Name: נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: למד אבולוציה מעבדתית מסתגלת של מיקרואורגניזמים באמצעות תרבות Chemostat. שיטה זו מאפשרת מיון רציף של צאצאים מותאמים ומספקת תובנות לתגובות ללחץ והנדסה מטבולית ב-E. coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך כספית על ידי משרד המדע, התקשוב והתכנון העתידי של קוריאה (תוכנית המרכז לביולוגיה סינתטית אינטליגנטית 2012M3A6A8054887). פ. קים נתמך על ידי מלגה מהאוניברסיטה הקתולית של קוריאה (2015).

1. הכנת ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צנצנת chemostat (150-250 מ&quot;ל) או בקבוק Erlenmeyer (250 מ&quot;ל) המכיל יציאת כניסת ויציאת לשקע. חברו את יציאות עם צינורות סיליקון המאפשר ספיקות של 10-100 מ&quot;ל / שעה. לחלופין, להשתמש פורקן אוויר, יציאת האוויר, ויציאות לשקע כניסת מים בטמפרטורה מבוקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מכשיר מתאים את צנצנת chemostat המספקת שליטת תסיסה והטמפרטורה (או להשתמש חממה רועדת סיבובית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג שתי משאבות פריסטלטיות כדי לספק בינוני טרי ולאסוף את התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צנצנת מאגר (10-20 L) המכילה יציאת בינוניים יציאת כניסת אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צינורות סיליקון מתאים שיעור הדילול (כלומר, מ&quot;מ 0.8 מזהה, מגוון זרימת .06-36 מ&quot;ל / דקה; L / צינורות S 13). </li></ol> הכנה בינונית 2. ועיקור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.3 גלוקוז גרם, 0.08 גרם NH 4Cl, 0.05 גרם NaCl, 0.75 גרם Na 2 4 HPO · 2H 2 O, ו -0.3 גרם KH 2 PO 4 ב 90 מ&quot;ל מים מזוקקים (DW) בצנצנת chemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוגרים את הצנצנת chemostat יחד עם צינורות באמצעות מלחציים. אין לאטום את פתח האוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את צנצנת chemostat ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר העיקור, לאחסן בצנצנת chemostat בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.02 גרם MgSO 4 · 7H 2 O, 0.01 גרם CaCl 2, ו תיאמין 0.1 מ&quot;ג ב 10 מ&quot;ל DW (פתרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון סינון באמצעות מזרק מסנן מזרק מראש מעוקרים (מסנן נקבובי 0.45 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון filtrates לצנצנת chemostat. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 30 גרם גלוקוז, 8 גרם NH 4 Cl, 5 גרם NaCl, 75 גרם Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 גרם KH 2 4 פו, hexahydrate succinate Disodium 300 גרם (Na 2 · succinate · 6H &lt;sub&gt; 2 O; הדחק השתמשו בניסוי זה) ב 9.9 L DW בצנצנת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוגרים את הצנצנת המאגר יחד עם צינורות באמצעות מלחציים. אין לאטום את פתח האוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את צנצנת המאגר ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר העיקור, לאחסן בצנצנת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2 גרם MgSO 4 · 7H 2 O, CaCl גרם 1 2, ו -10 מ&quot;ג תיאמין 100 מ&quot;ל DW (פתרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מסנן עם מזרק מזרק מסנן מראש מעוקרים (מסנן 0.45 מיקרומטר נקבובית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון filtrates לצנצנת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לחבר את צינורות סיליקון מעוקר לצנצנת המאגר ולצרף המשאבות peristaltic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מתח גבוה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום כאמור בסעיף 2.2, אבל עם ריכוז גדול יותר של עקה (כלומר, 3-5 גר &#39;/ ל גבוהה של הסתגלות succinate). הערה: פרוטוקול זה הוא להסתגלות מתח הבבית יכול להיות מועבר דרך המדיום. במקרה של לחצים פיזיים כגון טמפרטורה, תסיסה, או תאורה, טיפוח צריך להיות מתוכנן בהתאם. </li></ol></li></ol> 3. טיפוח ראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של wild-type E. coli במבחנה 15 מ&quot;ל המכיל 4 מ&quot;ל של מדיום הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת המבחנה בתוך חממת רעד במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 1 מ&quot;ל של preculture לצנצנת chemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צנצנת chemostat, מתן אוורור (50 מ&quot;ל אוויר / min) תסיסה (200 סל&quot;ד), ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. </li></ol> הסתגלות מתח 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, חבר את הקצה של הצינור סיליקון מהמשאבות לצנצנת chemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה לשקע (10 מ&quot;ל / שעה ומעלה) ולאסוף תרבות. הערה: התרבות צריכה להיות בשלב המעריכים, בדרך כלל 4-8 שעות לאחר טיפוח ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ChEck הצפיפות האופטית (600 ננומטר) של התרבות מן הצינורות המוצאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת כניסת (10 מ&quot;ל / שעה, המתאים לשיעור של דילול של 0.1 hr -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר משקע צינורות כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את chemostat למשך 96 שעות (מחזור 9.6-פי) או יותר. אם הצפיפות האופטית היא יציבה, להחליף את המאגר המכיל את מדיום המתח הגבוה. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ -0.2, להפסיק את משאבת כניסת האכלת 6 שעות. הפעל מחדש את משאבת הכניסה ולבדוק כי הצפיפות האופטית היא מעל 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה להגדיל את הריכוז של גורם הדחק ידי שינוי למאגר המכיל ריכוז גבוה מלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דגימות של התרבות המותאמת בכל פעם שהוא מגיע ציון דרך (למשל, זן מותאם 100 גר &#39;/ ל מתח succinate), ולאחסן לניתוח גנומי נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אחסון מדגם, לערבב המדגם תרבות (0.5 מ&quot;ל) עם soluti גליצרול 80% מעוקריםעל (0.5 מ&quot;ל) ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: אם מיקרואורגניזם רוכש יכולת לבזות את הלחץ במהלך תהליך ALE, ריכוז הלחץ בתוך מכל התסיסה אינו זהה לזה במאגר הטרי. </li></ol> 5. בידוד חד מושבה של הזנים מותאם-מתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני צלחת אגר (1.6% אגרו) המכיל את אותו לחץ ובאותו הריכוז בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תרבות לשקע (0.1 מ&quot;ל) מן chemostat, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות אחת מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי ולחסן אותם 15 מ&quot;ל מבחנות המכילות אותו הדחק ובאותו ריכוז בינוני כמו chemostat, דגירה במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של מרק התרבות לתוך בקבוק 250 מ&quot;ל Erlenmeyer המכיל 50 מ&quot;ל של מדיום. קציר 0.5 מ&quot;ל של מרק התרבות בכל שעה 1, ולמדוד את OD ב 600 ננומטר. השווה את שיעור הצמיחה של strai המותאםn לזה של זן פראי סוג נתון גורם הדחק. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מיקרואורגניזמים הם יהיו מסוגלים להתאים כמעט לכל סביבות בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם המגוון הגנטי. אבולוצית מעבדה מסתגלת מאפשרת מיקרואורגניזמים להתפתח בתנאים תוכנן, אשר מספק דרך בחירת אורגניזמים בודדים מחסה מוטציות ספונטניות שאינן מועילים בתנאים הנתונים. טכניקת chemostat היא חזקה יותר להשגת התפתחות מונעת באופן מלאכותי מאשר טכניקות העברה מהסיבות הבאות: (א) סביבה יציבה - כי טכניקות העברה מבוססות על תרבויות יצוו או על ...

מיקרואורגניזמים יכול לשרוד ולהסתגל סביבות מגוונות. תחת לחץ חמור, הסתגלות יכולה להתרחש באמצעות רכישת פנוטיפים מועילים ידי מוטציות גנומי אקראיות סלקציה חיובית לאחר 1-3. לכן, תאים מיקרוביאליים יכול להתאים על ידי שינוי מטבולי או רשתות רגולטוריות לצמיחה אופטימלית, אשר נקרא &quot;התפתחות מסתגלת&quot;. נטיות חיידקים חשובות אחרונות, כגון התפרצויות של חיידקים לבין ההתרחשות של זנים של חיידקים חזקים, הם קרובים מאוד אדפטיבית אבולוציה בתנאים מלחיצים. בתנאי מעבדה מוגדרים, אנו מסוגלים ללמוד את המכניזם של אבולוציה מולקולרית ואף לשלוט על הכיוון של אבולוצית חיידקים עבור יישומים שונים. בניגוד יצורים רב-תאיים, חד תאיים אורגניזמים מתאימים גם לאבולוציה מעבדה אדפטיבית (ALE) מהסיבות הבאות: הם להתחדש במהירות, הם שומרים על אוכלוסיות גדולות, וזה קל ליצור ולתחזק Homסביבות ogeneous. בשילוב עם התקדמות טכניקות רצפי DNA וטכנולוגיות תפוקה גבוהה, ALE מאפשר תצפית הישירה של שינויים גנומית להוביל שינויים רגולטוריים מערכתיים. דינמיקה מוטציוני ומגוון מהאוכלוסייה הם גם נצפה. אסטרטגיות הנדסה גנטית ניתן לקבוע מניתוח זני ALE 4,5. תרבות Chemostat היא שיטה המשמשת כדי להשיג תאים יציבים ולהגדיל את הפרודוקטיביות תהליכי תסיסה 6. מדיום חדש מתווסף מרק התרבות שנקטף במהלך התהליך (האחרון כולל בינוניות ביומסה). לתרבות לטווח ארוך chemostat, לעומת זאת, משנה את הפרודוקטיביות היציב של התרבות ומביא על הצטברות של מוטציות ספונטניות ובחירת במהלך התרבות (איור 1 א). תחת לחץ ברירה שונה (לחצים), ההצטברות של מוטציות היא משופרת. עלייה הדרגתית של הלחץ לטווח ארוך<html> chemostat מספק מבחר רציף של מוטציות שפועלות נגד גורמי הלחץ הנתונים, כגון טמפרטורה, pH, לחץ האוסמוטי, הרעבה מזינה, חמצון, מוצרי קצה רעילים, וכו &#39;העברת קולוני מתוך בינוני מוצק והעברה סידורית של מדיום נוזלי (חזר תרבות אצווה) גם לאפשר לחוקרים לקבל מיקרואורגניזמים התפתחו (איור 1b ו 1c). למרות שתרבות chemostat דורשת שיטות מסובכות, הברכה של גיוון (מספר חזרות וגודל אוכלוסייה) הוא גבוהה יותר מזה שהושג באמצעות עברת מושבה וטכניקות העברת סדרתי. חשיפת המתח היציבה תאים בודדים וירידת וריאציה במדינת הסלולר במהלך תרבות chemostat (מצב יציב) יתרונות אחרים של ALE לעומת טכניקות התרבות מבוססת יצווה. ALE-induced מתח של Escherichia coli נתון בתנאי succinate גבוהים הוא הציג במאמר זה. Iles / ftp_upload / 54,446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: שיטות של האבולוציה מעבדה אדפטיבית (א) Chemostat;. (ב) העברת סדרתי; (ג) העברת המושבה. הדמויות העליונות להמחיש את הרעיון של שיטות ALE, ואת הדמויות התחתונות להמחיש את מספר התאים גדלו במהלך ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>מיני-כימוסטט תסיסה</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>מיוצר על ידי</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון בהזמנה מיוחדת</td> ניתן לשנות את גודל הצינורות <td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>בהתאם לקצב הדילול וגודל צנצנת התסיסה.</td></tr><tr><td>צנצנת מאגר</td><td></td><td>Bellco Media אחסון בקבוק 20</td><td>ליטר</td></tr><tr><td>כימיקלים</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>'-</td><td>ריאגנט</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td>מגיב ACS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>לביולוגיה מולקולרית, מתאים לתרבית תאים, &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>מגיב ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>מגיב ACS, &ge; 99%</td></tr> <tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>מגיב ACS, &ge; 98%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>מגיב ACS, &ge; 96%</td></tr> <tr><td>תיאמין ו-middot; HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>דרגת ריאגנט, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2&middot; סוקסינט ומידוט; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr></tbody></table>

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש chemostat

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

אבולוציה טבעית כרוכה במגוון גנטי כגון שינוי סביבתי ובחירה בין אוכלוסיות קטנות. אבולוציה מעבדתית אדפטיבית (ALE) מתייחסת למצב הניסויי שבו נצפית אבולוציה באמצעות אורגניזמים חיים בתנאים מבוקרים וגורמי לחץ; כך אורגניזמים נאלצים באופן מלאכותי לבצע שינויים אבולוציוניים. מיקרואורגניזמים נתונים למגוון גורמי לחץ בסביבה ומסוגלים לווסת חלבונים מסוימים המעוררים לחץ כדי להגדיל את סיכויי ההישרדות שלהם. מוטציות ספונטניות המתרחשות באופן טבעי מביאות לשינויים בגנום של מיקרואורגניזם המשפיעים על סיכויי ההישרדות שלו. חשיפה ארוכת טווח לתרבית כימוסטט מעוררת הצטברות של מוטציות ספונטניות והופכת את הזן המסתגל ביותר לדומיננטי. בהשוואה לשיטות העברת המושבה וההעברה הסדרתית, תרבית כימוסטט כרוכה במספר הגבוה ביותר של חלוקות תאים, ולכן במספר הגבוה ביותר של אוכלוסיות מגוונות. למרות שתרבית כימוסטט עבור ALE דורשת מכשירי תרבית מסובכים יותר, היא פחות אינטנסיבית לעבודה ברגע שהניתוח מתחיל. ניתוחים גנומיים וטרנסקריפטומים השוואתיים של הזן המותאם מספקים רמזים אבולוציוניים לגבי האופן שבו גורמי הלחץ תורמים למוטציות המתגברות על הלחץ. מטרת המאמר הנוכחי היא להביא לאבולוציה מואצת של מיקרואורגניזמים בתנאי מעבדה מבוקרים.

להסתגלות מתח גבוה-succinate, סוג-בר E. coli W3110 זן היה בתרבית chemostat בבית D = 0.1 hr -1 עבור 270 ימים (איור 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> איור 2: הסתגלות מתח גבוה-succinate של E. coli W3110 באמצעות תרבות chemostat. חיצים Thin לציין את הזמנים שבהם ריכוז הדחק הוגדל, וחצים ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג אבולוצית מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים בתנאים באמצעות תרבות chemostat. כמו כן, ניתוח גנטי של הזן התפתח נדון.

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר למיקרואורגניזם להתפתח בתנאי מעבדה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון קשרי תפקוד של בלוטת האדרנלין, תגובות למעמדים (stress responses), הנדסה מטבולית, וכמובן, אבולוציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא סלקציה רציפה של הצאצא המותאם ביותר תחת תנאי מעבדה ספציפיים.התחילו את ההליך בהכנת הציוד, וכן את מצע ההתחלה, מצע העקה ומצע העקה גבוהה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. זרעו מושבה בודדת של E.coli מסוג wild type בתוך מבחנה בנפח 15 מיליליטר המכילה 4 מיליליטר של מצע התחלה. דגרו את המבחנה באינקובטור עם ניעור למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 220 rpm.דגרו את כלי הכמוסטט (chemostat jar) תוך אספקת אוורור וערבוב בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות. לאחר הדגירה, חברו באופן אסיפטי את קצה צינור הסיליקון מהמשאבות לכלי הכמוסטט. העבירו באופן אסיפטי 1 mL של תרבית מקדימה (pre-culture) אל כלי הכמוסטט.הפעילו את משאבת היציאה ואספו את התרבית בשלב הצמיחה המעריכי. בדקו את הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 nanometers מתוך צינור היציאה. לאחר מכן, הפעילו את משאבת הכניסה.בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית באורך גל של 600 nanometers מצינור היציאה בכל 24 שעות. לאחר הפעלת הכמוסטט למשך 96 שעות, המהוות 9.6 מחזורי החלפה מלאים, החלף את מיכל המאגר לריכוז הנמוך ביותר של מצע עקה גבוהה. בעת החלפת המאגר למצע בעקה גבוהה יותר, התאים עלולים לחוות הלם.אם צפיפות התאים נמוכה מדי, הפסיקו את ההזנה של מצע העקה הגבוה למשך זמן מה כדי לשחזר את צפיפות התאים. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ-0.2, הפסיקו את פעולת משאבת הכניסה להזנה למשך שש שעות. הפעילו מחדש את משאבת הכניסה ובדקו שהצפיפות האופטית היא מעל 0.2.העלה בהדרגה את ריכוז הגורם למעץ על ידי מעבר הדרגתי למאגר המכיל ריכוז גבוה יותר של הגורם למעץ. דגום מהתרבית המותאמת בכל פעם שהיא מגיעה לאבן דרך של הסתגלות למעץ, ואחסן את הדגימות לניתוח גנומי בהמשך. לאחסון הדגימה, ערבב 0.5 milliliter מהתרבית עם 0.5 milliliters של תמיסת glycerol 80% סטרילית ואחסן אותה בטמפרטורה של 80 degrees celsius.הכינו מצע ג'לטין (אגר) בריכוז 1.6% המכיל את אותו גורם עקה ובאותו ריכוז כפי שמופיע במצע. פזרו 0.1 מיליליטר מהתרבית שיוצאה מהכימוסטט והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך 16 שעות. לאחר ההדגרה, בחרו מושבות בודדות מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי והחדירו אותן למבחנות ניסוי בנפח 15 מיליליטר המכילות את אותו גורם עקה ובאותו ריכוז מצע כפי שהיה בכימוסטט.דגרו במשך שש שעות. העבירו מיליליטר אחד של מרק התרבית לבקביע ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של מצע. אספו 0.5 מיליליטר של מרק התרבית בכל שעה ומדדו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר.השוו את קצב הצמיחה של הזן המותאם לזה של זן הפרא בנוכחות הגורם למתח. זן ה-E.coli מסוג פרא עבר אבולוציה בתנאי מתח של ריכוז סוקצינאט גבוה במשך 270 ימים, מה שמתאים לכמעט 930 דורות. בכל פעם שנוסף מתח סוקצינאט גבוה יותר, ריכוז הביומסה ירד באופן מיידי ולאחר מכן שוב חזר למצבו הקודם.מוצגת כאן תרשים סכמטי של הכימואסטט עם מוטציה העמידה למעקה גבוה של סוקצינאט. מרבית תאי הסוג הפראי נשטפים החוצה בתנאי המעקה והמוטנט גדל יותר. בסופו של דבר, אוכלוסיית צאצאי המוטינט גדלה.המוטציות השנייה והשלישית נבחרות באופן רציף ובסופו של דבר שולטות בכימוסטט. איור זה מראה שהזן המותאם צמח ללא השהיה בתנאי עקה של ריכוז סוקצינאט גבוה, בעוד שהזן הפראי לא צמח. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מיושמת לאבולוציה מעבדתית אדפטיבית באמצעות כימוסטט עם שונות של גורמי עקה.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשיג ולהוות את המיקרואורגניזם תחת תנאי ספציפיים. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בתוך מספר חודשים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלא לשטוף החוצה תאי כימוסטט על ידי הוספת עקה רבה מדי בבת אחת, ולהקפיד לבדוק את הצפיפות האופטית מדי יום.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון ניתוח גנומי וניתוח טרנסקריפטומי במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון איזו מוטציה תורמת לאבולוציה של עמידות לעקה?

procedure-for-adaptive-laboratory-evolution-microorganisms-using

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מקור: Jian, X., et al., טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC). J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את השימוש במערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית כדי להניע אבולוציה אדפטיבית של חיידקים לקראת סבילות למתנול. על ידי ערבוב תרביות חיידקים מהונדסות עם מדיום עקה עתיר מתנול ופילוח שלהן למיקרו-טיפות, המערכת בוחרת מוטציות המציגות צמיחה משופרת תחת עקת מתנול. באמצעות מחזורי העשרה איטרטיביים ובידוד מושבה, זני חיידקים מותאמים למתנול מתורבתים להמשך ניתוח...

אבולוציה אדפטיבית של חיידקים באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית

מקור: ג'ונג, ה., ואחרים. הליך לאבולוציה מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים באמצעות כימוסטט. J. Vis. Exp. (2016).הסרטון הזה מדגים את הבידוד והגדילה הסלקטיביים של חיידקים המותאמים ללחץ מתרבות שנחשפו לתנאי לחץ ממושכים. התרבית מצופה על אגר המכיל מלחץ, ומושבה אחת נבחרת להחסן מדיום נוזלי בגורם הלחץ. הספיגה נמדדת במרווחים קבועים כדי לעקוב אחר הצמיחה ולאשר את הבידוד המוצלח של החיידקים המותאמים ללחץ.

בידוד חיידקים מותאמים ללחץ באמצעות סלקציה של מושבה בודדת

שיעור צמיחת תאים הוא תהליך מוסדר וקובע עיקרי של פיזיולוגיה של תא. culturing הרציף באמצעות chemostats מאפשר שליטה חיצונית של שיעור צמיחת תאים על ידי הגבלה תזונתית להקל על הלימוד של רשתות מולקולריות השולטות צמיחת תאים וכיצד רשתות אלה להתפתח כדי לייעל את צמיחת תאים.

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

פתחנו ומאומתים מערך טביעת רגל הקטנה של chemostats מיניאטורי שנבנה מחלקים בקלות רבה זמינים עבור עלות נמוכה. תוצאות התפתחות פיסיולוגיות וניסוייות היו דומות לchemostats נפח הגדול יותר. מערך ministat מספק פלטפורמה קומפקטית, זולה ונגישה לניסויים מסורתיים chemostat, גנומיקה תפקודית, ויישומי הקרנה כימית.

עיצוב ושימוש במערכי Chemostat Multiplexed

אנו מתארים מורבידוסטט בעלות נמוכה וניתן להגדרה המאפשר לאפיין עמידות לתרופות אנטיביוטיות על ידי התאמה דינמית של ריכוז התרופה. ניתן לשלב את המכשיר עם פלטפורמה מיקרופלואידית מרובבת. ניתן להרחיב את הגישה למחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות.

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

מסגרת החברה מאפשרת תרבות רציפה ומיקרוביאלית של תפוקה גבוהה עם רזולוציה גבוהה ושליטה דינמית על פרמטרים ניסיוניים. פרוטוקול זה מדגים כיצד להחיל את המערכת על מנת לבצע ניסוי כושר מורכב, המנחה את המשתמשים בתיכנות אוטומטי של שליטה על תרבויות בודדות, מדידת, איסוף ואינטראקציה עם נתונים ניסיוניים בזמן אמת.

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.

טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשמור על ניסוי האבולוציה לטווח ארוך של Escherichia coli (LTEE) על ידי ביצוע ההעברות היומיות והקפאות תקופתיות שלו, וכיצד לבצע מבחני תחרות למדידת שיפורי כושר בחיידקים מפותחים. הליכים אלה יכולים לשמש כתבנית לחוקרים המתחילים ניסויים משלהם באבולוציה מיקרוביאלית.

העברות יומיות, אחסון אוכלוסיות בארכיון ומדידת כושר בניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם Escherichia coli

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.

הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius

אנו מציגים פרוטוקול למכשיר תרבית רציפה מיליפלואידי (MCCD), המאפשר גידול אוכלוסיות חיידקים בתנאים קבועים עם דלי חומרים מזינים (עד למאות ריכוזים ננומולריים) או בתנודות תזונה זמניות בקנה מידה זעיר.

מכשיר מיליליפלואידי מתרבות רציפה לחקר אשריכיה קולי בתנאים תזונתיים נמוכים ומשתנים

למד אבולוציה מעבדתית מסתגלת של מיקרואורגניזמים באמצעות תרבות Chemostat. שיטה זו מאפשרת מיון רציף של צאצאים מותאמים ומספקת תובנות לתגובות ללחץ והנדסה מטבולית ב-E. coli.

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

גלה סרטונים נוספים