מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא לחקור את ההשפעות הביולוגיות הנגרמות על ידי קוויטציה בכליאה מיקרופלואידית באמצעות דפוס פני השטח כדי לשלוט במדויק ביצירת בועות טנדם ובמיקום וצורה של תאי המטרה הבודדים. מערכת מיקרופלואידית זו מאפשרת ניסויים בבועות ותאי קוויטציה הרלוונטיים לפרסום טיפולי וקולי ולתפעול קול. היתרון העיקרי של טכניקה זו נובע משיפור הדיוק מעיצוב פני השטח.

זה מאפשר לנו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של תאים בודדים ומהווה עומס זרם גבוה מאינטראקציה אמינה של בועות-בועה. הדגמה חזותית של ההליכים היא קריטית מכיוון שדפוס פני השטח והכנת התאים בשלבי השבב מורכבים הכוללים טכניקות וטיפים שונים. בצע את כל הליכי המיקרו-ייצור בחדר נקי תוך לבישת חליפת חדר נקי.

תכנן את השטח של כל נקודת זהב בטווח של 25 עד 30 מיקרון רבוע, כך שיהיה גדול מספיק כדי לספוג אנרגיית לייזר ליצירת בועות, אך קטן מספיק כדי למנוע תאים בודדים להיצמד אליו. נקה את שקופית הזכוכית במכסה מנוע כימי בהתאם לפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן המשך למכסה המנוע עם ציפוי הסיבוב. תכנת את קודן הספין להאיץ ל-1000 סל"ד תוך שתי שניות ולשמור על מהירות זו למשך חמש שניות ואז לגרום לו להאיץ ל-3000 סל"ד במשך שלוש שניות ולשמור על מהירות זו למשך 30 שניות.

לאחר מכן, אבטח את מגלשת הזכוכית למקודד הסיבוב באמצעות הוואקום. לאחר מכן, כסו את השקופית ב-P20 והתחילו את מחזור הסחיטה. לאחר מכן, החל התנגדות לתמונות שליליות NFR באמצעות אותו מחזור.

כעת, אופים את השקופית על צלחת חמה בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר בצע את הפוטוליתוגרפיה. הרכיבו את מסכת הכרום על קשתיות היישור של המסכה וודאו שצד התבנית פונה כלפי מטה לכיוון השקופית.

לאחר מכן, הגדר את מתכון הפוטוליתוגרפיה למצב חשיפה קשה עם תשע שניות של חשיפה ל-UV ויישר את מצע הזכוכית עם המסכה. לאחר החשיפה ל-UV, אופים את השקופית בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז נותנים לה להתקרר כמו קודם. כדי לפתח את התבנית על השקופית, הנח אותה בתמיסת מפתח למשך 60 שניות, ולאחר מכן שטוף את השקופית במים מזוקקים וייבש אותה בגז חנקן.

לאחר אישור התבנית בבדיקה מיקרוסקופית, אופים את השקופית בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ונותנים לה להתקרר לטמפרטורת החדר. כעת, נקה את המגלשה עם פלזמה במכונת תחריט היונים הריאקטיבית למשך 90 שניות ב-500 טור ו-100 וואט. בעזרת מאייד E-beam, הדביקו את הדגימה למחזיק הצלחת.

תכנת את המכונה להפקיד שכבה של 5 ננומטר של טיטניום, ואחריה שכבה של 15 ננומטר של זהב. לאחר השלמת מיקום זה, אווררו את המכונה. לאחר מכן, יש להשרות את השקופית למשך הלילה בכוס של ממס מסיר פוטו-רזיסט כדי להסיר את הזהב המונח על גבי התנגדות ה-NFR.

למחרת יש לשטוף את השקופית באצטון, ואחריה IPA ולאחר מכן לייבש אותה בחנקן. שוטפים את השקופית במי DI ומייבשים אותה שוב עם חנקן. כעת, מחממים את המגלשה בחום של 115 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, נקו את שקופית דפוס נקודות הזהב באמצעות אשר פלזמה חמצן ב-100 וואט למשך 90 שניות. הגדר את השטח של כל אי מקודד פיברונקטין להיות בטווח של 700 עד 900 מיקרון רבוע כדי לאפשר התפשטות נאותה של תאי הלה באזור מרובע תוך מזעור הסיכוי להצטברות תאים מרובים על האי. הייצור דומה מאוד לזה של דוגמת הזהב.

סובב את השקופית כמו קודם באמצעות התנגדות לאור חיובית S18 ואפה על הקידוד ב -115 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע פוטוליתוגרפיה, יישור הסימנים על המסכה עם אלה שעל המצע. בדוק את התבנית בחלק המרכזי כדי לאשר את הזווית הנכונה והתאם את מרחק הניתוק מנקודות הזהב לתבנית H.

הפעל את החשיפה ל-UV למשך תשע שניות ללא אפייה לאחר האפייה. ההבדל הבא הוא ששלב הפיתוח לוקח רק 45 שניות. עבור תחריט היונים הריאקטיבי, הגדר את הפרימים ל-500 טור 100 וואט ו-90 שניות.

לאחר מכן, מרחו טיפה של תמיסת פסיביות יתד PLLG על פיסת סרט פרפין וסנדוויץ' את התמיסה לצד התבנית של השקופית. הימנע מלכידת בועות. לאחר 45 דקות, הסר את השקופית מהסרט.

שטפו את השקופית במי DI ולאחר מכן יבשו אותה בחנקן. לאחר מכן, יש להשרות את השקופית ברצף במסיר פוטו-רזיסט 1165. ואז 50 אחוז 1165 במי DI.

ואז פשוט מים DI. במהלך כל אמבטיה, יש לערבב את התמיסה באמבט אולטרסאונד למשך 90 שניות. כעת, יבש את השקופית על פלטה חמה, ואז אטום אותה בחומר ייבוש ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

הרכיבו את השקופיות לשבב מיקרו-ערוץ כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שימו לב היטב כדי להגן על האזור המעוצב של מצע הזכוכית עם לוח ה-PDMS הקטן לפני שתשתמשו בתחריט יונים תגובתי כדי להסיר את יתד ה-PLLG מהאזור ההיקפי. אחזר את הזכוכית המעוצבת ממכונת ה-RIE והסר את לוח ה-PDMS הקטן.

לאחר טיפול ב-PDMS המיקרו-ערוצי במינון מופחת של פלזמת חמצן, יישר אותו למצע הזכוכית המעוצב תחת סטריאוסקופ. הבא את ערוץ המיקרו PDMS ואת מצע הזכוכית המעוצב במגע קונפורמי. כעת, המשך להשתמש בשבב.

ראשית, הפעילו את השבב על ידי הזרמת PBS במורד המיקרו-ערוץ למשך 30 דקות במיקרוליטר אחד לדקה. לאחר מכן יש להחדיר לשבב תמיסת פיברונקטין למשך 45 דקות באותו קצב זרימה. בזמן ההמתנה, הכינו את התאים בחמישה מיליון תאים למיליליטר.

מצב בריא ומפגש גבוה הם קריטיים להליך זה. מאוחר יותר, החלף את התמיסה הזורמת דרך השבב ב- PBS והגדל את קצב הזרימה לעשרה מיקרוליטר לדקה. תן ל-PBS לזרום במשך חמש דקות.

לאחר מכן, הזרקו את התאים המוכנים לשבב בעזרת מזרק. כאשר טיפה אחת זרמה מהצינור, עצור את ההזרקה והדק את השקע. לאחר מכן, הניחו את השבב בחממה למשך 30 דקות.

מאוחר יותר, שחרר את השקע ושטוף את השבב במדיום תרבית תאים במהירות של עשרה מיקרוליטר לדקה למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הורידו את הזרימה ל-0.75 מיקרוליטר לדקה והעבירו את השבב והמשאבה לחממה למשך שעתיים. לאחר שעתיים, המשיכו ביצירת בועות טנדם תוך צפייה בשבב תחת מיקרוסקופ הפוך עם שני לייזרי NDI פועמים על בקרות תזמון המכוונות לתבנית נקודת הזהב ועם מצלמה במהירות גבוהה המוכנה ללכוד את התוצאות.

עבור בועות של 50 מיקרון, הגדר את ההשהיה בין שני הלייזרים ל-2.5 מיקרו-שניות והגדר את עוצמתם לעשרה מיקרו-ג'אול. לאחר מכן, סנכרן את הקלטת המצלמה המהירה עם הלייזרים ובצע הקלטות בשני מיליון פריימים לשנייה עם חשיפות של 200 ננו-שניות. לפיכך, הדינמיקה של התפשטות בועה, אינטראקציה בין בועה לקריסה והיווצרות סילון נרשמת.

אינטראקציות בועות-בועות ומגוון השפעות ביולוגיות הנגרמות על ידי קוויטציה נחקרו ברמת התא הבודד באמצעות הטכניקה המתוארת, כגון אינטראקציות חולפות של בועות טנדם עם היווצרות הסילון, הדמיה של שדה הזרימה שנוצר וחישוב מהירות הסילון. זרימת הסילון הכיוונית סביב בועת הטנדם היא בסביבות עשרה מטרים לשנייה, רוחבה כעשרה מיקרונים ולכן היא מסוגלת לייצר מתח ומתח אימפולסיבי ומקומי על תאי מטרה סמוכים. נחקר גם עיוות קרום התא המושרה על ידי בועות טנדם.

עיוות והתאוששות הממברנה מודגשים על ידי תזוזה של חרוזים פונקציונליים המחוברים לקצה המוביל של קרום התא. מהקואורדינטות של שלישיית חרוזים סמוכים, חושב המתח המקומי. סכימה זו מציגה את שינוי השטח המקסימלי במיקומים שונים על פני התא.

הקצה המוביל נמתח בעיקר, בעוד שהקצה האחורי או הצדדים הצדדיים של התא דחוסים ומעידים על הטרוגניות ועיוות תאים המיוצרים על ידי זרימת הסילון המושרה על ידי בועת הטנדם. הווריאציה הזמנית של מתח השטח בקצה המוביל של התא מורכבת מכמה תנודות מהירות ואחריהן מתיחה גדולה ומתמשכת למשך כ-100 מיקרו-שניות, והתאוששות הדרגתית לאחר מכן בטווח זמן של מספר אלפיות השנייה. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור אינטראקציה של בועות-בועות שניתנת לשליטה כדי לחקור את ההשפעות הביולוגיות של תאים בודדים עם צורה ומיקום מבוקרים מדפוסי פני השטח.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו דילול שלד התא והדמיה זוגית כדי לחקור סידור מחדש של שלד התא של הטיפול בבועות טנדם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האולטרסאונד התת-פרטי לחקור את ההשפעות הביולוגיות הנגרמות על ידי שבי ברמת התא הבודד. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מפגש תאים טוב ותנאי להצלחה במהלך דפוס התאים.

אל תשכח שעבודה עם כימיקלים ולייזרים לחדר נקי עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפי לייזר בעת ביצוע הליך זה.