ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול
6 בדצמבר 2013
בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח חיידקים בודדים ומיקרו-מושבות איזוגניות מתפתחות ברזולוציה מרחבית וזמנית מלאה תחת תנאים סביבתיים קבועים, באמצעות התקן גידול מיקרופלואידי. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון מערכת גידול מיקרופלואידית באמצעות תוכנת CAD. לאחר מכן, מיוצרים התקני גידול מיקרופלואידיים חד-פעמיים מ-polydimethylsiloxane, המכילים ביו-ריאקטורים בנפח פיקולטר, ובעלי גובה של מיקרון אחד כדי להגביל את החיידקים לצמיחה בשכבה אחת (monolayer).
לאחר מכן, תרבית מיקרוביאלית מוזרמת לתוך ההתקן המיקרופלואידי כדי להנחית תאי אם בודדים בתוך הביוריאקטורים. תאים אלו מורבים באמצעות הזרמה רציפה של מצע גידול דרך המערכת. התוצאות מתקבלות ממיקרוסקופיה אוטומטית של צילומי רצף (time-lapse), המראה את גידולם של זן בעל רלוונטיות תעשייתית של Corynebacterium glutamicum, נתוני גדילה והטרוגניות בין-תאית.
בביוטכנולוגיה קונבנציונלית, מרבית הניתוחים מבוססים על נתונים ממוצעים. התקן המיקרופלואידי שלנו מאפשר ניתוח של תאי חיידקים בודדים ברזולוציה מרחבית וזמנית. זהו כלי שימושי לבחינה מעמיקה של ההטרוגניות בין תאים במיקרו-מושבות איזוגניות.
אנו משתמשים בפוטוליתוגרפיית SU-8 נפוצה וביציקת שבבים מפולידימטילסילוקסן (polydimethylsiloxane) לייצור התקנים מיקרופלואידיים לשימוש חד-פעמי עם רזולוציית מדיה סוב-מיקרונית. הדגמנו בהצלחה את הטכנולוגיה שלנו עם מספר מיקרואורגניזמים ביוטכנולוגיים כגון Escherichia coli ו-Corynebacterium glutamicum. לתחילת העבודה, תכננו את ההתקן המיקרופלואידי באמצעות תוכנת CAD.
התכנון המוצג בפרוטוקול זה מורכב משני פתחי הזנה לזריעה, מחולל מדרג לערבוב של שני סובסטרטים שונים, פתח יציאה אחד ושש מערכים המורכבים מחמישה ביו-ריאקטורים כל אחד. בחדר נקי, הכינו פרוסת סיליקון בת ארבעה אינץ' ובצעו ציפוי סבב (spin coat) של מיקרון אחד של פוטורזיסט SU-8 2000.5 על הפרוסה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. הניחו את הפרוסה המצופה על פלטה חמה בטמפרטורה של 95 °C כדי להסיר ממס עודף, ולאחר מכן הכניסו למיישר המסכות (mask aligner) את שכבת מסכת הפוטו הראשונה, המורכבת מאזורי הלכידה של ריאקטורי הפיקוליטר, ואת הפרוסה המצופה.
לאחר מכן, חשפו את פרוסת הסיליקון במצב מגע בוואקום לאור באורך גל של 350 עד 400 ננומטר למשך שלוש שניות בעוצמה של שבעה מיליוואט לסנטימטר רבוע. בצעו אפייה לאחר חשיפה (post-exposure bake) על פלטה חמה ומפולסת בטמפרטורה של 95 °C כדי להתניע את הפולימריזציה של SU-8. לאחר מכן, הניחו את פרוסת הסיליקון באמבט פיתוח של SU-8 למשך דקה אחת, והעבירו את הפרוסה למכל שני עם תמיסת פיתוח רעננה של SU-8 למשך מספר שניות.
שטפו את הפרוסה באיסופרופנול כדי להסיר את המפתח של ה-SU-8 ולייבש את הפרוסה באמצעות זרימת חנקן או ספינר לפרוסות. לאחר מכן, בצעו אפייה קשה (hard bake) לפרוסה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 150 °C. בשלב הבא, ייצרו את השכבה השנייה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף כדי להשלים את התבנית הראשית (master mold).
התחל את ייצור שבב ה-PDMS על ידי ערבוב הבסיס והסוכן הנושא ביחס של 10 ל-1. בצע דגזינג (ניקוז גזים) לתערובת ה-PDMS למשך כ-30 דקות בתוך דסיקטור ואקום עד להיכסותן של כל הבועות. לאחר מכן, הנח את פרוסת ה-SU-8 בתוך התקן יציקה ושפוך שכבה של 3 mm של תערובת ה-PDMS על הפרוסה.
לאחר מכן, אפו את ה-PDMS במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 80 °C בתנור. לאחר קירור, קלפו בזהירות את לוח ה-PDMS מהוופר וחתכו את הלוח לשבבים בודדים באמצעות סכין מנתחים נקייה וחדה. שטפו את השבבים באמבט n-pentane למשך 90 דקות, ולאחר מכן בשתי אמבטיות שטיפה באצטון למשך 90 דקות כל אחת.
ייבשו את השבבים למשך לילה כדי להסיר שאריות ממס. ממש לפני הניסוי, נקבו את חורי הכניסה והיציאה בשבב ה-PDMS באמצעות מחט או מחורר חורים שקוטרו קטן מעט מקוטר המחברים המשמשים לחיבור צינוריות לשבב ה-PDMS. לאחר מכן, נקו בזהירות את שבב ה-PDMS המיקרופלואידי באמצעות איזופרופנול והשתמשו בסרט דביק (scotch tape) כדי להסיר חלקיקי אבק דבקים.
בנוסף, נקה זכוכית דקה בעובי 170 micron תחילה באמצעות אצטון, לאחר מכן איזופרופנול, ולאחר מכן מים דה-יוניים, וייבש את הזכוכית באמצעות זרם חנקן. לאחר שהזכוכית נקייה ויבשה, בצע חמצון פלזמה לזכוכית ולשבב ה-PDMS למשך 25 שניות בהספק של 50 Watts וקצב זרימה של חמצן של 20 sccm. לאחר מכן, יישר בזהירות את ה-PDMS ואת שבב הזכוכית לפני הנחת ה-PDMS על הזכוכית, פעולה שתגרום להידבקותם תוך שניות ספורות.
בססו את החיבור על ידי אפיית המערך למשך 10 שניות בטמפרטורה של 80 °C. כדי להכין את החיידקים לניסוי בשבב, זרעו מושבה בודדת של זן חיידקי רצוי, כגון C.glutamicum, לתוך 20 milliliters של מצע BHI טרי, ודגרו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C על שייקר סיבובי במהירות של 120 RPMs. למחרת בבוקר, העבירו 10 µL מתרבית ההתנעה לתוך תרבית שנייה המכילה 20 milliliters מהמצע הרצוי, והניחו לתאים לגדול למשך לילה תחת אותם תנאים.
ביום למחרת, חממו מראש את האינקובטור של מיקרוסקופ הפוך ל-30 °C. פעולה זו עשויה להימשך עד שעתיים, בהתאם להגדרות המערכת. בזמן שהמערכת מתחממת, פתחו את האינקובטור, בחרו את העדשה הרצויה והכינו אותה עם כל תוך המצב (mounting medium) הנדרש.
לאחר מכן, התקינו את השבב בתוך מחזיק השבב ואבטחו אותו במקומו. מרכזו את הדגימה על המיקרוסקופ והתמקדו במערכי הביוראקטורים בנפח פיקוליטר. כאשר השבב נמצא בפוקוס, חברו את הכניסות והיציאות באמצעות צינורות מתאימים, ולאחר מכן הניחו את צינור היציאה בתוך מיכל פסולת.
בשלב הבא, מלאו מזרק במדיום טרי, הניחו אותו במשאבת מזרקים, ושטפו את התעלות המיקרופלואידיות במשך שעה אחת בקצב זרימה של 200 nanoliters per minute כדי להכין את השבב לעבודה. בעוד התאים נמצאים עדיין בשלב הצמיחה האקספוננציאלית המוקדם, העבירו מיליליטר אחד של תרבית החיידקים למזרק סטרילי והחליפו את המזרק והצינורות שהכילו את המדיום בתרחיף התאים ובצינורות טריים. החדירו את תרחיף התאים אל התעלות בקצב זרימה נפחי של 200 nanoliters per minute עד שמרבית הביוריאקטורים בנפח פיקוליטר יתמלאו.
אם רק מספר קטן של ביו-ריאקטורים התמלא, הגבירו את קצב הזרימה ל-800 עד 1200 ננו-ליטר לדקה. לאחר שזרעו את הכמות הרצויה של תאים, נתקו את ת сусפנסיות התאים, חברו מחדש את מצע הגידול לשבב, ובצעו פרפוזיה של מצע טרי בקצב של 100 ננו-ליטר לדקה. לאחר מכן, סרקו את השבב ובחרו ביו-ריאקטורים ספציפיים לצילום time-lapse.
לאחר מכן, הגדירו רצף מיקרוסקופיה של צילומי זמן (time-lapse) כדי לצלם את הביוריאקטורים מההתחלה ועד לסוף ולהתחיל בניסוי. ברגע שכל הביוריאקטורים בנפח פיקוליטר יהיו מלאים בתרבית, הפסיקו את הניסוי והשליכו את השבבים באופן המתאים. כדי להתחיל בניתוח, קבעו תחילה אילו ביוריאקטורים עומדים בכל הקריטריונים הרצויים לניסוי, כגון מספרם ומיקומם של תאי האם.
באמצעות תוכנת ניתוח, כגון image J, קבעו את קצב הצמיחה של כל מיקרו-מושבה על ידי ספירת מספר התאים בכל נקודת זמן. חשבו את קצב הצמיחה המקסימלי באמצעות שרטוט גרף של זמן מול הלוגריתם של מספר התאים. ניתן להחיל את המערכת המוצגת כאן להסבירי מינים שונים של חיידקים ביחס לפרמטרים ביולוגיים שונים, כגון צמיחה, מורפולוגיה או אות פלורסצנטי.
בדוגמה זו, *C.glutamicum* גודלה בתנאי גידול סטנדרטיים, ועקומות הגדילה שהתקבלו משלוש מיקרו-מושבות איזוגניות מוצגות כאן. הביוריאקטורים בנפח פיקולית הוכחו כמוסמכים גם להערכת ייצור חלבונים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של צילומי רצף (time-lapse), כפי שמוצג כאן. על ידי חשיפת התאים לריכוז נמוך של אינדוקטור החלבון IPTG, ניתן לחקור את השונות בין תא לתא בייצור החלבון ברמת התא הבודד בתוך מושבות שהחלו מתא אם בודד.
ניתן ליישם את הטכניקה המודגמת כדי לנטר ולנתח תאי חיידקים בודדים תחת בקרה סביבתית מלאה. דבר זה כמעט ואינו אפשרי בשימוש במערכות גידול קונבנציונליות בקנה מידה מעבדתי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת שבבי גידול מיקרופלואידיים לצורך ביצוע ניתוח דומה של תאים בודדים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג את הייצור והתפעול של ביו-ריאקטור מיקרופלואידי בנפח פיקוליטר (PLBR) לצורך ניתוח של תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. הוא מדגים תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית של מיקרואורגניזמים בעלי רלוונטיות תעשייתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ניתוח של תא בודד
- מיקרוביולוגיה פרוקריוטית
רקע
- התקני מיקרופלואידיקה מאפשרים בקרה מדויקת על תנאי הסביבה.
- שיטות קונבנציונליות מסתמכות לרוב על נתונים ממוצעים, מה שמגביל את התובנות לגבי התנהגות של תאים בודדים.
- ניתוח של תא בודד יכול לחשוף הטרוגניות בין תאים.
- טכניקות של תרבית מיקרובית חיוניות לחקר דינמיקת צמיחה.
מטרת המחקר
- ניתוח של חיידקים בודדים ומיקרו-מושבות איזוגניות עם רזולוציה מרחבית וזמנית.
- פיתוח התקן טיפוח מיקרופלואידי לניתוח מיקרוביאלי משופר.
- הדגמת היישום של ההתקן עם מיקרואורגניזמים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון מערכות מיקרופלואידיות באמצעות תוכנת CAD.
- ייצור התקנים מפולידימეთילסילוקסן (PDMS) עם ביו-ריאקטורים בנפח פיקוליטר.
- מיקרוסקופיה אוטומטית של צילום רציף (time-lapse) לאיסוף נתונים.
- החדרה של תאי אם בודדים והזרקה רציפה של מצע גידול.
תוצאות עיקריות
- גידול מוצלח של Corynebacterium glutamicum ו-Escherichia coli.
- תובנות לגבי נתוני גדילה והטרוגניות בין תאים.
- הדגמה של יכולות המכשיר המיקרופלואידי לניתוח של תא בודד.
- תהליך ייצור יעיל למכשירים מיקרופלואידיים ברזולוציה סוב-מיקרומטרית.
מסקנות
- ה-PLBR המיקרופלואידי הוא כלי רב עוצמה לחקר התנהגות מיקרוביאלית.
- הוא מאפשר ניתוח מפורט של תאים בודדים תחת תנאים מבוקרים.
- גישה זו יכולה לקדם משמעותית את הבנתנו את הדינמיקה המיקרוביאלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
ביוראקטור מיקרופלואידי בנפח פיקוליטר זה מאפשר ניתוח של תאים בודדים מזנים מיקרוביאליים תחת תנאים סביבתיים מבוקרים בקפדנות, ובכך הוא נותן מענה לפער קריטי בסינון פנוטיפי שבו ממוצעי אוכלוסייה מסוותים את ההטרוגניות של הזנים. על ידי פתרון של דינמיקת צמיחה, מורפולוגיה ותגובות למעגש ברמה של תא בודד, הפלטפורמה תומכת בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים בתוכניות לפיתוח חומרי anitmicrobial והנדסת זנים. התאימות של המערכת למיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשיטת time-lapse מאפשרת ניטור בזמן אמת של ייצור מטבוליטים או חלבונים, ומספקת ביטחון חיזוי בביצועי הזנים לפני הגדלת קנה המידה (scale-up).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור התנהגות של תא בודד להפרעות גנטיות או סביבתיות במיקרובים בעלי רלוונטיות תעשייתית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות תצפית ישירה על תגובת מאמץ וייצור מטבוליטים בתאים בודדים ובמיקרו-מושבות כלואים.
- ערך חיזוי: חושף הטרוגניות בין-תאית בצמיחה ובפלואורסצנציה, ובכך משפר את רמת הביטחון בבחירת זנים לפיתוח בשלבים הבאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה אנטי-מיקרוביאלית או מטבולית באמצעות בידוד של מיקרו-מושבות איזוגניות שנגזרו מתאי אם בודדים.
- ערך תפעולי: מספק קריאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של תאים בודדים באמצעות דימוי time-lapse אוטומטי, ובכך מפחית שונות במדדי קצב הצמיחה והפלואורסצנציה.
- יכולת הרחבה (Scalability): הייצור הפשוט של PDMS והעיצוב מבוסס השבבים מאפשרים התאמה מהירה בין מיני מיקרואורגניזמים ופורמטים של בדיקות במעבדות המצוידות במיקרופלואידיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות ברמת התא הבודד שלב הגילוי לבין אופטימיזציה של זנים בשלב הפרה-קליני, באמצעות מעקב אחר פנוטיפים תלויי-זמן תחת תנאי זרימת מצע והפרעות מבוקרים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת תנאי מצע תנודתיים המדמים מאמצים של תסיסה תעשייתית, ובכך מאפשרת הערכה מוקדמת של חוסן ועקביות הייצור.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מקלה על ביסוס מתאם בין פלואורסצנציה תוך-תאית (למשל, ממקיבמים הניתנים להשראה) לבין דינמיקת גדילה, ובכך תומכת בפיתוח זנים המונחה על ידי סממנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הביוראקטור המיקרופלואידי בנפח פיקולטר משתלב בתהליך העבודה של השלבים המוקדמים של הגילוי, ומאפשר אפיון זנים מונחה-השערה לפני זיהוי המועמדים המובילים ואופטימיזציה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן תגובות ספציפיות לזנים לתסבסטרטים, משרה או גורמי עקה, באמצעות ניטור צמיחה ופלואורסצנציה של תא בודד בזמן אמת.
- סריקה: מייצר עקומות צמיחה כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית ומסלולי פלואורסצנציה לצורך השוואת וריאנטים קלונאליים תחת תנאים זהים.
- אנליטיקה: מספק נתונים ברזולוציית תא בודד על שיעורי חלוקה, שינויים מורפולוגיים וביטוי חלבונים, המאפשרים דה-קונבולוציה סטטיסטית של הטרוגניות האוכלוסייה.
- מחקר תרגומי: מקשר תצפיות מיקרו-פלואידיות לפנוטיפים ניתנים להרחבה, על ידי קישור התנהגות של תא בודד לתוצאות ברמת האוכלוסייה בהקשרי ביו-ייצור.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון השבב ותהליך הייצור הסטנדרטיים מאפשרים שימוש חוזר בפרויקטים המכוונים לשלדות מיקרוביאליות או למסלולי ייצור שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בביצועי זנים על ידי פתרון הטרוגניות איזוגנית שאינה נראית בבדיקות מסה (bulk assays) כגון ציטומטריה של זרימה או קוראי פלטות.
- ערך תפעולי: מבטיח בקרת סביבה ודיוק בהחלפת ריאגנטים באמצעות זרימה רציפה של מצע והחלפה מהירה של המצע, מה שמשפר את מהימנות הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מגביר את הביטחון בהחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של תת-אוכלוסיות בעלות ייצור שאינו טיפוסי או הישרדות למסגrss בתחילת שלב הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי סימון זנים עם תת-אוכלוסיות לא יציבות או בעלות תפוקה נמוכה לפני השקעה בהגדלת קנה המידה (scale-up).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידיקה, ליתוגרפיה רכה והפעלה של מיקרוסקופ לצילום Time-lapse.
- תלוי בגישה למתקני חדר נקי לצורך ייצור תבנית SU-8 וציוד ליציקת PDMS.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לעיקור השבב, ה接種 (inoculation) ואיטום, כדי להבטיח הדירות בין משתמשים ומעבדות שונות.
- התאמה לאורגניזמים שאינם אורגניזמי מודל עשויה לדרוש אופטימיזציה של ממדי הלכידה ושיעורי זרימת המצע, בהתבסס על גודל התא וקינטיקת הגדילה.
- מגבלות מעשיות כוללות הצטברות משקעים (fouling) במכשיר במהלך הרצות ארוכות ואת הצורך בטיפול ידני בשבב למרות הדימוג האוטומטי.
