הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים בדיקה אימונולוגית של אלקטרופורזה נימית באמצעות פלטפורמה מסחרית. פלטפורמה זו תבחין ותכמת מטרות חלבון מדגימה ביולוגית שניתן להשיג מרקמות תרבית תאים ונוזלים ביולוגיים. התהליך בוחן חלבון על סמך גודל שנע בין שניים ל-440 קילו-דלטון.

היתרון של הליך אוטומטי זה על פני הליכים מסורתיים, כמו כתם מערבי, הוא שבדיקות אימונולוגיות אלקטרופורטיות נימיות מבטלות את הצורך בג'לים, מכשירי העברה ושטיפות ידניות. כמו כן, הכמות האבסולוטית של החלבון הנדרשת נמוכה פי 10 בערך, מה שהופך את ההליך לאידיאלי עבור סוגי תאים נדירים או דגימות מוגבלות. בנוסף, התוצאות מתקבלות תוך שלוש שעות בלבד באמצעות מערכות אוטומטיות והוכחו ככמותיות וניתנות לשחזור יותר מאשר הליכי כתמים מערביים קונבנציונליים.

הכן את הדגימות והריאגנטים מהערכה, כולל מאגר דגימות, דיתיוטרייטול, תערובת מאסטר פלואורסצנטית וסולם ביוטיניל בהתאם לתוספת המוצר של היצרן. הכינו את דגימות החלבון בשיטה המועדפת עליכם. כאן בודדנו תמצית תאים שלמים מתרביות תאים BEAS-2B.

מדללים את דגימות החלבון עם מאגר דגימה. מערבבים חלק אחד של תערובת מאסטר פלואורסצנטית של חמישה X עם ארבעה חלקים דגימה מדוללת כדי להשיג את ריכוז החלבון הסופי הרצוי. חישוב לדוגמה מוצג לייצור 70 מיקרוליטר של 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר, ריכוז חלבון סופי החל מריכוז מלאי חלבון של 1.2 מיקרוגרם למיקרוליטר.

תערובת מאסטר היא 1/5 מהנפח הכולל, במקרה זה, 14 מיקרוליטר. כדי לחשב את נפח מלאי החלבון הדרוש, הכפילו את הריכוז הסופי הרצוי בנפח הכולל וחלקו בריכוז מלאי החלבון. הפחיתו את תערובת המאסטר ונפחי המלאי מהנפח הכולל כדי לחשב את נפח מאגר הדגימה.

דנטור את הדגימות והסולם המוכנים על ידי חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שימו לב, חלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאי דנטורציה עדינים יותר. לדוגמה, 70 מעלות למשך 10 דקות כדי למנוע צבירת חלבונים ולשפר את הנדידה.

שקול אפשרות זו אם יש מריחה כבדה במשקלים המולקולריים הגבוהים יותר. הכן את דילול הנוגדנים הרצוי בדילול המצורף. שימו לב, נוגדנים משמשים בדרך כלל בריכוזים גבוהים יותר לבדיקה חיסונית מבוססת נימים מאשר לכתמים מערביים מסורתיים.

הכינו תערובת אחד לאחד של לומינול וחמצן טריים בכל שימוש. הכניסו את הדגימות והריאגנטים לתוך לוחית הבדיקה באמצעות הנפחים המוצגים בתבנית. קידוד צבע מייצג העמסה נכונה של ריאגנטים ודגימות ללוחית הבדיקה.

סולם ביוטיניל פיפטה לבאר A1, הכין דגימות לבארות A2 עד A25. הנוגדנים שסופקו מדללים לבארות B1 עד B25 ולבאר C1. נוגדן ראשוני לבארות C2 עד C25. סטרפטווידין HRP לבאר D1. נוגדן משני לבארות D2 עד D25.

ותערובת לומינול-מי חמצן לבארות E1 עד E25. הוסף מאגר כביסה לשלוש השורות הראשונות של בארות הצלחת האמצעיות הגדולות יותר. הפעל את מכשיר הבדיקה החיסונית הנימים ופתח את התוכנה הנלווית.

טען את המחסנית הנימים ואת לוחית הבדיקה למכונה בהתאם להוראות היצרן והתחל בריצה. בסיום הריצה, בדוק שתקני הפלואורסצנט מזוהים כהלכה ונכונים במידת הצורך. בנוסף, ודא שהסולם הביוטינילי מציג את שיאי הגודל הנכונים עבור הערכה בה נעשה שימוש.

עיין במדריך העזר המהיר של היצרן או במדריך המוצר לקבלת פרטים נוספים. אופטימיזציה של תנאי בדיקה כגון זמן חשיפה, ריכוז חלבון ודילול נוגדנים חשובים להשגת תוצאות מדויקות וניתנות לשחזור. תנאים אלה הם ספציפיים לכל שילוב נוגדנים של מערכת המודל ולכן יש לקבוע אותם באופן אמפירי עבור כל בדיקה חדשה.

היכולת לייצר תוצאות כמותיות תלויה בניתוח של זמן חשיפה שבו מצע הלומינול אינו מתרוקן במהירות, שכן דלדול המצע גורם לאובדן אות או שחיקת אותות. ניתן לקבוע זאת על ידי בחינת הנתונים בזמני חשיפה שונים לכימילומינסנציה כפי שמוצג באיור 2. החשיפות עם המכשיר בו נעשה שימוש נעו בין חמש ל-480 שניות.

תצוגות ליין הראו ירידה בריכוזי החלבון עבור תמציות BEAS-2B שנבדקו עם נוגדן p53 DO-1 בדילול של 1 עד 500. מקדמי אות כימילומינסנציה המדווחים כגבהי שיא בתוכנת המכשיר מונחים על גבי זה. עוצמות הלהקות החזותיות מותאמות אוטומטית על ידי המכשיר ואינן ניתנות להשוואה מפאנל אחד למשנהו.

מקדם האות יורד עם חשיפות ארוכות יותר ברצף אם הלומינול מתרוקן, כפי שניתן לראות כאן. האות מתחיל להיעלם והשיא מתפצל בשתי החשיפות הארוכות ביותר. בשל כך, נבחר זמן חשיפה קצר של 15 שניות לניתוח נתונים.

יש לבצע אופטימיזציה של קלט החלבון הכולל עבור כל בדיקה ומערכת מודל מסוימת. לצורך הערכה כמותית, יש לבצע מדידות בטווח הדינמי הליניארי של כל בדיקה. כאשר שינויים באות, כפי שנמדד על ידי שטח שיא, הם פרופורציונליים לשינויים בכמות החלבון בדגימה.

טיטרציה של ליזאט מציגה את תצוגות הנתיב של ליזאט BEAS-2B כאשר נבדק עם נוגדן אחד עד 500 p53 DO-1 או נוגדן אחד עד 50 אלפא-טובולין. ניתוח רגרסיה ליניארית מאשר שהבדיקות הן ליניאריות על פני כל הטווח שנבדק. ריכוזי החלבון הכוללים באמצע הטווח הליניארי נבחרו כדי להתאים לשונות חלבון המטרה הפוטנציאלית בכל כיוון.

כשיקול אופטימיזציה אחרון, יש להעריך דילול נוגדנים ראשוני נכון. שימוש בנוגדנים בריכוזי תפירה מסייע להבטיח שכל שינויי האות הנמדדים נובעים אך ורק משינויים בכמות החלבון. שתי דגימות חלבון BEAS-2B, המיוצגות על ידי הנקודות הכחולות והכתומות, נבדקו עם נוגדן אלפא-טובולין מדולל סדרתי.

אות הכימילומינסנציה, שנמדד כאזור שיא, תוכנן כנגד דילול נוגדנים. רוויה נצפתה ליד דילול של 1 עד 50, שם העקומה מתחילה מישור ניכר. לכן אחד עד 50 נבחר כדילול האופטימלי לנוגדנים אלה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להרגיש בנוח להכין דגימות, לטעון דגימות ולבצע ניתוח במכשיר הבדיקה החיסונית מבוסס הנימים של ProteinSimple Wes. לאחר ששלטת בהליך זה, ניתן לבצע את כל הריצה תוך שלוש שעות עם 25 דגימות. בעת ניתוח ריצה, חשוב לבצע בקרת איכות עבור כל נימים ודגימה.

זה כולל אימות תקנים פלואורסצנטיים בסולם ביוטיניל. אם פסגות מזוהות באופן שגוי, יש להשתמש בתוכנת הניתוח בעיקר כדי לזהות פסגות נכונות ולחסל פסגות שזוהו באופן שגוי. כמו בכל טכניקות הביולוגיה המולקולרית במעבדה, יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים כדי להגן על עצמך ועל הדגימות שלך.

זה כולל מעיל מעבדה, כפפות, משקפי מגן ונעליים סגורות. חשוב לזכור שיש לבצע מיטוב לכל יעד חדש שנמדד או כאשר נעשה שימוש במקורות דגימה שונים. שלבי האימות והמעקב כוללים הערכת ספציפיות הנוגדנים והאות באמצעות חלבון מטוהר או אפיטופ.

בדיקת הטווח הדינמי של הבדיקה באמצעות סדרה של דילול הדגימה ואופטימיזציה של דילול הנוגדנים על ידי הערכת רוויית האות על פני טווח ריכוז הנוגדנים. לאחר אופטימיזציה, הליך חיסוני נימי זה אמור לספק שיטה מהירה וכמותית יותר למדידת חלבון מטרה של דגימות ביולוגיות בהשוואה לשיטות מסורתיות כגון כתם מערבי.