת סטרפטומיצין פניצילין, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (כלומר, הכנסת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה) (0.4 &mu; m נקבוביות)</td><td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (כלומר, תוספת ממברנה מיקרופורית חדירה) (1 &mu; m נקבוביות)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (כלומר, הכנסת ממברנה מיקרופורית חדירה) (3 &mu; m נקבוביות)</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>6-well Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ2 בקבוק תרבית תאים</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>0.25% (נפח/נפח) טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת תרבית תאים</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>In situ Immunofluorescence - 1:5,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עזים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>In situ אימונופלואורסצנציה - 1:2,000</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר - Fraction V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>ללא אימונוגלובולין ופרוטאז</td></tr><tr><td>16% (wt/vol) תמיסת פורמלדהיד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>מדלל ל-4% עם 1x PBS</td></tr><tr><td>Premium Cover Glass (22 מ"מ x 22 מ"מ מס' 1)</td> <td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold מגיב אנטי-דהייה עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>לניתוח ציטומטרי זרימה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן,</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>AM C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Western Blot Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1,000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה (0.2 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Protein Assay</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט מונוהידראט (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>30% תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

הבנת יחסי גומלין heterotypic מוקדם בין תאים סרטניים ואת stroma שאינו סרטני שמסביב חשובה הבהיר את האירועים שהובילו הפעלת סטרומה והקמת microenvironment הגידול (TME). כמה במבחנה במודלים vivo של TME פותחו; עם זאת, באופן כללי מודלים אלה אינם מאפשרים בידוד בקלות של אוכלוסיות תאים בודדות, בתנאים שאינם מביך, למחקר נוסף. כדי לעקוף את הקושי הזה, יש לנו עבד מודל TME במבחנה באמצעות מצע צמיחת תאים מורכבים להכניס קרום microporous חדיר המאפשר דור פשוט של אוכלוסיות תאים מועשרות גדל באופן אינטימי, עדיין בנפרד, משני צדי הממברנה של הכנס על שיתוף המורחבת פעמים -culture. באמצעות שימוש במודל זה, אנו מסוגלים לייצר פיברובלסטים סרטן קשור מועשרים מאוד (CAF) אוכלוסיות פיברובלסטים אדם דיפלואידי נורמלים הבאותשיתוף תרבות (120 שעות) עם תאי סרטן שד אנושיים גרורתי מאוד, ללא שימוש תיוג ניאון ו / או מיון התא. בנוסף, על ידי הוויסות הנקבובית בגודל של הכנס, אנחנו יכולים לשלוט על המצב של תקשורת בין תאית (למשל, תקשורת צומת-פער, גורמים מופרשים) בין שתי אוכלוסיות תאי heterotypic, המתיר חקירת המנגנונים העומדים בבסיס הפיתוח של TME, כולל התפקיד של חדירות צומת-הפער. מודל זה משמש כלי רב ערך לשיפור הבנתנו את האירועים הראשוניים שהובילו ייזום הסרטן-stroma, תחילת האבולוציה של TME, ואת אפקט הכיוונון של stroma על התגובות של תאים סרטניים לסוכנים טיפוליים.

כאן התאמנו להכניס קרום microporous חדיר לפתח תאים במבחנה heterotypic מערכת שיתוף תרבות המחקה את microenvironment הגידול vivo (איור 1). מערכת זו מאפשרת שתי אוכלוסיות תאים שונות כדי להיות מבוגרות משני הצדים הנקבובי-הקרום של הכנס לפרקי זמן (עד 120 שעות, בשימוש שלנו). חשוב במערכת הוא מסוגלת לשמור על טוהר אוכלוסיות תאים, כפי שנקבע על ידי תאי ציפוי GFP-tagged מד&quot;א- MB-231 בצד העליון של 0.4-, 1-, או 3 מ-נקבובי מוסיף...

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

המטרה הכללית של מודל תרבית משותפת (coculture) פשוט זה in vitro היא לחקות את המאפיינים של סביבת גידול גידולית in vivo, להעשיר אוכלוסיות תאים בודדות, ולבחון דרכים שונות של תקשורת בין-תאית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הסרטן והרדיוביולוגיה, ובמיוחד בנוגע לגורמים העומדים בבסיס היווצרותם של פיברובלסטים הקשורים לסרטן והתגובות לסוכנים טיפוליים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת יצירת אוכלוסיות תאים בודדות מתרבית תאים מעורבת ללא סימון פלואורסצנטי או מיון תאים המעוררים סטרס.התחילו בשטיפת תרבית התאים הרלוונטית פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS. לאחר השטיפה השנייה, נתקו את התאים באמצעות מיליליטר אחד של trypsin-EDTA בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות בטמפרטורת הח aislado. לאחר מכן, עִצרו את התגובה עם תשעה מיליליטר של מצע גידול מלא, תוך כדי פיפוט עדין של המצע על פני הבקבוק 10 פעמים כדי להפריד את התאים.לאחר הספירה, דללו את התאים לריכוז של 2.5 times 10 to the fifth תאים למיליליטר במצע טרי, והעבירו את התאים לתוך מבחנה צנטריפוגית סטרילית של 15 מיליליטר. השקיעו את התאים באמצעות צנטריפוגה ותלה את המשקע במצע גידול טרי המועשר ב-50% fetal bovine serum בריכוז של 2.5 times 10 to the fifth תאים ל-70 µL של מצע. לאחר מכן, העבירו מהאריזה אינסרטים בגודל נקבוביות מתאים לניסוי אל בארות בודדות בתוך צלחת ריבוי-בארות וכסו את הצלחת.לאחר מכן, החזיקו את הצלחת בשתי ידיים והפכו אותה בעדינות עד שתחתית ההכנסות פונה כלפי מעלה. הסירו את תחתית הצלחת. בעזרת פינצטה סטרילית ביד אחת, החזיקו הכנסה אחת במקומה ובעזרת היד השנייה שאבו לאט 70 µL של תאים לתוך טיפ של מיקרופיפטה.לאחר מכן, פזרו באיטיות את התאים על פני השטח של מה שמהווה כעת את הצד העליון של המבדיל (insert). לאחר זריעת כל אחד מהמבדילים, החזירו בזהירות את תחתית הפיתה והדגירו את הפיתה ההפוכה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide עם לחות למשך 30 עד 45 דקות. בסיום הדגירה, בתוך מCבט בטיחות ביולוגי עם זרימה למינרית, הפכו בזהירות את הפיתה כך שתחתית המבדילים תפנה כעת כלפי מטה.לאחר מכן, טבלו לאט ובזהירות את תחתיתו של כל סרט (insert) בשני מיליליטרים של מצע מלא שחומם מראש, והחזירו את הצלחת לאינקובטור הלח. לאחר 48 שעות, החליפו את המצע בתחתית כל באר בשני מיליליטרים של מצע גידול טרי. כאשר כל המצע חודש, זרעו 2.5 times 10 to the fifth תאים מהאוכלוסייה השנייה המבוקשת על גבי הסרטים במיליליטר אחד של מצע טרי, והחזירו את הצלחת לאינקובטור.לאחר 24, 48 ו-96 שעות, החליפו את המצע בחלק העליון של כל תבנית (insert) במילליטר אחד של מצע מלא טרי. ואת המצע בתחתית של כל באר בשני מילליטר של מצע מלא טרי. לאחר 120 שעות של תרבית משותפת (coculture), העבירו כל תבנית בנפרד לצלחניות תרבית תאים של 35 מילימטר המכילות מילליטר אחד של PBS.שטפו את החלקים התחתונים והעליונים של המאספים (inserts) עם 1 mL של PBS. כדי לאסוף את התאים שגדלו בתחתית המאסף, הניחו את המאספים כאשר הצד התחתון פונה כלפי מטה לתוך 200 µL של trypsin-EDTA בטמפרטורת החדר. לאחר שתי דקות בטמפרטורת החדר, עצרו את התגובה באמצעות 800 µL של מצע גידול מלא.לאחר מכן, תוך החזקת המצע (insert) בזווית קלה, העבירו בעדינות בעזרת פיפט את הנוזל העליון (supernatant) מעל פני התאים 10 פעמים, כדי לאסוף את התאים אל תוך הצלחת. כאשר כל המצעים נשפכו, השעיקו מחדש את התאים בריכוז של 2x10⁵ תאים למיליליטר של מצע גידול. והוסיפו 250 µL של תאים על זכוכית כיסוי סטרילית בודדת.הניחו את כיסויי הזכוכית (coverslips) בתוך האינקובטור הלח למשך שעה אחת. בסיום הדגירה, בתוך קבינה בטיחותית ביולוגית בעלת זרימה למינרית, הוסיפו בזהירות שני מיליליטרים של מצע גידול מלא לצלחת והדגירו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% פחמן דו-חמצני עם לחות למשך 48 שעות. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.לאחר השטיפה השלישית, קבעו את התאים ב-4% formaldehyde ב-PBS למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו חמש שטיפות עם Tris-buffered saline. לאחר השטיפה האחרונה, הגשימו את התאים עם 0.25% Triton X-100 בתוספת 0.1 saponin למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגרו אותם בתמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סמנו את הדגימות עם הנוגדן הראשוני הרלוונטי בתמיסת חסימה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה.בבוקר למחרת, הסר את הנוגדן שלא נקשר באמצעות שלושה שטיפות של דקה אחת בתמיסת שטיפה, ולאחר מכן בצע דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר עם הנוגדן המשני המתאים בתמיסת חסימה. בסיום הדגירה, שטוף את הנוגדן המשני שלא נקשר כפי שהודגם זה עתה, והעבר את כיסורי הזכוכית למסכים בודדים באמצעות תמיסת קיבוע אנטי-פייד המכילה DAPI. אטום את קצוות כיסוי הזכוכית בעזרת לק שקוף.לאחר מכן, דמיינו את התאים תחת הגדלה של 63x עם שמן במיקרוסקופ הפוך המצויד במקור אור חיצוני לעירור פלואורסצנציה. מערכת זו מאפשרת לגדל שתי אוכלוסיות תאים שונות משני צידי הממברנות נקבוביות של תבתי תרבית תאים למשך 120 שעות לפחות, תוך שמירה על טוהר של יותר מ-99% באוכלוסיות התאים משני צידי הממברנה, כאשר נעשה שימוש בתבתים בעלי נקבים של 0.4 או מיקרון אחד. עם זאת, תבתים בעלי נקבים של שלושה מיקרון גדולים מספיק כדי לאפשר לתאים לנדוד דרך הממברנה, כפי שנצפה בניסוי זה באמצעות שורת תאי סרטן שד אנושיים חיוביים ל-GFP.הסרטים בעלי נקבים של 0.4 מיקרון מגבילים גם את היווצרותן של צממתי gap junctions תפקודיים בין תרביות התאים בשני צדי הסרט, ובכך הם מגבילים את התקשורת לגורמים מופרשים בלבד. לעומת זאת, סרטים עם נקבים של מיקרון אחד ושלושה מיקרון מאפשרים צימוד תפקודי של תאים באמצעות צממתי gap junctions, כפי שמעיד מעבר התיוג הפלואורסצנטי דרך הממברנה בתרביות משותפות אלו. באופן משמעותי, ניתן להשתמש במערכת זו כדי לייצר ביעילות פיברובלסטים הקשורי סרטן מפיברובלסטים דיפלואידיים אנושיים נורמליים לאחר גידולם בתרבית משותפת עם תאי סרטן השדיים, כפי שמעידה הביטוי המופחת של caveolin-1 בפיברובלסטים שגודלו בתרבית משותפת עם תאי סרטן השדיים האנושיים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחור רכיבי הכנסה (inserts) עם גודל נקבים המתאים לשאלה הנחקרת. כמו כן, יש להבטיח שאוכלוסיית התאים הראשונה בצדו התחתון של רכיב ההכנסה נמצאת במצע המקל על היצמדותם. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כגון immunoblotting, אימונופלורסצנציה in-situ, או רוב הבדיקות המבוססות על תאים, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לשינויים בביטוי חלבונים, שינויים בפלישה ובנדידה, או הבדלים בתגובות לסוכנים טיפוליים.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביולוגיה של הסרטן והביולוגיה של הקרינה לחקר הגורמים התורמים להתפתחות, לאבולוציה של מיקרו-סביבת הגידול, ובמקרה שלנו, להפצת ההשפעות המזיקות של קרינה מייננת מתאים שהוקרן אל תאי ה-"bystander" בסביבתו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להכין תרבית משולבת (coculture), כיצד לתחזק את התרבית המשותפת, וכיצד לאסוף אוכלוסיות תאים מועשרות ברמת טוהר גבוהה מהתרבית לצורך ניתוח המשך. זכרו כי עבודה עם זני תאים או קווי תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים ולהקפיד על תקנות בטיחות ביולוגית נאותות בעת ביצוע הליך זה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

a-mimic-tumor-microenvironment-simple-method-for-generating-enriched

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מערכת התרבות 3D עבור hematopoiesis מתואר באמצעות דם טבורי האדם הנגועים מוח העצם. השיטה מבוססת על שימוש פוליאוריטן נקבובי הפיגום הסינתטי מצופה חלבונים תאי מטריקס. פיגום זה ניתנת להתאמה להכיל מגוון רחב של תאים.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

ניתן למזער קסנוגרפלים שמקורם בחולה של גליובלסטומה מולטיפורמה למיקרו-גידולים חיים באמצעות מערכת תרבית ביוג'ל אנושית תלת מימדית. בדיקת גידול תלת מימדית זו מתאימה לבדיקת תגובה לתרופות ופרופיל מולקולרי, כולל ניתוח קינומי.

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

אינטראקציות סלולרי Paracrine ו- juxtacrine תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. כאן, שיטה תרבות proximal משמש כדי ללמוד paracrine איתות שבו ריכוז המותאמות לשפות אחרות של הגורמים המופרש נשמרים תוך מניעת מגע ישיר הסלולר.

שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים

מטרת השיטה המוצגת כאן היא להראות כיצד מיקרומערכים מיקרואקולוגיה (MEMA) ניתן לזייף ולהשתמש כדי לחקור את ההשפעה של אלפי קומבינטורית מיקרו סביבות פשוטות על הפנוטיפ של תאים מתורבתים.

שימוש במיקרו מערכים לחקור השפעה מיקרוסביבתית על פנוטיפים סלולריים בסרטן

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול פשוט, מהיר ואמין של זרימה רב-פרמטרית בסיוע ציטומטריה וגידול על שבב כדי לנטר ולאפיין את השלבים המרכיבים את מחזור החיסון לסרטן. ואכן, הבנה מעמיקה של יחסי הגומלין בין סרטן לתאי מערכת החיסון מספקת תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ולהנחות את הטיפול הקליני.

תרבות משותפת במערכות מבחנה כדי לשחזר את מחזור החיסון לסרטן

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים המפרטים הוראות ליישום תרביות תאים תלת-ממדיות באמצעות מטריצות קולגן וקולגן-אגרוז במערכת מיקרופיזיולוגית. פרוטוקולים אלה תומכים בתרבית משותפת של צינורית הכליה הפרוקסימלית וקרצינומה של תאי הכליה, המדמים תנאי in vivo ומאפשרים חקירה מתקדמת של אינטראקציות בין תאי סרטן הכליה.

תרבית משותפת מיקרופלואידית של אפיתל כליות בריא וגידול למודל התקדמות סרטן הכליה

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

למד שיטת תרבית משותפת פשוטה לחקירת microenvironment הגידול ותקשורת בין-תאית. השיטה מאפשרת העשרת אוכלוסיות תאים ללא תיוג פלואורסצנטי מלחיץ, ומסייעת בחקר פיברובלסטים הקשורים לסרטן ותגובות לטיפולים תרופתיים.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

גלה סרטונים נוספים