מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

המטרה הכללית של פרוצדורה ניסויית זו היא לחקור השפעות ביולוגיות הנגרמות מקוויטציה בתוך כלילה מיקרופלואידית, תוך שימוש בתבנית פנין לשליטה מדויקת ביצירת בועות טנדם ובמיקום ובצורה של תאי מטרה בודדים. מערכת מיקרופלואידית זו מאפשרת ניסויים בבועות קוויטציה חולפות ובתאים, דבר הרלוונטי ליישומים טיפוליים ולפעולות אקוסטיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו נובע מהשיפור בדיוק בזכות התבנית הפנינית.

שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של תאים בודדים, והיא מאפשרת טעינה ברצף גבוה הודות לאינטראקציה אמינה בין בועות. הדגמה חזותית של ההליכים היא קריטית, שכן שלבי תבנית הפני וההכנת התאים בשבב הם מורכבים וכוללים טכניקות וטיפים שונים. בצע את כל הליכי המיקרו-פבריקציה בחדר נקי תוך לבישת חליפת חדר נקי.

תכננו את השטח של כל נקודת זהב בטווח של 25 עד 30 מיקרון רבוע, כך שיהיה גדול מספיק כדי לספוג אנרגיית לייזר ליצירת בועות, אך קטן מספיק כדי למנוע היצמדות של תאים בודדים אליה. נקו את שקופית הזכוכית במכסה מנוע כימי בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ולאחר מכן עברו למכסה של הציפוי בסבב (spin coating). תכנתו את מכשיר הציפוי בסבב להאיץ ל-1000 RPM במשך שתי שניות ולשמור על מהירות זו למשך חמש שניות, ולאחר מכן להאיץ ל-3000 RPM במשך שלוש שניות ולשמור על מהירות זו למשך 30 שניות.

בשלב הבא, קבעו את שקופית הזכוכית למכשיר ה-spin coder באמצעות הוואקום. לאחר מכן, כסו את השקופית ב-P20 והתחילו את מחזור הסבב. לבסוף, מרחו NFR negative photo resist תוך שימוש באותו מחזור.

כעת, אפו את השקופית על פלטה חמה בטמפרטורה של 95 °C למשך 60 שניות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, בצעו את הפוטוליתוגרפיה. התקינו את מסכת הכרום על מכשיר יישור המסכות (mask aligner) וודאו שצד התבנית פונה כלפי מטה אל השקופית.

לאחר מכן, הגדירו את מתכון הפוטוליתוגרפיה למצב חשיפה חזקה (hard exposure) עם חשיפה ל-UV למשך תשע שניות, ויישרו את מצע הזכוכית עם המסכה. לאחר החשיפה ל-UV, חממו את השקף בטמפרטורה של 95 °C למשך דקה אחת, ולאחר מכן הניחו לו להתקרר כפי שנעשה קודם לכן. כדי לפתח את התבנית על השקף, הניחו אותו בתמיסת מפתח למשך 60 שניות, לאחר מכן שטפו את השקף במים מזוקקים וייבשו אותו באמצעות גז חנקן.

לאחר אישור התבנית באמצעות בדיקה מיקרוסקופית, חממו את השקופית בטמפרטורה של 120 °C למשך חמש דקות והניחו לה להצטנן לטמפרטורת החדר. כעת, נקו את השקופית באמצעות פלסמה במכונת התיסור רדיקלי של יונים (reactive ion etching) למשך 90 שניות בלחץ של 500 tor ובהספק של 100 watts. בעזרת מאדה E-beam, הצמידו את הדגימה למחזיק הפלטה באמצעות סרט הדבקה.

תכנתו את המכשיר להשקיע שכבה של 5 nanometer של טיטניום, ואחריה שכבה של 15 nanometer של זהב. לאחר השלמת שלב זה, פתחו את המכשיר לאוורור. לאחר מכן, השרו את השקף למשך הלילה בבכור עם ממס להסרת פוטורזיסט (photoresist remover) כדי להסיר את הזהב המונח מעל ה-NFR resist.

ביום למחרת, שטפו את השקופית באצטון, לאחר מכן ב-IPA, ואז ייבשו אותה בעזרת חנקן. שטפו את השקופית במים מזוקקים (DI water) וייבשו אותה שוב בעזרת חנקן. כעת, חממו את השקופית בטמפרטורה של 115 °C למשך חמש דקות.

לאחר מכן, נקה את שקופית תבנית נקודות הזהב באמצעות מכשיר oxygen plasma asher בהספק של 100 watts למשך 90 seconds. קבע את השטח של כל אי המקודד ב-fibronectin להיות בין 700 ל-900 square microns כדי לאפשר פריסה נאותה של תאי hela באזור ריבועי, תוך מזעור הסיכויים לצבירה של מספר תאים על האי. תהליך הייצור דומה מאוד לזה של תבנית הזהב.

בצעו ציפוי סבב (Spin coating) של השקף כפי שנעשה בעבר באמצעות פוטורזיסט חיובי S18, ואפו את הציפוי בטמפרטורה של 115 degrees celsius. לאחר מכן, בצעו פוטוליתוגרפיה, תוך התאמה של הסימנים שעל המסכה לאלו שעל התשתית. בדקו את התבנית בחלק המרכזי כדי לאשר את הזווית הנכונה, והתאימו את מרחק ה-standoff מנקודות הזהב לתבנית ה-H.

בצע את חשיפת ה-UV למשך תשע שניות ללא אפייה לאחר החשיפה (post bake). ההבדל הבא הוא ששלב הפיתוח אורך 45 שניות בלבד. עבור תהליך התיסור ביוניים ריאקטיביים (reactive ion etching), הגדר את הפרמטרים ל-500 tor, 100 watts ו-90 שניות.

לאחר מכן, טפטפו טיפה של תמיסת פסיבציה של PLLG peg על חתיכת סרט פאראפין והצמידו את התמיסה לצד הדפוס של השקף. הימנעו מלכידת בועות אוויר. לאחר 45 דקות, הסירו את השקף מהסרט.

שטפו את הזכוכית במים מזוקקים (DI water) ולאחר מכן ייבשו אותה באמצעות חנקן. לאחר מכן, השריו את הזכוכית באופן רציף במסיר פוטורזיסט (photoresist remover) 1165, ולאחר מכן בתמיסה של 50 אחוזים של 1165 במים מזוקקים (DI water).

לאחר מכן, השתמשו במים מזוקקים (DI water) בלבד. במהלך כל רחצה, ערבבו את התמיסה במכשיר אולטרסאונד למשך 90 שניות. כעת, ייבשו את השקף על פלטה מחממת, לאחר מכן אטמו אותו במייבש (desiccator) ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 degrees celsius.

הרכיבו את השקופיות לתוך שבב מיקרו-ערוצים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שימו לב להגן על האזור בעל התבנית של מצע הזכוכית באמצעות לוח PDMS קטן לפני השימוש בתהליך של חריטה יונית ריאקטיבית (RIE) להסרת ה-PLLG peg מהאזור הפריפריאלי. הוציאו את הזכוכית בעלת התבנית ממכונת ה-RIE והסירו את לוח ה-PDMS הקטן.

לאחר טיפול ב-PDMS של המיקרו-תעלה במינון מופחת של פלסמת חמצן, יישרו אותו ביחס למצע הזכוכית המודפס תחת סטריאוסקופ. הביאו את ה-PDMS של המיקרו-תעלה ואת מצע הזכוכית המודפס למגע קונפורמי. כעת, ניתן להשתמש בשבב.

ראשית, בצעו הטרייה (priming) של השבב על ידי זרימת PBS בערוץ המיקרו למשך 30 דקות בקצב של 1 µL לדקה. לאחר מכן, הזרימו לשבב תמיסת פיברונקטין למשך 45 דקות באותו קצב זרימה. בזמן ההמתנה, הכינו את התאים בריכוז של five million cells per milliliter.

מצב בריאותי והצפיפות הגבוהה של התאים (confluence) הם קריטיים להליך זה. לאחר מכן, החליפו את התמיסה הזורמת דרך השבב ב-PBS והגדילו את קצב הזרימה ל-10 µL לדקה. הניחו ל-PBS לזרום במשך חמש דקות.

בשלב הבא, הזרק את התאים שהוכנו לתוך השבב באמצעות מזרק. כאשר טיפה אחת תזרום החוצה מהצינור, הפסק את ההזרקה וסגור את מוצא השבב בעזרת תסמיך. לאחר מכן, הנח את השבב באינקובטור למשך 30 דקות.

בהמשך, שחררו את פתח היציאה ושטפו את השבב במצע גידול תאים בקצב של 10 µL לדקה במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הפחיתו את קצב הזרימה ל-0.75 µL לדקה והעבירו את השבב ואת המשאבה למדגרה למשך שעתיים. לאחר שעתיים, התמידו ביצירת בועות בטור (tandem bubble generation) תוך צפייה בשבב תחת מיקרוסקופ הפוך עם שני לייזרים פולסיביים של NDI תחת בקרת תזמון המופנים לתבנית נקודות הזהב, ובסיוע מצלמה מהירה המוכנה ללכוד את התוצאות.

עבור בועות של 50 מיקרון, הגדירו את ההשהיה בין שני הלייזרים ל-2.5 מיקרו-שניות ואת העוצמה שלהם לעשרה מיקרו-ג'ול. לאחר מכן, סנכרנו את ההקלטה של המצלמה המהירה עם הלייזרים והקליטו בשני מיליון פריימים לשנייה עם חשיפה של 200 ננו-שניות. באופן זה, נרשמות הדינמיקה של התפשטות הבועות, קריסתן, האינטראקציה בין בועות והיווצרות סילון.

אינטראקציות בין בועות ומגוון אפקטים ביולוגיים המושרים על ידי קוויטציה נחקרו ברמת התא הבודד באמצעות הטכניקה המתוארת, כגון אינטראקציות חולפות של בועות טנדם (tandem bubbles) עם היווצרות סילון, ויזואליזציה של שדה הזרימה הנובע מכך וחישוב מהירות הסילון. זרימת סילון כיוונית סביב בועת טנדם היא במהירות של כעשרה מטרים לשנייה, ברוחב של כעשרה מיקרון, ולפיכך היא מסוגלת להפיק מאמץ גזירה אימפולסיבי ומקומי ומדרג מאמצים על תאי מטרה סמוכים. כמו כן, נחקרה דפורמציה של ממבנה התא המושרה על ידי בועת טנדם.

עיוות והתאוששות של ממברנה מודגשים על ידי תזוזה של חרוזיים פונקציונליים המחוברים לקצה המוביל של ממברנת התא. מתוך הקואורדינטות של שלשיית חרוזים סמוכים, חושב המתיחות השטחית המקומית. סכימה זו מראה את השינוי המקסימלי בשטח במיקומים שונים על פני השטח של התא.

החלק הקדמי נמתח בעיקר, בעוד שהחלק האחורי או הצדדים הלטראליים של התא נדחסים, מה שמעיד על הטרוגניות ועיוות של התא שנוצרו כתוצאה מזרימת הסילון המושרה על ידי בועות בטור (tandem bubble). השונות הזמנית של מאמץ השטח בקצה הקדמי של התא מורכבת ממספר תנודות מהירות, שלאחריהן מתיחה גדולה ומתמשכת למשך כ-100 מיקרו-שניות, ולאחר מכן התאוששות הדרגתית בלוח זמנים של מספר מילי-שניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור אינטראקציה נשלטת בין בועות כדי לחקור את ההשפעות הביולוגיות על תאים בודדים בעלי צורה ומיקום מבוקרים באמצעות דפוס פני שטח.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע מדדים נוספים, כגון דילול השלד התאי (cytoskeleton thinning) ודימוי נצמד (conjugal imaging), כדי לחקור את סידור מחדש של השלד התאי בעקבות טיפול בבועות טנדם. לאחר פיתוחה, תסלול טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האולטרסאונד הסוב-פטרטי (subpretic ultrasound) לחקור אפקטים ביולוגיים המושרים על ידי לכידה ברמת התא הבודד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על התמזגות (confluency) ומצב תאים טובים על מנת להבטיח הצלחה בתהליך תבניית התאים (cell patterning).

אל תשכחו שעבודה עם כימיקלים של חדר נקי ולייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ומשקפי מגן ללייזר בעת ביצוע הליך זה.