תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה

המטרה הכוללת של הפרוצדורה היא להשתמש ברובוטיקה ובבדיקות סטנדרטיות כדי לייעל את בידודן של מוטציות קטלניות הרגישות לטמפרטורה ב-Chlamydomonas, וזאת במטרה לקבוע גנים ומסלולים חיוניים באורגניזם זה. אנו מעוניינים הן בשימור והן בשונות של תפקודים תאיים חיוניים באאוקריוטים. הדרך שבה אנו מעדיפים לחקור זאת היא באמצעות מוטציות המשבשות גנים חיוניים בתהליכים אלו.

כדי שזה יעבוד היטב, דרושה אוסף מקיף מאוד של מוטנטים, והשיטות שתוכלו לשמוע עליהן הן הדרך שלנו ליצור אוסף כזה. אנו עובדים עם האצה הירוקה Chlamydomonas reinhardtii כנציגה של ממלכת הצמחים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן למצוא מוטציות קטלניות רגישות לטמפרטורה כמעט בכל מסלול חיוני.

השיטה אינה דורשת ידע מוקדם או מוטגנזה מכוונת. התפקוד המולקולרי של הגן המוטנטי עולה מיד מהפנוטיפ הלתלי. דבר זה מסייע לנו לבחור מוטציות מעניינות המשבשות מסלולי siala מגוונים מעבר לבקרת מחזור התא.

כדי לבצע מוטגנזה באמצעות UV, גדלו תאי Chlamydomonas עד ל-OD 750 של 0.2 עד 0.5 ב-100 מיליליטר של Tris-Acetate-Phosphate, או TAP, בתנאי תאורה בטמפרטורה של 25 degrees Celsius ובניעור של 100 RPM. מוטגנזה באמצעות UV תבוצע באופן נפרד בשני רקעים גנטיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בדקו דגימה מכל תרבית תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים חיים וללא זיהומים.

בשלב הבא, דללו את התרבית עד ל-OD 750 של 0.003, ולאחר מכן עטפו את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי להבטיח צפיפות הומוגנית, מכיוון שהזן הוא מודאלי ושוחה באופן כיווני בתגובה לאור. לאחר התאמת צפיפות התושת בהתאם לפרוטוקול הכתוב, חברו קסטה של מבחנות קטנות המתאימה למפיץ נוזלים ובצעו סדרת שטיפות לסטריליזציה, בהתאם להוראות היצרן, כדי למנוע זיהום. באמצעות קסטה של מפיץ נוזלים עם שמונה מזרקים, טפטפו ארבע סדרות של 96 טיפות, בנפח של 2 µL כל אחת, של התרבית על פלטות מלבניות יבשות.

הקישו בעדינות על דופן הצלחת כדי להבטיח מיזוג של כל הטיפות לשכבה דקה של נוזל, וכסו מיד את הצלחות כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר הייבוש, הניחו את הצלחות תחת מנורת UV קוטלת חיידקים למשך פרקי זמן שנקבעו באופן אמפירי כדי להשיג תנובה אופטימלית של מוטנטים מסוג ts בקרב השורדים. לאחר מכן, העבירו את הצלחות למקום חשוך למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, מקמי את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 21 degree Celsius עם תאורה. לאחר כ-10 ימים, כאשר המושבות גדלו אך עדיין אינן ממוזגות, טעני את הצלחות למחסנית הרלוונטית כמקורות לברירה רובוטית של מושבות. לאחר מכן, ברירי מושבות עבור מערכי 384 על צלחות מלבניות וגדלי אותן בטמפרטורה של 21 degree Celsius עם תאורה למשך כשבוע.

באמצעות רובוט לריבוי מצעים (replica plating robot), דחסו את מערכי ה-384 למערך של 1536 והניחו ללוחיות לגדול באינקובטור בטמפרטורה של 21 degree Celsius למשך כ שלושה ימים. שכפלו את מערכי ה-1536 לשתי לוחיות כל אחת, והניחו אחת באינקובטור בטמפרטורה של 21 degree Celsius והשנייה באינקובטור בטמפרטורה של 33 degree Celsius. לאחר 24 שעות ב-33 degree Celsius, שכפלו את הלוחיות מהאינקובטור של 33 degree Celsius לסדר חדש של לוחיות שחוממו מראש והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 33 degree Celsius.

לאחר שלושה ימי גידול ב-33 degrees Celsius וחמישה ימי גידול ב-21 degrees Celsius, השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לצלם פלטת רשת המסומנת בתשעת סימני יישור. לאחר מכן צלם את הפלטות, לסירוגין פלטות של 21 degrees Celsius ולאחריהן הפלטות התואמות של 33 degrees Celsius, כאשר כל הפלטות מונחות במסגרת קבועה כדי לשמור על אוריינטציה מדויקת. עבד את זוגות התמונות של פלטות ה-21 וה-33 באמצעות תוכנה מותאמת אישית של matte lab לניתוח תמונות, כדי להסיר את הרקע ולחלק את התמונות למערך של 1536.

התוכנה תקבע את הביומסה שזוהתה כעוצמת פיקסלים כוללת בכל מיקום. טען את רשימת המושבות שנבחרו, שהופקה על ידי התוכנה, כקובץ הוראות עבור הרובוטיקה לבחירת מושבות בודדות. לאחר מכן, הכן את פלטות המקור והיעד בהתאם להוראות הרובוטיקה, ואפשר לרובוט להעביר את המושבות שנבחרו למערך.

הנח את הפלטות המטרה באינקובטור בטמפרטורה של 21 °C למשך כחמישה ימים להבאת הפלטה למצב של stock plate. לאחר ביצוע בדיקה שנייה להצטברות ביו-מסה ושכפול של 100 פלטות בלוקים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, שכפל את העותק הטרי של 100 פלטות הבלוקים לשלושה עותקים. לאחר הגדרת הפלטה השלישית ברובוט וביצוע spotting של המושבות, צלם פוטו-מיקרוגרפים של אזור בכל נקודה (spot) מפלטות הסריקה בנקודת זמן אפס, והנח את הפלטות בטמפרטורה של 33 °C להדגרה.

בנקודות זמן משתנות לאחר הוצאת לוחות הסריקה מהאינקובטור בטמפרטורה של 33 °C, צלמו במהירות מיקרו-פוטוגרפיה, תוך וידוא שתושבת הלוחות ובקר השולחן מכויילים במדויק כדי לקבל תמונות של אותם תאים בכל נקודת זמן. נתחו את התמונות המיקרוסקופיות ובחרו מוטנטים על סמך הקריטריונים הרצויים. זרעו את קבוצת הנבחרים הסופית בלוח אגר בפריסה של 96, תוך וידוא שכל לוח מכיל מוטנטים מאותו סוג הזיווג ומאותה עמידות לתרופות.

העבירו כמויות גדולות של המושבות המסודרות למצע השראה של גמטות נטול חנקן במיקרו-פלטות של 96 בארות. דגרו את הפלטות בתנאי תאורה למשך כחמש שעות כדי לאפשר גמטוגנזה. השעו שאילתות בעלות טיפוסי הזיווג המנוגדים, הנושאות את קסטות העמידות החלופיות, בתוך מבחנות המכילות מצע השראה של גמטות נטול חנקן לצורך גמטוגנזה.

ערבבו את הדגימות מלוח מטרה בנפח תערובת הזיווג של 20 µL. לאחר כ-10 דקות בתנאי תאורה, טפטפו פעמיים 5 µL מכל באר. פעם אחת על לוח TAP לבדיקת קישור (linkage testing) ופעם אחת על לוח TAP בתוספת 5 µM paro ו-9 µM hygro לבדיקת קומפלמנטציה (complementation testing).

לאחר דגירה של צלחות בדיקת הקומפלמנטציה, שכפל את הצלחות לשני עותקים לצורך זיהוי פנוטיפ ts. בדוק את המושבות לפנוטיפ ts בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הקרנה של תאים בודדים של Chlamydomonas, הושאו התאים לצמוח במשך עשרה ימים בטמפרטורה מתירנית, ולאחר מכן נבחרו בפורמט של מערך, כפי שנראה כאן.

הפלטות שהתקבלו בפורמט 384 מוזגות למערך של 1536. נבחנו שלושה זמני חשיפה ל-UV כדי להפיק מוטנטים של Chlamydomonas ts. באופן אמפירי, זמן חשיפה של 1.5 דקות הניב את מספר מוטנטי ה-ts הגבוה ביותר.

עם זאת, זמן חשיפה של דקה אחת הניב את מרבית המועמדים למחזור התא. בניסוי זה, בוצעו שני בדיקות פנוטיפ ts רצופות, וכ-3000 מוטציות ts בודדו ואופיינו פנוטיפית באמצעות מיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse microscopy). כפי שניתן לראות כאן, כדי להסיר גנים שחוזרים על עצמם בתדירות גבוהה משלב ההמשך של התהליך, בוצעו בדיקות קומפלמנטציה וקישור (linkage) מול מועמדים שנאספו לאחרונה, תוך שימוש בגנים שכבר אופיינו ובעלי יותר משני אללים.

מושבות אלו אינן מראות קומפלמנטציה עם השאילתה ולכן הן מהוות אללים ts חדשים עבור הגן שנבדק. בדרך כלל הן מוחרגות מאפיון נוסף. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בסביבה של תפוקה גבוהה (high through-put).

ניתן לבודד אלפי מוטנטים מסוג ts בשני או שלושה סבבי מוטגנזה בלבד. שלב מפתח לאחר בידוד המוטנטים מסוג ts הוא בחירת תת-קבוצה להמשך מחקר, ומעניין מאוד לבחון את מגוון הפנוטיפים הקטלניים. פנוטיפום מספק רמזים לתפקוד המולקולרי וכן מסייע לנו לתעדף מוטנטים להמשך מחקר.

יש לזכור כי למוטנטים עשויות להיות מאות או אלפי מוטציות בגנום שלהם. בדרך כלל רק אחת מהן היא הגורמת, אם כי לעיתים נדרשות שתי מוטציות להופעת הפנוטיפ ה-ts, וניתן לקבוע זאת באמצעות אנליזת טטרה (tetra analysis). לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לזהות את המוטציות הגורמות באמצעות אנליזת רצף דור הבא (next generation sequencing) של דגימות מאוחדות. הגנים שיזוהו יכילו לעיתים מוטציות המרמזות על תפקידם, או שהם עשויים להיות רצפים חדשים ולא ידועים, דבר שהוא מעניין ומרגש.

ה-Chlamydomonas היווה מערכת מודל מצוינת לחקר ביולוגיה של התא בממלכת הצמחים. הפרוצדורות ששמעתם עליהן אמורות לאפשר את חקר האורגניזם הזה בתהליכים חיוניים שטרם נבחנו מספיק, ואנו מקווים שהתוצאות יהיו רלוונטיות גם לממלכת הצמחים הרחבה יותר.