נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat
September 20th, 2016
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג אבולוצית מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים בתנאים באמצעות תרבות chemostat. כמו כן, ניתוח גנטי של הזן התפתח נדון.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר למיקרואורגניזם להתפתח בתנאי מעבדה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון קשרי תפקוד יותרת הכליה, תגובות לחץ, הנדסה מטבולית וכמובן אבולוציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בחירה מתמשכת של הצאצא המשוכנע ביותר בתנאי מעבדה ספציפיים.
התחל הליך זה בהכנת ציוד, כמו גם מדיום ראשוני, מדיום מתח בינוני ומדיום מתח גבוה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חסנו מושבה בודדת או E.coli מסוג בר במבחנה של 15 מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטר של מדיום ראשוני. דגרו את המבחנה בחממה רועדת למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד.
דגרו על צנצנת הכימוסטט המספקת אוורור ותסיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. לאחר הדגירה, חבר באופן אספטי את קצה צינור הסיליקון מהמשאבות לצנצנת הכימוסטט. העבירו באופן אספטי מיליליטר אחד של תרבית מוקדמת לצנצנת הכימוסטט.
הפעל את משאבת היציאה ואסוף את התרבות בשלב האקספוננציאלי. בדוק את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של התרבית מצינור היציאה. לאחר מכן, הפעל את משאבת הכניסה.
בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 ננומטר מצינור היציאה כל 24 שעות. לאחר הפעלת הכימוסטט במשך 96 שעות, שהוא מחזור מלא של 9.6, החלף את המאגר לריכוז הנמוך ביותר של מדיום מתח גבוה. כאשר אתה מחליף את המאגר למדיום מתח גבוה יותר, התאים עלולים להיות בהלם.
אם צפיפות התאים נמוכה מדי, הפסק להזין את מדיום הלחץ הגבוה יותר למשך זמן מה כדי להחזיר את צפיפות התא. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ-0.2, עצור את משאבת כניסת ההזנה למשך שש שעות. הפעל מחדש את משאבת הכניסה ובדוק שהצפיפות האופטית היא מעל 0.2.
הגדל בהדרגה את ריכוז גורם הלחץ על ידי שינוי הדרגתי למאגר המכיל ריכוז גבוה יותר של גורם הלחץ. קח דגימות של התרבית המותאמת בכל פעם שהיא מגיעה לאבן דרך של הסתגלות ללחץ ואחסן לניתוח גנומי נוסף. לאחסון דגימה, מערבבים את דגימת התרבית של 0.5 מיליליטר עם 0.5 מיליליטר של תמיסת גליצרול מעוקרת של 80% ומאחסנים אותה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.
הכן מדיום צלחת 1.6% המכיל את אותו גורם לחץ באותו ריכוז כמו במדיום. צלחת 0.1 מיליליטר של תרבית היציאה מהכימוסטט ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר הדגירה, בחר מושבות בודדות מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי וחסן אותן במבחנות של 15 מיליליטר המכילות את אותו גורם לחץ ובאותו ריכוז בינוני כמו בכימוסטט.
דגירה במשך שש שעות. העבירו מיליליטר אחד של מרק התרבות לבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר בינוני. קצרו 0.5 מיליליטר ממרק התרבות בכל שעה ומדדו את הצפיפות האופטית ב -600 ננומטר.
השוו את קצב הגידול של הזן המותאם לזה של זן הבר בהינתן גורם הלחץ. זן ה-E.coli מסוג הבר התפתח במצב של לחץ סוקסינט גבוה במשך 270 יום, המקביל לכמעט 930 דורות. בכל פעם שנוסף מתח סוקסינט גבוה יותר, ריכוז הביומסה הורד מיד ולאחר מכן שוחזר.
מוצגת כאן תרשים סכמטי של הכימוסטט עם מוטנט שהוא סובלני כנגד הלחץ הסוקסינט הגבוה. רוב התאים הפראיים נשטפים בתנאי הלחץ והמוטנט גדל יותר. בסופו של דבר, אוכלוסיית הצאצאים המוטנטיים גדלה.
המוטציות השנייה והשלישית נבחרות באופן רציף עבור הכימוסטט ובסופו של דבר שולטות בו. איור זה מראה כי הזן המותאם גדל ללא דיחוי בתנאי לחץ סוקסינט גבוהים, בעוד שזן הבר לא. ניתן ליישם אסטרטגיה דומה לאבולוציה מעבדתית אדפטיבית באמצעות כימוסטט עם וריאציה של גורמי לחץ.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש ולפתח את המיקרואורגניזם בתנאי מוגדר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר חודשים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לשטוף תאי כימוסטט על ידי הוספת יותר מדי לחץ בבת אחת ולזכור לבדוק את הצפיפות האופטית מדי יום.
בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות כמו ניתוח גנום וניתוח טרנסקריפטום על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזו מוטציה תורמת לאבולוציה של סובלנות ללחץ?
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להתפתחות מעבדתית הסתגלותית של מיקרואורגניזמים באמצעות תרבית כימוסטט. הוא דן בניתוח הגנומי של הזן שהתפתח ובהשלכותיו בתחום המיקרוביולוגיה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- התפתחות מעבדתית
- ניתוח גנומי
רקע
- התפתחות מעבדתית הסתגלותית מאפשרת למיקרואורגניזמים להתפתח בתנאים מבוקרים.
- שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תגובות ללחץ והנדסה מטבולית.
- בחירה מתמדת של צאצאים משפרת את המחקר של תהליכים אבולוציוניים.
- הכנה ראשונית של המדיה היא חיונית ליישום מוצלח.
מטרת המחקר
- לאפשר למיקרואורגניזמים להתפתח בסביבת מעבדה.
- לחקור את הקשרים בין תגובות לחץ והתאמות אבולוציוניות.
- להקל על מחקרים של הנדסה מטבולית.
שיטות בשימוש
- הכנת מדיה ראשונית, מדיה תחת לחץ ומדיה תחת לחץ גבוה.
- חיסון של E. coli במבחנה עם מדיום ראשוני.
- דגירה במדגרה מטלטלת בתנאים מוגדרים.
- מעקב רציף אחר התפתחות מיקרוביאלית.
תוצאות עיקריות
- התפתחות מוצלחת של מיקרואורגניזמים בתנאים מבוקרים.
- תובנות לגבי מנגנוני תגובה ללחץ.
- יישומים פוטנציאליים בהנדסה מטבולית.
- ניתוח גנומי מגלה התאמות בזנים שהתפתחו.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר התפתחות מעבדתית יעילה של מיקרואורגניזמים.
- התוצאות תורמות להבנת ההתאמות המיקרוביאליות.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על שאלות מחקר שונות במיקרוביולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Adaptive laboratory evolution using chemostat culture enables continuous selection of microbial strains under controlled stress conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach generates diverse populations through high cell division rates, improving predictive confidence for strain engineering and pathway optimization. The method facilitates translational continuity by linking laboratory evolution to genomic and transcriptomic analysis for identifying adaptive mutations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stressor-induced evolution and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dominant adaptive strains under selective pressure.
- Predictive Value: Generates diverse mutant populations for functional target validation and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized stress-tolerant phenotypes for downstream screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through continuous culture and defined stressor gradients.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple stressors and microbial hosts for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects evolved strain phenotypes to genomic changes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides evolutionary continuity from discovery through preclinical validation via traceable adaptation milestones.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking stress tolerance to specific mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by continuous selection and genomic analysis outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled stressor exposure and mutant enrichment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cultures with quantitative optical density monitoring for strain comparison.
- Analytics: Enables comparative genomic and transcriptome analysis to identify mutations contributing to stress tolerance.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical continuity through documented adaptation milestones and cryopreserved samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evolving microorganisms under varying stressors across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in strain engineering by revealing mechanisms of stress adaptation.
- Operational Value: Reduces labor intensity post-setup through automated continuous culture and defined sampling intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking evolutionary outcomes to genomic drivers of fitness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated adaptive mutations and growth performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, chemostat operation, and aseptic technique.
- Depends on instrumentation for precise pump control, aeration, agitation, and optical density monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for media preparation, stressor gradients, and sampling protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains to shake-flask or plate-based validation assays.
- Includes practical limitations such as cell washout risk under excessive stress and the need for daily optical density checks to maintain culture stability.
