נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר למיקרואורגניזם להתפתח בתנאי מעבדה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון קשרי תפקוד של בלוטת האדרנלין, תגובות למעמדים (stress responses), הנדסה מטבולית, וכמובן, אבולוציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא סלקציה רציפה של הצאצא המותאם ביותר תחת תנאי מעבדה ספציפיים.

התחילו את ההליך בהכנת הציוד, וכן את מצע ההתחלה, מצע העקה ומצע העקה גבוהה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. זרעו מושבה בודדת של E.coli מסוג wild type בתוך מבחנה בנפח 15 מיליליטר המכילה 4 מיליליטר של מצע התחלה. דגרו את המבחנה באינקובטור עם ניעור למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 220 rpm.

דגרו את כלי הכמוסטט (chemostat jar) תוך אספקת אוורור וערבוב בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות. לאחר הדגירה, חברו באופן אסיפטי את קצה צינור הסיליקון מהמשאבות לכלי הכמוסטט. העבירו באופן אסיפטי 1 mL של תרבית מקדימה (pre-culture) אל כלי הכמוסטט.

הפעילו את משאבת היציאה ואספו את התרבית בשלב הצמיחה המעריכי. בדקו את הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 nanometers מתוך צינור היציאה. לאחר מכן, הפעילו את משאבת הכניסה.

בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית באורך גל של 600 nanometers מצינור היציאה בכל 24 שעות. לאחר הפעלת הכמוסטט למשך 96 שעות, המהוות 9.6 מחזורי החלפה מלאים, החלף את מיכל המאגר לריכוז הנמוך ביותר של מצע עקה גבוהה. בעת החלפת המאגר למצע בעקה גבוהה יותר, התאים עלולים לחוות הלם.

אם צפיפות התאים נמוכה מדי, הפסיקו את ההזנה של מצע העקה הגבוה למשך זמן מה כדי לשחזר את צפיפות התאים. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ-0.2, הפסיקו את פעולת משאבת הכניסה להזנה למשך שש שעות. הפעילו מחדש את משאבת הכניסה ובדקו שהצפיפות האופטית היא מעל 0.2.

העלה בהדרגה את ריכוז הגורם למעץ על ידי מעבר הדרגתי למאגר המכיל ריכוז גבוה יותר של הגורם למעץ. דגום מהתרבית המותאמת בכל פעם שהיא מגיעה לאבן דרך של הסתגלות למעץ, ואחסן את הדגימות לניתוח גנומי בהמשך. לאחסון הדגימה, ערבב 0.5 milliliter מהתרבית עם 0.5 milliliters של תמיסת glycerol 80% סטרילית ואחסן אותה בטמפרטורה של 80 degrees celsius.

הכינו מצע ג'לטין (אגר) בריכוז 1.6% המכיל את אותו גורם עקה ובאותו ריכוז כפי שמופיע במצע. פזרו 0.1 מיליליטר מהתרבית שיוצאה מהכימוסטט והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך 16 שעות. לאחר ההדגרה, בחרו מושבות בודדות מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי והחדירו אותן למבחנות ניסוי בנפח 15 מיליליטר המכילות את אותו גורם עקה ובאותו ריכוז מצע כפי שהיה בכימוסטט.

דגרו במשך שש שעות. העבירו מיליליטר אחד של מרק התרבית לבקביע ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של מצע. אספו 0.5 מיליליטר של מרק התרבית בכל שעה ומדדו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר.

השוו את קצב הצמיחה של הזן המותאם לזה של זן הפרא בנוכחות הגורם למתח. זן ה-E.coli מסוג פרא עבר אבולוציה בתנאי מתח של ריכוז סוקצינאט גבוה במשך 270 ימים, מה שמתאים לכמעט 930 דורות. בכל פעם שנוסף מתח סוקצינאט גבוה יותר, ריכוז הביומסה ירד באופן מיידי ולאחר מכן שוב חזר למצבו הקודם.

מוצגת כאן תרשים סכמטי של הכימואסטט עם מוטציה העמידה למעקה גבוה של סוקצינאט. מרבית תאי הסוג הפראי נשטפים החוצה בתנאי המעקה והמוטנט גדל יותר. בסופו של דבר, אוכלוסיית צאצאי המוטינט גדלה.

המוטציות השנייה והשלישית נבחרות באופן רציף ובסופו של דבר שולטות בכימוסטט. איור זה מראה שהזן המותאם צמח ללא השהיה בתנאי עקה של ריכוז סוקצינאט גבוה, בעוד שהזן הפראי לא צמח. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מיושמת לאבולוציה מעבדתית אדפטיבית באמצעות כימוסטט עם שונות של גורמי עקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשיג ולהוות את המיקרואורגניזם תחת תנאי ספציפיים. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בתוך מספר חודשים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלא לשטוף החוצה תאי כימוסטט על ידי הוספת עקה רבה מדי בבת אחת, ולהקפיד לבדוק את הצפיפות האופטית מדי יום.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון ניתוח גנומי וניתוח טרנסקריפטומי במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון איזו מוטציה תורמת לאבולוציה של עמידות לעקה?