אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

מחקר זה מתאר מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

המטרה הכוללת של בדיקת מיקרו-נטרול זו היא לאפיין את כל סוגי נגיפי השפעת הנוכחיים ואת פעילותם של נוגדנים ומדידות אנטי-ויראליות בצורה כמותית, בעלת תפוקה גבוהה ורגישה ביותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כגון אפיון אנטיגני של נגיפי שפעת, נטרול כמותי של נוגדנים ופעילויות אנטי-ויראליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפיינת את כל אוכלוסיית התאים הנגועים, כולל פלאק גלוי ובלתי נראה, וזיהומים של תאים בודדים.

בדיקת המיקרו-נטרול תודגם על ידי ד"ר ייפו לין, עוזר מנהל המרכז לשיתוף פעולה של ארגון הבריאות העולמי לשפעת בלונדון. רמת הבטיחות הביולוגית, או BSL, עבור הפרוטוקול הבא היא BSL 2 עבור נגיפי שפעת עונתיים ו-BSL 3+ עבור נגיפי שפעת פנדמיים פוטנציאליים. כדי להתחיל, יש לצטט מספיק תאים לצלחות של 96 בארות.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך יומיים-שלושה כדי להגיע למפגש. באמצעות 70% אתנול, עקרו מכונת כביסה מרובת בארות והשתמשו ב-PBS או VGM כדי לשטוף אותה. לאחר מכן, השתמש ב-200 מיקרוליטר של מדיום גידול וירוסים, או VGM, כדי לשטוף את התאים המתלכדים.

שאפו את ה-VGM מהתאים, והוסיפו מיד 50 מיקרוליטר של VGM לכל באר. לאחר מכן, הוסף 900 מיקרוליטר של VGM לכל אחד מששת הצינורות הסטריליים. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של וירוס לתוך הצינור הראשון וערבב היטב.

הכינו דילולים סדרתיים של הנגיף החל מהצינור הראשון, והחליפו את הקצוות בין כל דילול. הוסף 50 מיקרוליטר מכל דילול וירוס החל מהדילול הגבוה ביותר כדי לשכפל בארות של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש כדי לאפשר לנגיף להדביק את התאים.

לאחר הכנת הכיסוי על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את החיסון מהבארות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של כיסוי לכל באר, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא הפרעה. הוסף לבארות 200 מיקרוליטר קר כקרח 4% PFA ב-PBS A, ודגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה, שאפו את ה-PFA והשתמשו ב-200 מיקרוליטר לבאר PBS A כדי לשטוף את הצלחת פעמיים. מוסיפים לצלחת 100 מיקרוליטר של מאגר חדירה, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש ב-PBS A כדי לשטוף את הצלחת פעמיים.

לאחר מכן, הוסיפו לבארות 50 מיקרוליטר לבאר של נוגדן חד שבטי של עכבר נגד שפעת מסוג A, ודגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך שעה. לאחר הדגירה, השתמש ב -300 מיקרוליטר של מאגר כביסה כדי לשטוף את הבאר שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד לעז HRP לדגימות, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר שטיפת הבארות שלוש פעמים כמו קודם, הוסיפו 50 מיקרוליטר מצע לבאר, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או עד שהתפתחות צבע כחול נראית בבירור. כדי לעצור את התגובה, השתמש ב -200 מיקרוליטר מים מזוקקים כדי לשטוף את הבארות פעמיים. לאחר מכן, לאחר ייבוש הצלחת באוויר, אחסן אותה במקום חשוך.

הנח לוחית באר באזור הסריקה של סורק שטוח, תוך שימוש במגבלת המיקום בצורת L כדי להבטיח שניתן להשיג מיקום תמונה אופטימלי וניתן לחזרה. סרוק את הצלחת באמצעות ההגדרות המוצגות כאן. לאחר מכן, הפעל את תוכנת קורא לוחות הבאר כדי לחשב את ריכוז הנגיפים הנדרש על ידי לחיצה על טען תמונה כפתור לטעינת תמונה.

לאחר מכן, בכרטיסיית הסף הכללי, החלק את הסרגל האדום בהיסטוגרמה כדי להתאים את סף הדגימה. לאחר מכן, לחץ על כפתור העדכון כדי לבחון את ההשפעה על תמונה. כעת, סמן את התיבה חשב נטרול/טיטרציה.

לחץ על כפתור הדגימה כדי לכמת את אוכלוסיית התאים הנגועים, או ICP. לאחר מכן, כאשר תתבקש, לחץ על להציל כפתור כדי לשמור את תוצאות הדגימה. כדי להשיג את תוצאות הטיטרציה, טען או הזן את מפת הגדרת לוחית הבאר.

בטיטרציה: אוכלוסיית הנגיף האופטימלית מציינת את הסף. בחר את הכרטיסיה תהליך טיטרציה כדי לחשב את תוצאות הטיטרציה. לאחר מכן, בדוק את תוצאות הטיטרציה לפני לחיצה על כפתור שמור וסגור כדי לשמור את התוצאות.

עיין בתוספת S1 להדרכה מפורטת יותר של התוכנה. כדי לבצע נטרול נגיפים, הכינו את שכבת התא יומיים-שלושה מראש. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר VGM לכל באר בצלחת.

השתמש בעמודות 11 ו-12 עבור בקרת הנגיף ובקרת התאים בהתאמה. הוסף 50 מיקרוליטר של דילול אחד ל-20 של אנזים הורס קולטנים, או RDE, סרום מטופל לשורה הראשונה של העמודות 1 עד 10. בצע דילול סדרתי כפול על ידי העברת 50 מיקרוליטר משורה A לשורה H והשלכת 50 מיקרוליטר משורה H.לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מדלל לכל באר בעמודת הבקרה של התא.

הוסף 50 מיקרוליטר של הנגיף לכל באר בצלחת, למעט עמודת הבקרה של התא. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש. לאחר מכן, הסר את החיסון, והוסף את הכיסוי לכל באר.

דגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא הפרעה. לאחר מכן, תקן והכתים את הלוחות כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. כדי לכמת את הנטרול, הנח לוחית באר באזור הסריקה של סורק שטוח כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה.

סרוק את הצלחת והפעל את תוכנת קורא צלחות הבאר כדי לחשב את הטיטר הנגיפי הנדרש כמו קודם. לאחר טעינה או הזנה של מפת לוחית הבאר, בנטרול: ניכוי זיהום ציין את הסף. לאחר מכן, בחר תהליך נטרול כדי לחשב את נקודות הטיטר.

לבסוף, בדוק את הטיטר, ולחץ על כפתור שמור וסגור כדי לשמור את תוצאות הנטרול. מוצגות כאן תוצאות טיטרציה מניסויי אפיון אנטיגניים שנערכו לאחרונה של שמונה נגיפי קלט עם דילולים בין 1.0 כפול 10 לשלילי ו-1.0 כפול 10 לשש השלילי. הגרף ממחיש כי ICPs יורדים עם עלייה בדילול הנגיף.

העקומות נורמלו כנגד ICPs של אותם נגיפים שהניבו זיהומים בכל התאים בתוך באר. בטבלה זו מפורטים דילול הנגיף שיצרו 30% מהרוויה של ICP שנבחרו כקלט דילול הנגיף לנטרול. איור זה מציג את התוצאות מניסוי נטרול באמצעות וירוס קלט אחד כנגד חמישה אנטיסרה.

הגרף ממחיש את תהליך ההדבקה עם העלייה בדילול הסרום. האוכלוסייה החיובית המנורמלת על הציר האנכי מייצגת את היחס בין ICPs מתגובת האנטי-סרא המקבילה מול ה-ICP הממוצע של נגיף הייחוס. לבסוף, טיטר הנטרול נקבעו כהדדיות של דילול האנטי-סרום המתאים להפחתת ICP של 50%.

בדיקה זו מתמקדת בעקביות, מהירות ורגישות לזיהוי, כולל טיטרציה כמותית של וירוסי קלט, הדמיה בתפוקה גבוהה ועיבוד נתונים. זה חסכוני, ידידותי למשתמש ונמצא בשימוש שגרתי במחקרים אנטיגניים ויראליים.