ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח חיידקים בודדים ומיקרו-מושבות איזוגניות מתפתחות ברזולוציה מרחבית וזמנית מלאה בתנאי סביבה קבועים באמצעות מכשיר גידול מיקרופלואידי. זה מושג על ידי תכנון ראשון של מערכת גידול מיקרופלואידית באמצעות תוכנת CAD. לאחר מכן, מכשירי גידול מיקרופלואידיים חד פעמיים מיוצרים מפולידימתילסילוקסן המכילים ביו-ריאקטורים פיקוליטרים, מיקרון אחד וגובה כדי להגביל חיידקים לצמיחה חד-שכבתית.

לאחר מכן מוזרקת תרבית מיקרוביאלית למכשיר המיקרופלואידי כדי לחסן תאי אם בודדים בתוך הביוריאקטורים. תאים אלה מורחבים על ידי עירוי רציף של מדיום גידול דרך המערכת. התוצאות מתקבלות ממיקרוסקופיה אוטומטית של זמן-lapse המציגה גידול של זן רלוונטי מבחינה תעשייתית של Corynebacterium glutamicum, נתוני גדילה והטרוגניות של תאים-תאים.

בביוטכנולוגיה קונבנציונלית, רוב הניתוחים מבוססים על נתונים ממוצעים. מכשיר המיקרופלואידיקה שלנו מקל על ניתוח תא בודד של חיידקים בודדים ברזולוציה מרחבית וזמנית. זהו כלי שימושי להסתכל מקרוב על הטרוגניות תא לתא של מיקרו-מושבות איזוגניות.

אנו מיישמים פוטוליתוגרפיה נפוצה SU-8 ודפוס שבב פולידימתילסילוקסן לייצור מכשירים מיקרופלואידיים לשימוש חד פעמי ברזולוציית תת-מיקרו מדיה. הדגמנו בהצלחה את הטכנולוגיה שלנו עם מספר מיקרואורגניזמים ביוטכניים כגון Escherichia coli ו-Corynebacterium glutamicum. כדי להתחיל, תכנן את המכשיר המיקרופלואידי באמצעות תוכנת CAD.

התכנון המוצג בפרוטוקול זה מורכב משני פתחי זריעה, מחולל שיפוע לערבוב שני מצעים שונים, יציאה אחת ושישה מערכים המורכבים מחמישה ביו-ריאקטורים כל אחד. בחדר נקי, הכינו פרוסת סיליקון בגודל ארבעה אינץ' וסובבו קוד מיקרון אחד של SU-8 2000.5 photoresist על הפרוסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הניחו את הוופל המצופה על פלטה חמה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס כדי לסלק עודפי ממס, ולאחר מכן הכניסו את מסיכת הצילום של השכבה הראשונה המורכבת מאזורי ההשמנה של כורי הפיקוליטר והפרוסה המצופה בתוך מיישר המסכה.

לאחר מכן, חשוף את הוופל במצב מגע ואקום לאור של 350 עד 400 ננומטר למשך שלוש שניות בעוצמה של שבעה מילי-וואט לסנטימטר מרובע. בצע אפייה לאחר החשיפה על פלטה חמה מישורית ב-95 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הפילמור של SU-8. לאחר מכן, הניחו את הוופל באמבט מפתח SU-8 למשך דקה אחת, ולאחר מכן העבירו את הוופל למיכל שני עם מפתח SU-8 טרי למשך מספר שניות.

שטפו את הוופל באיזופרופנול כדי להסיר את מפתח ה-SU-8 ולייבש את הוופל באמצעות זרימת חנקן או ספינר פרוסות. לאחר מכן, אופים קשה את הוופל במשך 10 דקות בחום של 150 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בנה את השכבה השנייה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה על מנת להשלים את תבנית המאסטר.

התחל בייצור שבבי PDMS על ידי ערבוב הבסיס וחומר הנשיאה ביחס של 10 לאחד. הסר את תערובת ה-PDMS למשך כ-30 דקות בתוך מייבש ואקום עד שכל הבועות נעלמות. לאחר מכן, הנח את פרוסת ה-SU-8 לתוך מכשיר דפוס ושפך שכבה של שלושה מילימטרים של תערובת PDMS על הוופל.

לאחר מכן, אופים את ה-PDMS במשך שלוש שעות בחום של 80 מעלות צלזיוס בתנור. לאחר שהתקרר, מקלפים בזהירות את לוח ה-PDMS מהפרוסה וחותכים את הלוח לשבבים בודדים בעזרת אזמל נקי וחד. שטפו את הצ'יפס באמבט n-pentane למשך 90 דקות, ולאחר מכן שתי אמבטיות שטיפת אצטון למשך 90 דקות כל אחת.

יבש את הצ'יפס למשך הלילה כדי להסיר שאריות ממס. רגע לפני הניסוי, נקב את חורי הכניסה והיציאה לתוך שבב ה-PDMS באמצעות מחט או מנקב חורים בקוטר מעט קטן יותר מהמחברים המשמשים לחיבור צינורות עם שבב PDMS. לאחר מכן, נקו את שבב ה-PDMS המיקרופלואידי בזהירות עם איזופרופנול והשתמשו בסקוטש כדי להסיר חלקיקי אבק נדבקים.

כמו כן, נקו תחילה מגלשת זכוכית דקה של 170 מיקרון עם אצטון, לאחר מכן איזופרופנול, ולאחר מכן מים נטולי יונים, וייבשו את השקופית בזרם חנקן. לאחר ניקוי וייבוש, פלזמה מחמצנת את מגלשת הזכוכית ושבב ה-PDMS למשך 25 שניות באמצעות הספק של 50 וואט וקצב זרימת חמצן של 20 sccm. לאחר מכן, יישר בזהירות את ה-PDMS ושבב הזכוכית לפני הנחת ה-PDMS על הזכוכית, מה שיגרום לה להיקשר תוך שניות.

אבטח את הקשר על ידי אפיית ההתקנה למשך 10 שניות בחום של 80 מעלות צלזיוס. כדי להכין את החיידקים לניסוי שבב, יש לחסן מושבה אחת של זן חיידקים רצוי, כגון C.glutamicum לתוך 20 מיליליטר של מדיום BHI טרי, ולדגור את התרבית למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי ב-120 סל"ד. למחרת בבוקר, העבירו 10 מיקרוליטר מתרבית המתנע לתרבית שנייה המכילה 20 מיליליטר מהמדיום הרצוי ותנו לתאים לצמוח בן לילה באותם תנאים.

למחרת, יש לחמם את החממה של מיקרוסקופ הפוך ל -30 מעלות צלזיוס. פעולה זו עשויה להימשך עד שעתיים, בהתאם להגדרה האישית. בזמן שההתקנה מתחממת, פתח את החממה ובחר את המטרה הרצויה והכין אותה עם כל אמצעי הרכבה נדרש.

לאחר מכן, התקן את השבב בתוך מחזיק השבב ואבטח אותו במקומו. מרכז את הדגימה במיקרוסקופ והתמקד במערכי הביוריאקטור של פיקוליטר. כשהשבב בפוקוס, חבר את הכניסות והיציאות עם צינורות מתאימים ולאחר מכן הנח את צינור היציאה למאגר פסולת.

לאחר מכן, מלאו מזרק במדיה טרייה, הכניסו אותו למשאבת מזרק ושטפו את התעלות המיקרופלואידיות למשך שעה בקצב זרימה של 200 ננוליטר לדקה כדי לטשטש את השבב. בזמן שהתאים עדיין בשלב הגידול האקספוננציאלי המוקדם, העבירו מיליליטר אחד של תרבית החיידקים למזרק סטרילי והחליפו את המזרק והצינורות המכילים את המדיה בתרחיף התאים ובצינורות טריים. החדירו את תרחיף התאים לתעלות בקצב זרימה נפחי של 200 ננוליטר לדקה עד למילוי רוב הביוריאקטורים של פיקוליטר.

אם רק מספר קטן של ביו-ריאקטורים מתמלאים, הגדל את קצב הזרימה ל-800 עד 1200 ננוליטר לדקה. לאחר שנזרעה כמות התאים הרצויה, נתק את תרחיף התאים, חבר מחדש את מצע הגידול לשבב והחדיר במדיה טרייה ב-100 ננוליטר לדקה. לאחר מכן, סרוק את השבב ובחר ביו-ריאקטורים ספציפיים להדמיית זמן-lapse.

לאחר מכן, הגדר רצף מיקרוסקופיה דולג זמן על מנת לדמות את הביוריאקטורים מתחילתו ועד סופו ולהתחיל בניסוי. לאחר שכל הביוריאקטורים של הפיקוליטר גדלו יתר על המידה, עצרו את הניסוי והשליכו את השבבים כראוי. כדי להתחיל בניתוח, ראשית, קבע אילו ביו-ריאקטורים עומדים בכל הקריטריונים הרצויים לניסוי כגון מספר ומיקום תאי האם.

באמצעות תוכנת ניתוח, כגון תמונה J, קבע את קצב הצמיחה של כל מיקרו-מושבה על ידי ספירת מספר התאים בכל נקודת זמן. חשב את קצב הצמיחה המרבי על ידי התוויית זמן לעומת היומן של מספר התא. ניתן ליישם את המערכת המוצגת כאן כדי לחקור מיני חיידקים שונים ביחס לפרמטרים ביולוגיים שונים כגון גדילה, מורפולוגיה או אות פלואורסצנטי.

בדוגמה זו, C.glutamicum תורבת בתנאי גידול סטנדרטיים ועקומות הצמיחה המתקבלות הנגזרות משלוש מיקרו-מושבות איזוגניות מוצגות כאן. הביוריאקטורים של פיקוליטר הוכיחו את עצמם כשימושיים גם בגישה לייצור חלבונים באמצעות שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן-lapse כפי שמוצג כאן. על ידי חשיפת התאים לריכוז נמוך של משרה החלבון IPTG, ניתן לחקור את הווריאציות של תא לתא של החלבון ברמת התא הבודד בתוך מושבות החל מתא אם יחיד.

ניתן ליישם את הטכניקה המודגמת כדי לנטר ולנתח תאי חיידקים בודדים עם בקרה סביבתית מושלמת. זה כמעט ולא אפשרי באמצעות מערכות גידול קונבנציונליות בקנה מידה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין שבבי גידול מיקרופלואידיים לביצוע ניתוח תאים בודדים דומה.