Name: אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למדו אופטימיזציה של assay נייטרוליזציה מיקרו-כמותי לאפיון אנטיגני של נגיפי שפעת. שיטה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיית תאים נגועים כולה בסריקת שטח שטוחה ותוכנה ייעודית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר מ. מטרוסוביץ' על אספקת קווי התאים האביים MDCK ו-MDCK-SIAT1 ול-Roche Pharmaceuticals על אספקת האוסלטמיביר קרבוקסילאט. אנו מעריכים גם את ד"ר אן וסטון על הצעות חשובות לגבי כתב היד. מחקר זה היה תלוי בשיתוף הפעולה המוערך של מרכזי השפעת הלאומיים של ארגון הבריאות העולמי ומרכזי ה-CC של ארגון הבריאות העולמי בתוך ה-GISRS של ארגון הבריאות העולמי, שסיפקו את נגיפי השפעת שבהם נעשה שימוש. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר הרפואי באמצעות תוכנית U117512723.

הערה: רמת הבטיחות הביולוגית (BSL) עבור הפרוטוקול להלן BSL 2 עבור נגיפי שפעת עונתיים BSL 3+ עבור נגיפי שפעת פוטנציאל מגיפים. טיטרציה ויראלי נדרש מראש של ניסוי נטרול להחליט ריכוז ויראלי של לשלוט בקצב התרבות הנגיף (VC). 1. טיטרציה וירוס הערה: בהתאם למספר של וירוסים ומספר כפילויות, צלחת גם ניתן להגדיר עם הגמישות הבאים: (1) דילול ויראלי ניתן לארגן יחד גם את השורות או העמודות (איור 1). כל וירוס צריך לכבוש שורה / עמודה נפרדת. (2) תוספת הדילול ויראלי היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם ריכוז ויראלי הגבוה בפינה השמאלית העליונה. (3) אין הגבלה על מספר כפילויות. הערה: מדין דארבי כליות כלבים (MDCK) ו MDCK-SIAT1 (SIAT) תאים נמסרו באדיבות על ידי ד&quot;ר מ Matrosovich, מרבורג, Gerרב 10. תאים SIAT הם תאים MDCK transfected ביציבות עם CMP-N-acetylneuraminate האדם: הגן בטא galactoside α-2,6-sialyltransferase עבור ביטוי מוגבר של חומצה sialic (SA) אוליגוסכרידים הסתיים α2-6Gal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Aliquot MDCK מספיק או MDCK-SIAT תאים 8 לתוך צלחות 96-היטב (200 μl / טוב). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ימים 2 או 3 כדי להגיע למפגש. הפץ את תאי DMEM בתוספת 10% נסיוב עגל העוברי חום המומת (FCS) ואנטיביוטיקה (100 פניצילין U / ml ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). דגירה התאים SIAT על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ו סולפט G418 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: גורם לדילול תלוי ניסיון ואת שורת התאים בשימוש. בשכבת התא חייבת להיות ומחוברות (כלומר, אין קיר תא או מתאר גלוי עבור תאי MDCK וכן פריסה בחוזק ארוזה עבור תאי MDCK-SIAT1) בעת חיסון וירוס. דוגמאות של דילולים מבוססים עלתת-תרבות צלוחיות ומחוברות של תאים MDCK או MDCK-SIAT1 ניתנות בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים 3 פעמים עם 200 μl של מדיום הגידול וירוס (VGM) לכל טוב. לעקר את מכונת כביסה צלחת multiwall עם 70% EtOH למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו פוספט בופר סליין סטרילית (PBS) או VGM לפני הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב VGM ומיד להוסיף 50 μl של VGM היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של VGM לכל אחד 6 צינורות סטרילי (או פחות, בהתאם למספר של וירוסי בדיקת כפילויות). פיפטה 100 μl של הנגיף לתוך הצינור הראשון, ומערבבים היטב, לדלל סדרתי, שינוי עצות בין כל דילול. חזור על הפעולה עבור כל וירוס להיות טיטרציה. הערה: זה ייתן דילולים וירוס של 10 -1 עד 10 -6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול כל וירוס, החל משעת הדילול הגבוה ביותר (1 x 10 -5 באיור 1), בארות כפולות (עמודות 9 ו -10 באיור 1) של 96-גם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות כדי לאפשר הנגיף להדביק את התאים. הערה: דגירת 2 עד 3 שעות יש צורך להבטיח כי וירוסי הבידוד יש מספיק זמן להגיע בשכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את שכבת (10 מ&quot;ל / צלחת) הערה: כיסוי מורכב 5 מ&quot;ל של 2x DMEM, טריפסין (2 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ&quot;ל), 20 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות, ו -5 מ&quot;ל של linters כותנה תאית (ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הכיסוי (200 μl לכל היטב). דגירת הלילה בשעה 37 ° C, ללא הפרעה. הערה: ניצני הווירוס מתקיימים לאחר כ -4 שעות, ולכן חשוב כי הצלחת אינה מופרעת אחרי הפעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הכיסוי מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת paraformaldehyde 4% קר כקרח ב PBS A (200 μl / טוב). מניחים אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הערה: PBS A הוא שנאגר-פוספט הטבעי-pH מלוח עם 10 Gof NaCl, 0.25 גרם של KCl, 1.437 גרם של Na 2 HPO 4, 0.25 גרם של KH 2 PO 4, ו 1 ליטר של מים מזוקקים (ראה רשימת חומרים). הערה: Paraformaldehyde מזיק כאשר בשאיפה ויכול לגרום לכוויות בבליעה. יש גם עדויות מוגבלות השפעה מסרטנת, וזה עלול לגרום רגישות לאחר מגע עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב paraformaldehyde ולשטוף את הצלחות פעמיים עם PBS A (200 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את לוחות PBS ב 4 ° C לשימוש עתידי, או להמשיך בביצוע השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ permeabilization (100 μl / טוב). עזוב את זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחת פעמים עם PBS A (200 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הנוגדן הראשון, עכבר MAb מפני סוג שפעת (1: 1,000 ב הצפת ELISA), לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 (או לילה 4 ° C), עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותו 3 פעמים 100 μl של חיץ לשטוף (0.05% 80 Tween ב PBS A, V / V) עמ &#39;אה כן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בין שוטף. לחלופין, לשטוף אותו 3 פעמים ללא דגירה באמצעות 300 μl לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הנוגדן השני, עיזים אנטי עכבר IgG (H + L) המצומד HRP (1: 1,000 ב הצפת ELISA), לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותו 3 פעמים כמתוארות בשלב 1.17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המצע (50 μl / טוב). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או עד לפיתוח של צבע כחול נראה בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את התגובה, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 200 μl של מים מזוקקים לכל טוב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 2 -3 דקות בין הכביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש הצלחת ולאחסן אותו במקום חשוך (למשל, לעטוף אותו בנייר אלומיניום). </li></ol> 2. כימות טיטרציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת היטב באזור סריקה של סורק שטוח, כפי שמוצג באיור 2a. השתמש במגבלת עמדת L-צורהלהבטיח מיקום הדמיה אופטימלי דיר. הערה: אפשר תמונת שתי צלחות גם בסריקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסרוק תמונה. הערה: ההגדרות מוצגות בלוח 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה &quot;Reader Wellplate&quot; כדי לחשב את ריכוז וירוס הנדרש (איור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;תמונה טען&quot; כדי לטעון תמונה. חלק את הפס האדום בהיסטוגרמה של הכרטיסייה &quot;גלובל סף&quot; על מנת להתאים את סף הדגימה. לחץ על הכפתור &quot;רענן&quot; כדי לבחון את ההשפעה על התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה &quot;נטרול חישוב / טיטרציה&quot;. לחצו על כפתור ה &quot;דגימה&quot; לכמת את ICP. לחצו על כפתור &quot;שמור&quot; כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת. הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם &quot;נטרול &amp; טיטרציה חישוב&quot; מופיעה אוטומטית אם &quot;נטרול החישוב / טיטרציה&quot; התיבה מסומנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">טען או קלט את מפת ההגדרה היטב צלחת. ציין את הסף (למשל, 30%) ב &quot;טיטרציה: אוכלוסין וירוס אופטימליים (%)&quot;. בחר בכרטיסייה &quot;תהליך טיטרציה&quot; כדי לחשב את תוצאות טיטרציה. בדוק את התוצאות טיטרציה. לחצו על כפתור &quot;שמור וסגור &#39;כדי לשמור את התוצאות טיטרציה. הערה: עיין משלים S1 עבור הדרכה מפורטת יותר על התוכנה. עותק של התוכנה העידה זמין על פי בקשה. הערה: בדרך כלל, דילול הווירוס הטוב ביותר עבור תשואות assay פלאק ההפחתה כ -50% (20-85%) ICP של תאים הכוללים בתוך כל טוב 11. </li></ol></li></ol> ניטרול וירוס 3. הערה: חישוב מספר הצלחות נדרשו עבור assay הנטרול. כל צלחת יכולה להכיל וירוס אחד ומספר נסיובי. הערה: בהתאם למספר של נסיובי מספר כפילויות, צלחת גם ניתן להגדיר עם ההדואר בא גמישות: (1) הדילול בסרום ניתן לארגן יחד באחת מהשורות או עמודה (איור 4). כל בסרום צריך לתפוס מקום בשורה או בטור נפרד. (2) התוספת של דילול בסרום היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם הריכוז בסרום הגבוה בפינה השמאלית העליונה של צלחת. (3) מספר כפילויות מאזן את מספר נסיובי. עוד כפילויות יכול לעזור להחליק את וריאציות ניסיון. (4) המספר של VC ומספר שליטת התא (CC) כפילויות גמישות, אבל הם גם צריכים להיות בשורות נפרדות או עמודות. צפוי כי מספר כפילויות VC הוא גדול משמעותית מזה של נסיובי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את monolayer התא, כמו צעדים 1.1-1.3, 2 או 3 ימים מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של VGM היטב כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עמודות 11 ו -12 עבור VC ו CC, בהתאמה. הוסף 50 μl aliquots של 1:20 אנזים להרוס קולטן (RDE) בסרום -treated לשורה הראשונה (א) של קולוםns 1-10. הערה: לכל שילוב וירוס וסרום, assay מבוצעת בשני עותקים, כך צלחת ניתן, למשל, מכילה וירוס אחד נבדק נגד חמישה נסיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דילולים סדרו פי 2 על ידי העברת 50 μl מ בטור א לחתור H (עמודות 1-10 באיור 4) ולהשאיר 50 μl מן השורה H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של diluent היטב בכל בעמודה CC (טור 12 באיור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הנגיף היטב בכל צלחת, למעט הטור CC (עמודות 1-11, שורות AH באיור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות. הסר את הבידוד. מוסיף את הכיסוי (200 μl) זה טוב. דגירה זה לילה בשעה 37 ° C, ללא הפרעה. תיקון ו להכתים את הצלחות ובאשר טיטרציה הווירוס (שלבי 1.11-1.22). </li></ol> 4. כימות ניטרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת היטב באזור סריקה של סורק משטח אופקי, כפי שמוצג figuמחדש 2a. השתמש מיקום גבול L-צורה כדי להבטיח מיקום הדמיה אופטימלי דיר. הערה: אפשר תמונת שתי צלחות גם בסריקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הצלחת, כמתואר בשלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה &quot;Reader Wellplate&quot; כדי לחשב את titers ויראלי הנדרש (איור 3, שלב 2.3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;תמונה טען&quot; כדי לטעון תמונה. חלק את העמודה האדומה &quot;גלובל סף&quot; על מנת להתאים את סף הדגימה. לחץ על הכפתור &quot;רענן&quot; כדי לבחון את האפקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה &quot;נטרול חישוב / טיטרציה&quot;. לחצו על כפתור ה &quot;דגימה&quot; לכמת את ICP. לחצו על כפתור &quot;שמור&quot; כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת. הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם &quot;נטרול &amp; טיטרציה חישוב&quot; מופיעה אוטומטית אם &quot;נטרול החישוב / טיטרציה&quot; התיבה מסומנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען או קלט את p-טובהמפה מאוחר. ציין את הסף (למשל, 50%) ב &quot;ניטרול:. זיהום ניכוי (%)&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;תהליך ניטרול&quot; כדי לחשב את titers. בדוק את כותרות ולחץ על כפתור &quot;שמור וסגור &#39;כדי לשמור את התוצאות הניטרול. הערה: ניטרול הוא כפי שדווח הגומלין של הדילול הגבוה ביותר של נסיוב עם הפחתת ICP מוגדרת מראש (כגון 50% או 80%) נגד VC (הממוצעת של טור 11 באיור 4). ירידה של 50% ICP שמשה נציג התוצאות. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li>
<li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A%28H3N2%29+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site%3A+a+role+in+virus+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li>
<li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+%28egg-derived%29+vaccine+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li>
<li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+%28H5N1%29+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol.37%22%5BJournal%5D)">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li>
<li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li>
<li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li>
<li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents%2Fprobes+and+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+World+Summer+2005%22%5BJournal%5D)">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+alpha-2%2C+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li>
<li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר זה, אנו תארנו assay MN מבוסס הדמיה לכמת את היחסים אנטיגני הנכונים בין וירוסים. לעומת מבחני פלאק-הפחתה אחרים, השיטה מדגישה מדידת ICP של באר כולו, הבטחת כיסוי מלא של האוכלוסייה התולעת. עצמאותה של הצטברות אבנית גם מרחיבה את היישום של assay כדי וירוסים שיכולים ליצור לוחות קטנים בלתי נראים בעיקר או שרק יכול לנהל זיהום תא בודד. לכן, assay היא מסוגלת לבחון יותר וירוסים ואת ההשפעות של מגוון רחב יותר של נוגדנים מ HI, וזה עוזר בצורה מקיפה יותר לשקף את הדמיון אנטיגני או הבדלים בין וירוסי 12. לדוגמא, כאשר carboxylate oseltamivir כלול, assay MN מושפע פחות NA התלוי מחייב, משקף את ההבדלים אנטיגני בצורה מדויקת יותר. במהלך הפיתוח של assay, נעשו מאמצים גדולים כדי לשפר את עקביות ניסוי, מהירות, וזיהוירגישות, כולל על ידי שליטת וירוסים קלט באמצעות טיטרציה ונרשמת, הדמית קצב העברת נתונים גבוהות עם סורק משטח אופקי, ויישום פלטפורמת עיבוד נתונים ידידותי למשתמש. התוצאות היו בדרך כלל בקנה אחד עם ואישר אלה של HI. יש לציין, כי התוצאות גם חשפו הבדלים אנטיגני בין הגירסות להיסחף אנטיגני של וירוסי סוג האחרונים ו- B חיסון, כמו גם שינויי אנטיגני נגרמים על ידי שינויים בתרבות שנבחרה או ספורדי, כגון החלפת G155E ב HA1 של מסוימים (H1N1) וירוסים pdm09 12. הפרוטוקול מתאים לסוג הווירוס או תת-סוג עם מבחר של שורות תאים כי נתנו את הזיהום החזק, אשר משפר את אות ההדמיה. וריאציה ניסיוני הוחלקה עם העיצוב של כפילויות כי מאוזנת עם מספר נסיובי נבדק. חוסר ודאות יכולה גם לבוא איכות התמונה, אשר מושפעת בעיקר על ידי מכשיר ההדמיה. סורק הגון שטוח צבע יכול משמעותיficantly לשפר את הניגודיות בתמונה להפחית את הרעש. כמות וירוס קלט נטרול צריכה להיקבע באופן כמותי מראש מן טיטרציה המקביל ואילו וירוסים ועדיין לשמור על מצב דומה. במהלך נטרול, התגובה antiserum לזיהום הוא מנורמל נגד ההבדל בין וירוס הפניה (VC) ורמת רקע (CC). מדידות מדויקות של VC ו CC חיוניים ניסוי הניטרול. עוד כפילויות מומלצות (שמונה כפילויות ששמשו נציג התוצאות). לבסוף, הבנת התוכנה היא חיונית להצלחה של ניסוי. התוכנה נבדקה לאפיון וירוס שיגרתי של מרכז שפעת WHO, בבריטניה במשך יותר משנים. הוראות מפורטות להתמודדות עם מצבים שונים מסופק S1 משלים. assay MN זו מתאימה עבור יישומים בהם דגימות לכסות שלוחהשדה גדול remely המבט אלא רק דורשים רזולוציית הדמיה מתונה. העלות הנמוכה התקנה פשוטה להפוך את המערכת זמינה למעבדות וירולוגיה ביותר. הווריאציה במדידות של המדגם הזהה הייתה פחות מ -3%, אשר בערך מגדיר הוודאות הציגה במהלך הסריקה 11. שחזור כזה הוא מספיק במחקרי virological רבים ניתן להפחית עוד יותר על ידי ממוצעי תמונות מסריקות מרובות. לסיכום, המחקר הנוכחי מדגים assay MN חזקים שניתן להשתמש בהם באופן שגרתי במחקר אנטיגני ולתמוך נתונים HI בניתוחים מפורט של כרגע-מחזורי נגיפי שפעת, בעיקר עבור הבחירה הדו-שנתי של וירוסים להכללה החיסונים לשפעת האדם.

מבחני מיקרו-נטרול (MN) משמשים וירולוגיה עבור quantitation של נוגדנים מנטרלים וכן את פעילות אנטי. כחלופה של עיכוב hemagglutination (HI) מבחנים, מבחני MN יכולים להתגבר השפעות חד אנטיגני מושפעות משינויי הזיקה של קולטן מחייב נגיפי שפעת, אשר יכול לסבך את הפרשנות של HI תוצאות 1,2,3. עד לאחרונה, רוב מבחני MN התבססו על תופעות cytopathic (CPE) או מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 4,5. מבחני MN מבוסס על הפחתת מוקד ורובד פותחו 6,7,8 1990. מבחני הפחתת רובד להסתמך על ספירת הפלאק גלוי לכמת infectivity. עם זאת, ספירה חזותית לכסות רק לוחות גדולים כי הם פתירים על ידי עין אנושית, למרות שהרוב הפלאק הם קטנים ובלתי נראים לאיתור וירוסים במחזור נוכחי רבים. כיסוי חלקי זה יכול לגרום וריאציה משמעותית בין בוחנים בין ניסויים, שמוביל iתוצאות ncomparable. זה גם בלתי אפשרי להשתמש בשיטה כאשר וירוסים מסוימים מוצגים זיהום נפל של תאים בודדים או הפלאק קטן מאוד. החלטת ספירת העניים ניתן לשפר על ידי כניסתה של פרוטוקול מבוסס-הדמיה. עם ההתקדמות הטכנולוגית, מיקרוסקופיה אופטית תפוקה גבוהה הקוראים גם צלחת יכול לספק אמצעי מדויק לספור את התאים הנגועים 9. תחת מיקרוסקופ טרנס-מואר, תאים נגועים מתויגים עם סמנים מסוימים עשויים להיות דמיינו לעומת הקליטה או קרינה שלהם בהחלטת משנה הסלולר. מדגם לאחר מכן ניתן לנתח על מסך מחשב. למרבה הצער, בשל הגבלת שדה הראייה, יותר ממאה תמונות רעפים נדרשות לכסות היטב יחיד. ניתוח צלחת עם 96 בארות ידרוש ההדמיה והעיבוד של כעשר אלף תמונות. תהליך כזה מייגע הוא זמן רב ויקר, ואת ברזולוצית צבר היא בכללl מיותר לאפיון שגרת זיהומים נגיפיים. מעבדות עם תקציב מוגבל עשויות לגלות כי הגישה הבנויה סביב וסורק מספקת אלטרנטיבה חסכונית, תפוקה גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים assay MN הפחתת פלאק משופר כי הוא מתאים לאפיון אנטיגני של מספר רב של וירוסים ותוכנות עבור מדידת פעילויות אנטי כמותית ונוגדנים הניטרול. יש assay מספר יתרונות: ראשית, היא assay מבוססת הדמיה כי הוא מסוגל למדוד וירום ברמה התאית, ללא קשר לגודל פלאק. ספירת אוכלוסיית התא הנגועה הכוללת (ICP) בתוך באר מגדיל מאוד את רגישות זיהוי, מה שהופך אותו ניתן לאפיין את הווירוסים עם infectivity הנמוך. שנית, טיטרציה כמוני מדויקת יותר הוא הציג לפני נטרול כדי לקבוע את כמות נגיף קלט. וירוס קלט כמותית מפחית באופן משמעותי את Variation בין ניסויים שונים והופך את התוצאות יותר להשוות בין מעבדות. שלישית, טיטר נטרול ניתן לקבוע ישירות על ידי ניתוח תמונות, מה שהופך את quantitation מהיר וידידותי למשתמש. לבסוף, פרוטוקול מספק חסכונית אלטרנטיבה תפוקה גבוהה עם רזולוציה והדיוק הנדרשים. Quantitation מבוסס על וסורק ותוכנות עיבוד נתונים חינם. ההתקנה כולה יש טביעת רגל קטנה והוא פריסה ברוב המעבדות. הפרוטוקול המובא במאמר זה מורכב מארבעה שלבים עיקריים, כולל טיטרציה וירוס, quantitation טיטרציה, נטרול הנגיף, quantitation הניטרול. טיטרציה וירוס הוא ניסוי הכנה שקובע את כמות וירוסים קלט לשמש הניטרול. במהלך טיטרציה, מספר ריכוזים ויראלי מוחלים על monolayers התא בצלחת 96-היטב. התאים הנגועים אז נבדקים ונרשמים בסעיף 2. dilu ויראליtion שמייצר 20% -85% ICP הוא בתורו מיושם כמו וירוסי קלט הנטרול המקביל סעיף 3. טיטר של פרוטוקול נטרול הם לכמת באמצעות סעיף 4. ניסויים שבאו בעקבות הפרוטוקולים הנ&quot;ל מוצגים נציג תוצאות. את assay נבדק ביסודיות במהלך השנים האחרונות עם רוב נגיף שפעת במחזור הנוכחית, כגון A (H1N1) pdm09, A (H3N2), וירוסי B. התוצאות של אפיון נגיף שפעת נכללו בדוחות עבור פגישת יעוץ WHO כי נתן המלצות על החיסונים לשפעת לשימוש בחצי הכדור הדרומי בשנת 2016 בחצי הכדור הצפוני ב 2016-2017.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 מ"ל DMEM + 5 מ"ל עט/Strepb</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>טבעי pH חוצץ פוספט מי מלח: NaCl 10&nbsp; ז, KCl 0.25&nbsp; g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g, ו-Dist. Water 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2.4 גרם ב-100 מ"ל מים מזוקקים מומסים על ידי ערבוב על מערבל מגנטי למשך שעה.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>שכבת על (10 מ"ל/צלחת):</td><td></td><td></td> <td>5 מ"ל 2x DMEM, טריפסין 2&nbsp; &mu; ריכוז סופי של גרם/מ"ל, אביסל 5&nbsp; מ"ל</td></tr><tr><td>טריטון X- 100e</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>מאגר חדירות T8787</td><td>: 0.2% ב-PBS A (v/v)</td></tr> <tr><td>מאגר כביסה Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>: 0.05% Tween 80 ב-PBS A (v/v)</td></tr> <tr><td>סרום סוסים</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA Buffer: 10% ב-PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mouse MAb נגד שפעת מסוג A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st נוגדן: 1:1,000 ב-ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Goat אנטי-עכבר IgG (H+L) HRP מצומד</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd נוגדן: 1:1,000 ב-ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidase Substrate</td><td>KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>מצע: כחול אמיתי +0.03% H2O2g (1:1,000 של 30% תמיסה)</td></tr><tr><td>96-בארות לוחות מיקרוטיטר עם תחתית שטוחה</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>מכונת כביסה וסעפת 8 ערוצים</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Perfection Plate Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>ניתן להוריד את תוכנת ההדמיה באופן חופשי מ-<a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=הורדות">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=הורדות</a>.</td></tr><tr><td>סביבת תפעול תוכנה: חלון LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>מבוסס על NI Vision Builder</td><td>גרסה: LabVIEW2012 ומעלה</td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של assay כמותי מיקרו-נטרול

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

בדיקת המיקרו-נטרול (MN) היא טכניקה סטנדרטית למדידת ההדבקה של נגיף השפעת ועיכוב שכפול הנגיף. במחקר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול של בדיקת MN מבוססת הדמיה כדי לכמת את הקשרים האנטיגניים האמיתיים בין נגיפים. בניגוד לבדיקות טיפוסיות להפחתת פלאק המסתמכות על פלאק גלוי לעין, בדיקה זו מכמתת את כל אוכלוסיית התאים הנגועים של כל באר. הפרוטוקול מתאים את סוג הנגיף או תת-הסוג עם בחירת קווי התאים כדי להשיג הדבקה מקסימלית, מה שמשפר את ניגודיות הדגימה במהלך הדמיה ועיבוד תמונה. הכנסת טיטרציה כמותית מגדירה את כמות נגיפי הקלט של הנטרול ומאפשרת להשוות את התוצאות מניסויים שונים. מערך ההדמיה עם סורק שטוח ותוכנה הניתנת להורדה בחינם הופך את הגישה לתפוקה גבוהה, חסכונית, ידידותית למשתמש וקלה לפריסה ברוב המעבדות. המחקר שלנו מדגים כי בדיקת ה-MN המשופרת עובדת היטב עם נגיפי השפעת הנוכחיים A(H1N1)pdm09, A(H3N2) ו-B, מבלי להיות מושפעת באופן משמעותי מהחלפת חומצות אמינו בנוירמינידאז (NA) של נגיפי A(H3N2). הוא שימושי במיוחד לאפיון נגיפים שגדלים לטיטר HA נמוך ו/או עוברים זיהום כושל וכתוצאה מכך חוסר יכולת ליצור פלאק בתאים מתורבתים.

בעקבות התהליך המתואר לעיל, אנו מציגים כמה תוצאות מניסויי אפיון אנטיגני אחרונים. התקנת טיטרציה נועדה לבחון שמונה וירוסי קלט, עם כפילויות כפולות עבור כל דילול. דילולים ויראלי נבדקו בין 1.0 x 10 -1 ו 1.0 x 1.0 -6 לכסות את ההבדלים בין הווירוסים. הוירוסים הבדיקה היו מן תת סוג H3N2, לרבות A / קמרון / 15V-3538/2015, A / ולדיווסטוק / 36/2015, A / מוסקבה / 103/2015, A / טומסק / 5/2015 /, A / מוסקבה / 101 / 2015, A / מוסקבה / 100/2015, A / מוסקבה / 133/2015, ו- A / ברטיסלבה / 437/2015. תוצאות טיטרציה הן באיור 5. 5D איור מדגים את הירידה של ICPs עם עלייה של דילול וירוס. העקומות היו מנורמלות נגד ICPs מאותו הווירוסים שהניבו זיהומים בכל התאים בתוך באר 12 (מוגדר רווית ICP). אם ICP לא הגיע לרוויה עם ההייריכוז נגיף ghest, ממוצע ICP מן הכפילויות מקבילות שמש במקום (A / מוסקבה / 103/2015 איור 5D). דילולי הווירוס שייצרו 30% רווית ICP נבחרו דילול וירוס קלט לנטרול (לוח 3). ניטרול שמטרתה יש וירוס קלט אחד נגד חמישה נסיובי, עם כפילויות כפולות על כל צלחת. הווירוס האסמכתא המופיע הוא A H3N2 / Stockholm / 63/2015. חמשת נסיובי הם A / HK F12 ביצה 4801/14 / 15, A / HK F02 MDCK 7295/14 / 15, A / דרום אפריקה R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / שוויצרי 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, ו- A / הולנדית 525/14 SIAT F23 / 15. תוצאות הנטרול הן באיור 6. 6d האיור מציג את התקדמות זיהום עם העלייה של דילול בסרום. האוכלוסייה החיובית מנורמלת על הציר האנכי מייצגת את היחס של ICPs מתגובת נסיובי המקבילה נגד ממוצע ICP<html> של נגיף התייחסות 12. ICP רקע מפיקוח תא הנגוע היה מופחת במהלך הנורמליזציה. את titers נטרול נקבעו כמו reciprocals של דילולים antiserum המקביל ל -50% הפחתה ICP (לוח 4). אינטרפולציה לינארית שמשה כדי להעריך titers נופל בין שני דילולים בסרום סמוכים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> איור 1: דוגמה של תוכנית ההתקנה היטב הצלחת ניסוי טיטרציה וירוס. וירוסי מבחן מוקצים בשורות נפרדות (א &#39;עד ח&#39;). עמודות מיועדות דילולים ויראלי שונים (1 עד 12). שני טורים שימשו כפילויות עבור כל דילול ויראלי. סרגל קנה מידה = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> p-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig2.jpg" /> איור 2: שרטוטים של מערכת סריקה המדגם. (א) צלחת 96-היטב על מצבת ההדמיה של וסורק (מחדש מן אסמכתא 11 באישור BV Elsevier), ו- (ב) מידות של גבול עמדת L-צורה שמוצגת (א). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> איור 3: תרשים שולחני של התוכנה &quot;Reader Wellplate&quot; quantitation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> איור 4: דוגמה של תוכנית ההתקנה של צלחת היטב בניסוי הניטרול. antiserum מוקצה לשתי עמודות עם כפילויות (1 עד 10). שורות מיועדות דילולי סרום שונים (א &#39;עד ח&#39;). שליטת הווירוס לוקחת טור 11, עם שמונה כפילויות (A11 כדי H11). שליטת התא נמצאת טור 12, עם שמונה כפילויות (A12 כדי H12). סרגל קנה מידה = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> איור 5: תוצאות של ניסוי טיטרציה. (א) הגדרת היטב צלחת, (ב) תמונה סרוקה היטב צלחת, (ג) איורשל דילולים צבע בקידוד, ונרשמת, אוכלוסיית תאים הנגועים בנגיף, ו- (ד) אוכלוסיות תאים מנורמל הנגועים בנגיף נגד וירוס. ICP 30% שימש הסף. ברי השגיאה ב (ד) מציינים את סטיית התקן (SD) מן כפילויות המדגם (± 1 SD). ברים בקנה מידה (ב) ו- (ג) = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> איור 6: תוצאות של ניסוי הניטרול. (א) הגדרה היטב הצלחת, (ב) סרק היטב צלחת תמונה, (ג) איור של אוכלוסיית תא והנרשמת, נגוע בוירוס, ו- (ד) אוכלוסיית תאים מנורמלת נגוע בנגיף נגד הדילול בסרום. השישי קלטרוס (VC) הוא A / שטוקהולם / 63/2015. 50% ICP שימש לחישוב titers. ברי השגיאה ב (ד) מציינים את סטיית התקן (SD) מן כפילויות המדגם (± 1 SD). ברים בקנה מידה (ב) ו- (ג) = 10 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> S1 משלים: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> דילול אופייני </td></tr><tr><td></td><td> תאי MDCK </td><td> תאי MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 ימים </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 ימים </td&gt; <td> 1:10 (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> מספר טיפוסי של תאים לכל מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> תאי MDCK </td><td> תאי MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 ימים </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 ימים </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: דילולים אופייניים על תת-תרבות של צלוחיות ומחוברות של תאי MDCK או MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מצב </td><td> מצב מקצועי </td></tr><tr><td> סוג מסמך </td><td> סרטים (עם מדריך עירוני סרט) </td></tr><tr><td> סוג חשיפה אוטומטית </td><td> תמונה </td></tr><tr><td> Imסוג גיל </td><td> 24 סיביות צבע </td></tr><tr><td> רזולוציה </td><td> 1,200 dpi </td></tr><tr><td> פורמט תמונה נשמר </td><td> רִיב </td></tr></tbody></table> טבלה 2: התקנה טיפוסית של וסורק. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שׁוּרָה </td><td> וִירוּס </td><td> דילול מומלץ </td></tr><tr><td> א </td><td> A / קמרון / 15V-3538/2016 </td><td> 1.0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / ולדיווסטוק / 36/2015 </td><td> 1.0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / מוסקבה / 103/2015 </td><td> 1.1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / טומסק / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / מוסקבה / 101/2015 </td><td> 8.3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / מוסקבה / 100/2015 </td><td> 1.4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / מוסקבה / 133/2015 </td><td> 1.3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / ברטיסלבה / 437/2015 </td><td> 1.3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> טבלה 3: דילולים ויראלי מחושב מתוך אוכלוסייה של 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טור </td><td> נסיובי </td><td> כייל מומלץ </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3 - 4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 </td><td> A / דרום אפריקה / R2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / שוויץ / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / הולנד / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> לוח 4: titers ב 50% ICP של A / שטוקהולם / 63/2015 נגד נסיובי.

מחקר זה מתאר מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

המטרה הכוללת של בדיקת מיקרו-ניטרליזציה זו היא לאפיין את כל סוגי נגיפי השפעת המסתובבים כיום ואת הפעילות של נוגדנים ומדדים אנטי-ויראליים באופן כמותי, בתפוקה גבוהה ובמידת רגישות גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כגון אפיון אנטיגני של נגיפי שפעת, ניטרליזציה כמותית של נוגדנים ופעילויות אנטי-ויראליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפיינת את כל אוכלוסיית התאים המודבקים, כולל פלאקים (plaques) נראים ובלתי נראים, והדבקות של תאים בודדים.בדיקת המיקרו-נטרליזציה תודגם על ידי ד"ר Yipu Lin, סגן מנהל המרכז המשתף של ה-WHO לשפעת בלונדון. רמת הבטיחות הביולוגית, או BSL, עבור הפרוטוקול הבא היא BSL 2 עבור נגיפי שפעת עונתיים ו-BSL 3+ עבור נגיפי שפעת פנדמיים פוטנציאליים. לתחילת העבודה, יש לחלק כמות מספקת של תאים ללוחיות בעלות 96 בארות.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך יומיים עד שלושה ימים עד להגעה לקונפלואנציה (confluence). סטריליזרו שוטה פלטות רב-באירי באמצעות 70% ethanol, ושטפו אותו באמצעות PBS או VGM. לאחר מכן, השתמשו ב-200 µL של מצע גידול לנגיף, או VGM, לשטיפת התאים שהגיעו לקונפלואנציה.שאבו את ה-VGM מהתאים, והוסיפו מיד 50 µL של VGM לכל באר. לאחר מכן, הוסיפו 900 µL של VGM לכל אחת משש מבחנות סטריליות. לאחר מכן, העבירו בפיפט 100 µL של וירוס למבחנה הראשונה וערבבו היטב.הכינו דילולות סדרתיות של הנגיף החל מהמבחנה הראשונה, תוך החלפת הטיפים בין כל דילול. הוסיפו 50 µL מכל דילול של הנגיף, החל מהדילול הגבוה ביותר, לבארים כפולות של פלטה בעלת 96 בארות. לאחר מכן, הניחו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד שלוש שעות כדי לאפשר לנגיף להדביק את התאים.לאחר הכנת שכבת הכיסוי (overlay) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הסירו את התהליל (inoculum) מהבארים. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של שכבת כיסוי לכל באר, והדגירו ב-37 °C למשך לילה ללא הפרעה. הוסיפו לבארים 200 µL של 4% PFA ב-PBS A קר מאוד (בטמפרטורת קרח), והדגירו ב-4 °C למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.לאחר הדגירה, שאבו את ה-PFA, והשתמשו ב-200 µL של PBS A לכל באר כדי לשטוף את הפלטה פעמיים. הוסיפו 100 µL של בופר חדירה (permeabilization buffer) לפלטה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמשו ב-PBS A כדי לשטוף את הפלטה פעמיים.בשלב הבא, יש להוסיף לכל באער 50 µL של נוגדן מונוקלונלי של עכבר נגד influenza type A, ולדגור בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, יש לשטוף את הבאער שלוש פעמים באמצעות 300 µL של תמיסת שטיפה. לאחר מכן, יש להוסיף לדגימות 50 µL של נוגדן משני מעז צמוד ל-HRP, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.לאחר שטיפת הבארות שלוש פעמים כפי שבוצע קודם לכן, הוסף 50 µL של סובסטרט לכל בארה, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או עד להופעה ברורה של צבע כחול. כדי להפסיק את התגובה, השתמש ב-200 µL של מים מזוקקים לשטיפת הבארות פעמיים. לאחר מכן, לאחר ייבוש הפלטה באוויר, אחסן אותה במקום חשוך.מקמו פלטת בארות באזור הסריקה של סורק שטוח, תוך שימוש במגבלת המיקום בצורת L כדי להבטיח קבלת מיקום דימוי אופטימלי וחזרתי. סרקו את הפלטה באמצעות ההגדרות המוצגות כאן. לאחר מכן, הפעילו את תוכנת קורא פלטות הבארות כדי לחשב את ריכוז הנגיף הנדרש על ידי לחיצה על כפתור Load Image לטעינת תמונה.בשלב הבא, בלשונית הסף הגלובלי (global threshold), החליקו את הפס האדום בהיסטוגרמה כדי להתאים את סף הדגימה. לאחר מכן, לחצו על כפתור העדכון (update) כדי לבחון את ההשפעה על התמונה. כעת, סמנו את תיבת הסימון של חישוב ניטרול/טיטרציה (Calculate Neutralization/Titration).לחץ על כפתור ה-Sampling כדי לכמת את אוכלוסיית התאים הזוהרים, או ICP. לאחר מכן, כאשר תתבקש, לחץ על כפתור ה-Save כדי לשמור את תוצאות הדגימה. כדי לקבל את תוצאות הטיטרציה, טען או הזן את מפת הגדרת לוח הבארות.בסעיף Titration:Optimal Virus Population צוין הסף. בחר בלשונית Titration Process כדי לחשב את תוצאות הטיטרציה. לאחר מכן, בדוק את תוצאות הטיטרציה לפני הלחיצה על כפתור Save and Close כדי לשמור את התוצאות.עיינו בתוספת S1 להוראות מפורטות יותר על התוכנה. לביצוע נטרול נגיפים, הכינו את השכבה התאימה (cell monolayer) יומיים או שלושה ימים מראש. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של VGM לכל באר בלוחית.השתמשו בעמודות 11 ו-12 עבור בקרת הווירוס ובקרת התאים, בהתאמה. הוסיפו מנות של 50 µL של סרום שעבר טיפול באנזים להרס רצפטורים (receptor destroying enzyme, או RDE), בדילול של 1:20, לשורה הראשונה של עמודות 1 עד 10. בצעו דילול סדרתי פי 2 על ידי העברה של 50 µL משורה A לשורה H, והשליכו 50 µL משורה H. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת דילול לכל באר בעמודת בקרת התאים.הוסיפו 50 µL מהנגיף לכל באער בלוח, למעט לעמודה של בקרת התאים. הדגרימו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד שלוש שעות. לאחר מכן, הסירו את האינוקולום והוסיפו את שכבת הכיסוי לכל באער.דגרו את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ללא הפרעה. לאחר מכן, קבעו וצבעו את הפלטות כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. כדי לכמת את הניטרול, הניחו פלטת בארות באזור הסריקה של סורק שטוח כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה.סרוק את הפלטה והפעל את תוכנת קורא הפלטות כדי לחשב את טעוני הנגיף הנדרשים כפי שנעשה קודם לכן. לאחר טעינה או הזנה של מפת הפלטה, ציין את סף הגבול ב-Neutralization:Infection Deduction. לאחר מכן, בחר ב-Neutralization Process כדי לחשב את הטעונים.לבסוף, בדקו את הטיטרים, ולחצו על כפתור Save and Close כדי לשמור את תוצאות הניטרול. מוצגות כאן תוצאות טיטרציה מניסויי אפיון אנטיגני אחרונים של שמונה נגיפים עם דילולים שבין 1.0 times 10 to the negative one ל-1.0 times 10 to the negative six. הגרף ממחיש כי ה-ICPs פוחתים עם עלייה בדילול הנגיף.העקומות נורמלו מול ה-ICPs של אותם נגיפים שהניבו זיהומים בכל התאים בתוך באער. בטבלה זו מפורטים דילולי הנגיף שיצרו 30% מרוויית ICP, אשר נבחרו כדילול הנגיף להכנסה עבור נטרול. איור זה מציג את התוצאות מניסוי נטרול שבו נעשה שימוש בנגיף אחד להכנסה כנגד חמישה אנטיסרומים.הגרף ממחיש את תהליך ההדבקה עם העלייה בדילול הסרום. האוכלוסייה החיובית הנורמלית בציר האנכי מייצגת את היחס של ICPs מתגובת האנטי-סרום המתאימה לעומת ה-ICP הממוצע של נגיף הייחוס. לבסוף, תורי הניטרול נקבעו כהופכיים של דילולי האנטי-סרום המתאימים להפחתה של 50%ICP.בדיקה זו מתמקדת בעקביות, במהירות ובחשיפות גילוי, כולל תיחור כמותי של נגיפי הקלט, דימות בקיבולת גבוהה ועיבוד נתונים. היא יעילה מבחינה כלכלית, ידידותית למשתמש ונעשה בה שימוש שגרתי במחקרי אנטיגנים ויראליים.

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקות מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים באמצעות תאי כליות כלבים Madin-Darby המבטאים יתר על המידה חומצה סיאלית מקושרת α2,6 בסרה. בדיקה זו משמשת לעתים קרובות עבור סרולוגיה אנושית...

בדיקת מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים בסרום אנושי

סרטון זה מדגים את בדיקת המיקרו-נטרול מבוססת הדימות לניתוח היחסים האנטיגניים בין נגיפי שפעת A ו-B. הוא מספק דרך כמותית וויזואלית להעריך את יעילותם של נוגדנים או טיפולים אחרים במניעת זיהום ויראלי.

ניתוח הקשר האנטיגני בין וירוסים באמצעות בדיקת מיקרונטרול מבוססת תמונה

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

פרוטוקול מצפני פעילות נגד יחסית-מוות mAb אנטי-TNFα באמצעות מנגנון ניטרול עם תאי ה-וואי 164 מוצג כאן. פרוטוקול זה שימושי השוואת כוח ניטרול של מולקולות שונות אותה פונקציונליות ביולוגי.

קביעת העוצמה היחסית של Anti-TNF חד-שבטיים נוגדן (mAb) על ידי Neutralizing TNF באמצעות שיטת וביו-אנליטיות וואלידציה , חוץ גופית

ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

כאן אנו מציגים שיטה cytometry זרימה מבוססת תא לזהות נוגדנים נטרול או גורמים אחרים להפריע קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים במטריצה אנושי, כגון לנוזל חוט השדרה (CSF) או בנסיוב אדם.

זיהוי נוגדנים המנטרלים את קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים עם Assay מבוססת-תא

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

תהליך עבודה מקיף של פרוטוקול מעבדה וניתוח מתוארים לבדיקה מהירה, חסכונית ופשוטה המבוססת על תאים צבעוניים כדי לזהות אלמנטים מנטרלים מול AAV6.

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

למדו אופטימיזציה של assay נייטרוליזציה מיקרו-כמותי לאפיון אנטיגני של נגיפי שפעת. שיטה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיית תאים נגועים כולה בסריקת שטח שטוחה ותוכנה ייעודית.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

גלה סרטונים נוספים