תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה Chlamydomonas reinhardtii

המטרה הכוללת של ההליך היא להשתמש ברובוטיקה ובבדיקות סטנדרטיות כדי לייעל את הבידוד של מוטציות קטלניות רגישות לטמפרטורה בכלמידומונס על מנת לקבוע גנים ומסלולים חיוניים באורגניזם זה. אנו מתעניינים הן בשימור והן בסטייה של תפקודים תאיים חיוניים באיקריוטים. והדרך שבה אנו אוהבים לחקור זאת היא באמצעות מוטציות המשבשות גנים חיוניים בתהליכים אלה.

כדי שזה יעבוד טוב, אתה צריך אוסף מקיף באמת של מוטאנטים והשיטות שתשמעו עליהן הן הדרך שלנו ליצור אוסף כזה. אנו עובדים באצות הירוקות Chlamydomonas reinhardtii כנציג של ממלכת הצומח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למצוא מוטציות קטלניות רגישות לטמפרטורה בכל מסלול חיוני.

השיטה אינה דורשת ידע מוקדם או מוטגנזה ממוקדת. התפקוד המולקולרי של הגן המוטנטי הוצע מיד מהפנוטיפ הקטלני. זה עוזר לנו לבחור מוטציות מעניינות המשבשות מסלולי סיאלה מגוונים מעבר לבקרת מחזור התא.

לביצוע תרבית מוטגנזה UV תאי כלמידומונס עד OD 750 של 0.2 עד 0.5 ב-100 מיליליטר של Tris-Acetate-Phosphate, או TAP, תחת אור ב-25 מעלות צלזיוס ורעידות ב-100 סל"ד. מוטגנזה של UV מבוצעת באופן עצמאי בשני רקעים גנטיים על פי פרוטוקול הטקסט. בדוק דגימה של כל תרבית תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים ברי קיימא וללא זיהום.

לאחר מכן יש לדלל את התרבית ל-OD 750 של 0.003 ואז לעטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי להבטיח צפיפות הומוגנית מכיוון שהזן הוא מודאלי ושוחה בכיוון בתגובה לאור. לאחר התאמת צפיפות המתלה בהתאם לפרוטוקול הטקסט, יש לחבר קלטת צינור קטנה המתאימה למתקן נוזלים ולבצע סדרת שטיפות לסטריליזציה, בהתאם להוראות היצרן, למניעת זיהום. בעזרת קלטת מתקן נוזלים של שמונה מזרקים, חלקו ארבע על 96 טיפות של שני מיקרוליטר כל אחת של תרבית על צלחות מלבניות יבשות.

הקש בעדינות על קצה הצלחת כדי להבטיח מיזוג של כל הטיפות ליריעת נוזל דקה וכסה מיד את הצלחות כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר הייבוש, הניחו את הצלחות מתחת למנורת UV קוטל חיידקים לפרקי זמן שנקבעו אמפירית כדי לתת תשואה אופטימלית של מוטציות ts בקרב הניצולים. לאחר מכן, העבירו את הצלחות לחושך למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הניחו את הצלחות בחממה של 21 מעלות צלזיוס עם תאורה. לאחר כ-10 ימים כאשר המושבות גדלות אך לא ממוזגות, טען את הצלחות בערימה הרלוונטית כמקורות לקטיף מושבות רובוטיות. לאחר מכן בחר מושבות ל -384 מערכים על לוחות מלבניים וגדל אותן ב -21 מעלות צלזיוס עם תאורה למשך כשבוע.

באמצעות רובוט ציפוי העתק, דחסו את מערכי 384 למערך 1536 ואפשרו ללוחות לגדול בחממה של 21 מעלות צלזיוס למשך כשלושה ימים. שכפל את מערכי 1536 לשתי צלחות כל אחת והנח אחד בחממה של 21 מעלות צלזיוס והשני בחממה של 33 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס, שכפל את הלוחות מהחממה של 33 מעלות צלזיוס לקבוצה חדשה של צלחות מחוממות מראש והנח אותן בחממה של 33 מעלות צלזיוס.

לאחר שלושה ימים של צמיחה ב-33 מעלות צלזיוס וחמישה ימים של צמיחה ב-21 מעלות צלזיוס, השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לצלם לוחית רשת המסומנת בתשעה מחווני יישור. לאחר מכן צלם את הלוחות, לסירוגין לוחות של 21 מעלות צלזיוס ואחריהם לוחות 33 מעלות צלזיוס המתאימים כאשר כל הלוחות מונחים במסגרת קבועה כדי לשמור על כיוון מדויק. עבד את התמונות המותאמות של 21, 33 לוחות עם תוכנת ניתוח תמונות מעבדה מט מותאמת אישית כדי לבטל את הרקע ולפלח את התמונות למערך 1536.

התוכנית תקבע את הביו-מסה שזוהתה כעוצמת פיקסלים כוללת בכל מיקום. טען את רשימת המושבות הנבחרות שנוצרו על ידי התוכנה כקובץ הוראות לרובוטיקה של בחירת מושבה בודדת. לאחר מכן הכינו את לוחות המקור והמטרה בהתאם להוראות הרובוטיקה ואפשרו לרובוט לבחור את המושבות שנבחרו למערך.

הנח את לוחות המטרה בחממה של 21 מעלות צלזיוס למשך כחמישה ימים כדי לגדל צלחת ציר. לאחר ביצוע בדיקת הצטברות ביומסה שנייה ושכפול 100 לוחות בלוקים לפי פרוטוקול הטקסט, שכפל את העותק הטרי של 100 לוחות הבלוק לשלושה עותקים. לאחר הגדרת הלוח השלישי ברובוט, ואיתור המושבות, צלמו מיקרוגרפים של אזור בכל נקודה של לוחות ההקרנה לפעמים אפס והניחו את הלוחות ב-33 מעלות צלזיוס לדגירה.

בנקודות זמן משתנות לאחר הסרת לוחות ההקרנה מהחממה של 33 מעלות צלזיוס, צלם במהירות מיקרוגרפים וודא שמחזיק הצלחת ובקר הבמה מכוילים במדויק כדי לקבל תמונות של אותם תאים בכל נקודת זמן. נתח תמונות מיקרוסקופיות ובחר מוטציות על סמך הקריטריונים הרצויים. אתר את הסט הסופי שנבחר בצלחת אגר מסודרת 96, וודא שכל צלחת מכילה מוטציות מאותו סוג הזדווגות ועמידות לתרופות.

העבירו כמויות גדולות של המושבות המסודרות למדיום אינדוקציה נטול חנקן על 96 מיקרו-צלחות באר. דגרו את הצלחות תחת אור למשך כחמש שעות כדי לאפשר גמטוגנזה. השעו שאילתות עם סוגי ההזדווגות המנוגדים המכילים את קלטות ההתנגדות האלטרנטיביות לצינורות עם מדיום אינדוקציה גמט נטול חנקן לגמטוגנזה.

מערבבים את הדגימות מצלחת מטרה בנפח תערובת הזדווגות של 20 מיקרוליטר. לאחר כ-10 דקות תחת האור, הבחין פעמיים בחמישה מיקרוליטר מכל באר. פעם אחת על צלחת TAP לבדיקת הצמדה ופעם אחת על TAP פלוס חמישה מיקרומול פארו ועוד תשעה מיקרומול היגרו לבדיקת השלמה.

לאחר הדגירה של לוחות בדיקת ההשלמה, שכפל את הלוחות לשני עותקים לזיהוי פנוטיפ ts. בדוק מושבות לפנוטיפ ts על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר הקרנה של תאים בודדים של כלמידומונס, התאים מורשים לגדול במשך עשרה ימים בטמפרטורה מתירנית, ואז נקטפים בפורמט מסודר, כפי שניתן לראות כאן.

הלוחות המתקבלים בפורמט 384 מתמזגים למערך 1536. שלושה זמני חשיפה ל-UV נבדקו ליצירת מוטציות Chlamydomonas ts. מבחינה אמפירית, זמן החשיפה של 1.5 דקות הניב הכי הרבה מוטאנטים.

עם זאת, ללא ספק, זמן החשיפה של דקה אחת הניב את רוב המועמדים למחזור התא. בניסוי זה בוצעו שתי בדיקות פנוטיפ TS עוקבות וכ-3000 מוטציות TS בודדו ואופיינו פנוטיפ במיקרוסקופיה שחלפה זמן. כפי שניתן לראות כאן, כדי להסיר גנים חוזרים מאוד מהצינור במורד הזרם, בוצעו בדיקות השלמה וקישור עם גנים שכבר אופיינו עם יותר משני אללים, כנגד מועמדים חדשים שנאספו.

מושבות אלה אינן משלימות את השאילתה ולכן הן אללים חדשים של ts עבור הגן הנשאל. אלה בדרך כלל אינם נכללים באפיון נוסף. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע בתפוקה גבוהה.

ניתן לבודד אלפי מוטציות TS רק בשניים או שלושה סבבי מוטגנזה. צעד מפתח לאחר בידוד המוטציות TS הוא בחירת תת-קבוצה למחקר נוסף ומעניין מאוד לראות את מגוון הפנוטיפים הקטלניים. פנוטיפ מספק רמזים לתפקוד מולקולרי וגם עוזר לנו לתעדף מוטציות למחקר נוסף.

זכור שלמוטאנטים יכולות להיות מאות או אלפי מוטציות בגנום שלהם. בדרך כלל רק אחת היא סיבתית, אם כי לפעמים נדרשות שתי מוטציות לפנוטיפ ts וניתן לקבוע זאת על ידי ניתוח טטרה. בעקבות הליך זה, ניתן לזהות מוטציות סיבתיות על ידי ניתוח ריצוף של הדור הבא של הגנים שזוהו יהיו לפעמים מוטציות המצביעות על תפקוד או שהם יכולים להיות רצפים חדשים ולא ידועים, וזה מעניין ומרגש.

כלמידומונס הייתה מערכת מודל נהדרת לחקר הביולוגיה של התא בממלכת הצומח. ההליכים ששמעתם עליהם אמורים לפתוח את המחקר של אורגניזם זה לתהליכים חיוניים שלא נבדקו באופן יחסי ואנו מקווים שהתוצאות יהיו רלוונטיות גם לממלכת הצמחים הרחבה יותר.