חלון על המיקרו: מערכות Microfluidic פשוט לחקר התחבורה מיקרוביאלית בתווך נקבובי

אנו מדגימים כי באמצעות שימוש במכשירי שבב אקולוגי, מבנים פיזיים וראשי לחץ יכולים להיות קבועים או מגוונים. בעוד שהשפעת תכונות הנוזל של כימיית פני השטח או מאפייני החלקיקים או החיידקים נחקרת באופן שיטתי באמצעות ניסויי הובלה באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק לא פתוגני המבטא זן חיידקי VIO, אנו מדגימים את החשיבות של מבנה בית הגידול, תנאי הזרימה וגודל החיסון על תופעות תחבורה בסיסיות. תוכנה מיקרופלואידית השקפה משכנעת על עולם נסתר.

היי, דימיטרי מרקר שלנו ממכון ונדרבילט לחינוך אינטגרטיבי לשיקום ביו-סיסטם באוניברסיטת ונדרבילט. ואני דיוויד שפר, מהנדס מחקר ופיתוח כאן במעבדות Viro. היי, אני לסלי שו מהמחלקה לחומרים כימיים והנדסה ביו-מולקולרית במרכז למדע והנדסה סביבתית באוניברסיטת קונטיקט, ואני נוסף גם דיקוט מזברה.

היום אנו הולכים להראות לכם נוהל ליצירת מערכי בתי גידול מיקרופלואידיים מודולריים למדעי הסביבה הבסיסיים ולמחקר הנדסי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של מבנים בקנה מידה מיקרומטרי על אינטראקציות הובלה מיקרוביאליות באמצעי יער. אז בואו נתחיל.

השלב הראשון ביצירת מכשיר מיקרופלואידית הוא לצייר פריסה דו מימדית של המכשיר בשרטוט בעזרת מחשב או בתוכנת CAD. השתמשנו ב- AutoCAD, אך קיימות גם תוכניות ציור אחרות, כגון רמז או ציור אלמוגים. התוכנה מאפשרת למתכנן לשכפל בנאמנות מבנים פיזיים לאורך שדה מקרוסקופי, בעוד שתכונות בודדות מוגדרות ברזולוציה של פחות מחמישה מיקרון.

משרטוט ה-CAD נוצרת מסיכת צילום. אנו משתמשים במסכת כרום המיוצרת על ידי Advanced Reproductions Corporation, בקצה הצפוני של מסצ'וסטס. השלבים הבאים של ייצור מכשירים מיקרופלואידיים מתרחשים בחדר נקי כדי ליצור מאסטר.

פרוסת סיליקון נקייה מצופה בפוטו-רזיסט בקודן ספין. ראשית, הוופל מחובר לפלטפורמת קודן הספין וכמה גרמים של SU 8 20 25 פוטו-רזיסט מוזגים על מרכז הוופל. לאחר מכן מסובבים את הוופל למחזור התפשטות ראשוני של 15 שניות ב-500 סל"ד, ואחריו מחזור ציפוי דק של 4,000 סל"ד למשך 35 שניות.

לאחר הסיבוב, מניחים את הוופל על פלטה חמה למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס כדי לנדף עודפי ממס. השלב האחרון בהכנת הוופל הוא הסרת חרוז הקצה. זה נעשה על ידי החזרת הפרוסה למקודד הספין והחלת זרם קבוע של מסיר מהירות קצה SUA על הקצה החיצוני של הפרוסה המצופה.

השלב הבא הוא לעצב את הפוטו-רזיסט על ידי חשיפה סלקטיבית לאור UV. ראשית, הוופל המצופה מונח על משטח ישר ומסכת הכרום מונחת ישירות מעל. סרט מיסוך אדום אודם חוסם את העברת הדפוסים מחוץ לאזור הרצוי.

לאחר מכן, מנה של 300 מילי-JUUL לסנטימטר רבוע של אור UV מועברת לפרוסה המצופה דרך המסכה באמצעות מערכת נשיאה נקודתית. לבסוף, הוופל נאפה במשך 15 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס כדי לקשר בין האזורים החשופים לאור של הפוטו-רזיסט ולהפוך אותם לבלתי מסיסים. השלב האחרון ביצירת המאסטר הוא הסרת האזורים הלא מקושרים של הפוטו-רזיסט ולהשאיר אחריהם מבני תבליט מוגבהים.

ראשית, הפרוסה מוחזרת פעם נוספת למקודד הספין ומכוסה בפתרון המפתח. המפתח נשאר על הוופל המצופה כחמש דקות ולאחר מכן מסובב, וכתוצאה מכך דפוס ברור על הוופל. כל שאריות שנותרו נשטפות על ידי התזת אלכוהול איזופרופיל על הוופל המסתובב.

אנו משתמשים במהירות סיבוב של 2200 סל"ד לשלב זה למשך כחמש עד 10 שניות. לבסוף, המאסטר המוגמר מיובש באמצעות זרם גז חנקן ומאוחסן בכלי עד שהוא נחוץ ליציקת מכשיר. אנו מייצרים מכשירים מיקרופלואידיים באמצעות אלסטומר סיליקון פולימתיל אלן.

ראשית, חומר הבסיס וחומר הריפוי מועברים ביחס משקל של 10 לאחד לכוס פלסטיק. לאחר מכן, התערובת מעורבבת. אנדי בעבע באמצעות מערבל מיזוג חושב AR 100.

לאחר השלמת המחזור, PDMS נוזלי נשפך באופן שווה על המאסטר. לאחר מכן, הצלחת המכילה את המאסטר ואת ה-PDMS הלא נרפא מוכנסת לתא ואקום כדי לנקות את הגז. בועות הפולימר מופיעות כמעט מיד.

הסרת הגז נמשכת עד שכל הבועות נעלמות. המנה מוכנסת לתנור ישר בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי לאפשר קישור צולב של פולימר. ואז ה- PDMS הנרפא מוסר בזהירות מהמאסטר הרב-פעמי.

ארבעת הקצוות הראשונים נחתכים היטב מחוץ לאזור המעוצב באמצעות אזמל, המכשיר מתקלף מהפרוסה המעוצבת באמצעות פינצטה. ניתן לקצץ את שולי המכשיר באמצעות מספריים במידת הצורך. ניתן להפריד תת-קטע של המכשיר משאר התקן ה-PDMS היצוק.

לאחר מכן, חורי גישה מנוקבים דרך ה-PDMS. אנו משתמשים באגרופי ביופסיה הזמינים מסחרית במספר גדלים שונים המותקנים על סוכה קטנה. לחץ על ליבות PDMS מוסרות באמצעות מלקחיים.

לבסוף, מנקים את המכשיר הגזום והאגרוף באמצעות אלכוהול איזופרופיל וספוגית פוליפרופילן עם קצף. המכשיר מיובש באמצעות חנקן, ואז מכניס לתנור כדי להסיר את כל עקבות הממס. השלב האחרון בייצור מכשיר מיקרופלואידית הוא הדבקת ה-PDMS למצע שקופיות זכוכית, ואז מילוי תחילה בנוזל.

מכשיר ה-PDMS ומגלשת זכוכית ממוקמים כאשר משטח ההדבקה מרווח כלפי מעלה למנקה פלזמה. בניסוי זה, אנו משתמשים במנקה פלזמה PDC 32 G. לאחר יצירת הוואקום והפלזמה הסגולה הכחולה נראית, מכוון טיימר למשך 30 שניות.

מחולל הפלזמה כבוי. החדר מופעל בלחץ מחדש, והמכשיר והמחוון שנלקחו מהתא ומשטחי ההדבקה מונחים במגע. בהוצאת הרכיבים המופעלים מהתא, חשוב לנוע במהירות כדי שהמשטחים יישארו פעילים.

לחץ עדין עוזר להבטיח קשר טוב. איכות הקשר נבדקת על ידי משיכה בפינה בעזרת מלקחיים. לאחר מכן ניתן למלא את הפנים ההידרופילי בקלות בתמיסה מימית כגון אמצעי חיץ או דה-יונים.

נוזל מים מוזרם לכל מקור היטב ודרך תא הזרימה המיקרו-נקבובי המתאים. לאחר שכל התאים מלאים, שכבה דקה של PDMS נרפא מונחת על כל המכשיר כדי לעזור לעכב את האידוי ולשמור על סטריליות. כדי לכייל זרימה מונעת לחץ במכשיר, טען מראש את תאי הזרימה המיקרו-מובנים במים דה-יונים, הנח מודול זרימה, המשמש כממשק אספקת נוזלים ואיטום סטרילי על גבי המכשיר.

ניתן להשתמש במודול זרימה זה בפני עצמו או לחבר אותו למאגר נוזל חיצוני, כגון מזרק פלסטיק. חבר מאגר המכיל נוזל כגון מזרק פלסטיק או מודול הזרימה לכניסה במעלה הזרם. שמרו היטב על גובה הנוזל במאגר מעל גובה במורד הזרם.

ובכן, הפרש הגובה בין המאגר במעלה הזרם לכל יציאה במורד הזרם מגדיר היטב את הכוח המניע לזרימה מונעת לחץ כדי לכמת את קצב הזרימה דרך המכשירים. מחט קהה בקוטר 25 משמשת לאיסוף דגימות מהבארות במורד הזרם במרווחי זמן קבועים. לדוגמה, אנו אוספים דגימות כל 15 עד 20 דקות ומציינים בקפידה את הזמן שחלף בפועל בין הדגימות.

משקל המזרק נרשם לפני ואחרי הדגימה באיזון אנליטי. נפח מצטבר לעומת זמן מצטבר משורטט עם השיפוע השווה לקצב זרימת המסה הממוצע. חתך הרוחב הגדול של מאגר הכניסה לעומת בארות היציאה מסייע במניעת שינוי משמעותי בקצבי הזרימה כאשר הנוזל נע דרך המכשירים משרטטים את הנפח הנדגם על ציר ה-Y לעומת זמן הדגימה על ציר ה-x.

בתוכנת גרפים פשוטה כמו אקסל כדי להשיג את שיפוע הקו, השיפוע משמש לקצב הזרימה הנפחי הממוצע. תמיסה מדוללת של שלושה חרוזי לטקס פלואורסצנטיים מיקרו-מולאריים עם משטחי קרבוקסי, YG ו-YG רגילים משמשת להמחשת הזרימה ולחקר אינטראקציות פני השטח. ראשית, מכינים תמיסה של חרוזים במים דה-יונים בריכוז של 0.01% מוצקים.

התמיסה מתווספת לבארות במעלה הזרם ומודול הזרימה מחובר מחדש ל-zu. זרימת חרוזי הזרימה מוצגת במהלך שעה ומוקלטת בערך כל 10 דקות במיקרוסקופ פלואורסצנטי Zeiss AIOt 25, המצויד במצלמה מונוכרום MITx BCEB 0 1 3 U. פריימים בודדים מצולמים ברצף מהיר ומורכבים לסרטים באמצעות תוכנה כגון Image J עם תאורה פלואורסצנטית ותאורת אור משודרת.

החרוזים והמבנים נראים שניהם. כאשר האור המועבר נחסם, רק חרוזי הפלואורסצנט הבהירים נראים לעין. חרוזים נייחים המופקדים לאורך המשטח התחתון או מחוברים לקולטים ניכרים בכל המכשיר.

לניסויים בחיידקים חיים, מכינים תרבית כמו זן ויבריו, חלבון פלואורסצנטי ירוק לא פתוגני המבטא חיידק. ראשית, תרבות מלאי מוסרת מאחסון חופשי עמוק. בקבוק עם מצע גידול LB סטרילי מחוסן בתרבית המלאי.

באמצעות לולאת חיסון חד פעמית, הבקבוק מודגר למשך הלילה עם ניעור כדי לגרום לתרבית פאזה נייחת בריכוז של כ-10 עד תשיעית תאים למיליליטר. בהתאם ליישום, ניתן לכמת את הריכוז הראשוני של החיידקים בצורה מדויקת יותר. מכינים מכשיר מיקרופלואידי, מלא במאגר סטרילי.

ואז הנוזל הסטרילי בבארות במעלה הזרם מרוקן ומוחלף ב -20 מיקרוליטר מתרבית החיידקים. באמצעות פיפטה, החיידקים נזרעים לתוך המכשיר באמצעות יניקה עדינה עם מזרק על בארות הפלט לאחר הדגירה, ניתן לקבוע את כמות החיידקים בבארות על ידי כימות עוצמת הקרינה של כל באר לאחר הקולוניזציה. באר הכניסה במעלה הזרם מתרוקנת כמו קודם ומוחלפת במאגר שטוף ב-25 חלקים לאלף מלחים.

לחץ עדין של מי ים מלאכותיים מופעל על הבארות במעלה הזרם באמצעות מזרק השוטף תאי זרימה בודדים עם 20 עד 40 מיקרוליטר של תמיסת החיץ. זה בערך פי 100 עד 200 מהנפח הדל של חלק האדמה המיקרופלואידית של תא הזרימה לאחר השטיפה הראשונית. זלוף ארוך טווח של חיידקים דרך המדיה הנקבובית מושג על ידי שימוש במודול הזרימה בדיוק כפי שהוצג קודם.

ניתן למדוד תמונות אור פלואורסצנטי ולבן של צמיחת החיידקים והובלתם לאורך זמן. בניסוי זה, תמונות מצולמות כל 15 עד 20 שעות לתקופה של שבעה ימים עם מצלמת CCD מקוררת בצבע חמישה מדיו הדמיה Q. המכשירים שלנו יכולים לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מבנה בית הגידול הפיזי על מתן מקלט לחיידקים מטריפה על ידי פרוטוזואה. ראיתי.

הנה חיידקים בתא זרימה מיקרופורי עם פרוטוזואה ריסנית גדולה בהרבה eulo הנראית, רועה על חיידקים. בניתוח זרימת הנוזל במכשיר המיקרופלואידי, אנו מוצאים שקצב הזרימה הממוצע הוא 0.71 מיקרוליטר לדקה עבור ראש לחץ של 40 מילימטר. על ידי הגדלת ראש הלחץ ל-60 מילימטרים, קצב הזרימה גדל באופן פרופורציונלי ל-1.04 מיקרוליטר לדקה.

בעת שימוש בחרוזים עם כימיה שונה של פני השטח במכשיר, אנו צופים בהצטברות גדולה יותר של חרוזים לא קרבוקסיליים במשטחי המכשיר. בעוד שחרוזים בקוטר של שישה עד 10 מילימטרים היו בעלי סיכוי גבוה יותר להיתקע בפתחי הנקבוביות הקטנים יותר. קצבי זרימה מהירים יותר שנגרמו על ידי לחץ הידרוסטטי גדול יותר הביאו לירידה בשימור החרוזים ובהחזקתם, כפי שהיה צפוי לנתח את צמיחת החיידקים במכשיר המיקרופלואידי.

אנו מציינים את ההבדלים האיכותיים בעוצמת התמונה במגזרים שונים של המכשיר. ניתן לכמת את עוצמת הקרינה כפרוקסי לביומסה מיקרוביאלית בערוץ. בניסויים מתמשכים, אנו רואים שכוחות הגזירה המתמשכים של תנאי זרימה נמוכה גורמים להצטברות חיידקים ולהיווצרות להקות כפי שניתן לראות בתמונות אלה, זה עתה הראינו לכם כיצד ליצור ולהשתמש במכשירים מיקרופלואידיים פשוטים כדי למדוד קנה מידה של חלקיקים, להתנגש בהובלה דרך מדיה נקבובית, או לחקור אינטראקציות מיקרוביאליות בבתי גידול מיקרו-מובנים.

בעת ביצוע מחקרים באמצעות תאי זרימה, חשוב לקחת בחשבון את הציפה של החרוזים ואת כימיית פני השטח של הקולואידים והקולטים. כאשר מתרחבים למשטר המיקרופלואידי, השפעות פני השטח יכולות לשלוט בתופעות שנצפו. כמעט כל מבנה פיזי יכול להיות משולב בעיצוב תאי זרימה מיקרופלואידיים.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.