צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר הליך נתיחה פשוט בצעד אחד של מוחות של זבובים בוגרים מהסוג Drosophila, אשר יכול להפיק במהירות מוחות עם מורפולוגיה שמורה היטב המתאימה לניתוח של דגימות שלמות (whole mount). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחומי מדעי המוח והגנטיקה, כולל מיפוי מדויק של מעגלי מוח, חקר השפעותיהן של מניפולציות גנטיות על נוירונים ואפיון תפקודי של גנים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא כוללת הליך קל ללמידה. היא יכולה לסייע בהוצאה של מוח זבוב בוגר עם מורפולוגיה שמורה היטב בפחות מ-10 שניות. הדגמה בווידאו של שיטה זו היא קריטית, שכן השליטה במומנטום הנדרש בעת שחרור הפינצטה כדי לקרוע את השלד החיצוני המקיף את ראש הזבוב דורשת מיומנות ואימון.

זבובי הפירות הקטנים והמעצבנים הללו לימדו אותנו רבות על עקרונות ביולוגיים. הם עשויים גם לסייע לנו למצוא את הגורמים והמרפאות למחלות אנוש, כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון. באמצעות מיקרוסקופ דיסקסיה המכוון להגדלה של 1.2 X, קבעו זבוב מורדם והטבילו אותו בתמיסת דיסקסיה קרה כאשר הבטן פונה כלפי מעלה.

החזיקו את הפינצטה בזווית של 160 עד 170 מעלות ביחס ללוח הניתוח, ולאחר מכן הפעילו כוח קטן על בטנו של הזבוב. פעולה זו אמורה לקבע את הזבוב, לדחוף את הראש לאחור ב-15 עד 25 מעלות, ולהושיט את הproboscis כלפי מעלה. לאחר תמרון זה, אמור להופיע אזור שקוף ורך של ה-cuticle מתחת ל-proboscis.

הגדילו את ההגדרה וכווןו את מישור המוקד לאזור זה. בעזרת היד הדומיננטית, קחו פינצטת דיסקציה והפעילו לחץ כדי לסגור את הקצוות. מקמו את הפינצטה בניצב לפינצטה המקבעת את הזבוב.

החדירו את קצות הפורספס הסגורים דרך האזור השקוף והרך של הקוטיקולה, תוך הקפדה לא לחדור עמוק מדי עד למגע במוח. לאחר מכן, שחררו את הפורספס במהירות אך ביציבות, כך שהקצוות ייפתחו ויקרעו את השלד החיצוני של ראש הזבוב. השתמשו בתנופה שנוצרת משחרור קצות הפורספס כדי להסיר בעדינות את השלד החיצוני ואת מרבית מעטפת הראש, כולל העין והטרכאה, מרקמת המוח בתנועה אחת.

כעת ניתן לראות מוח שלם. בעזרת פינצטה, הסירו בזהירות את רקמות העזר שנותרו, כגון הרקמה הסיבית הלבנה של הקנה, תוך הקפדה לא למשוך או לפגוע במוח עצמו. העבירו את דגימות המוח המנותחות יחד עם הגוף הנלווה לכ-1 ml של 4%paraformaldehyde על קרח למשך 40 עד 60 דקות.

הסיר את הפאראפורמלידה, ולאחר מכן שטוף את הדגימות עם 1 ml של PBS בריכוז 1X על ידי שאיבה ופליטה של התמיסה עם פיפטה שלוש פעמים, תוך הקפדה לא לשאוב את המוחות. לאחר מכן, הסר את ה-PBS ושטוף חמש פעמים עם 1 ml של PBT בריכוז 1X למשך חמש דקות בכל פעם באמצעות נטציה (nutation). הוסף את הנוגדן הראשוני הרלוונטי בדילול המתאים.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C תוך נטציה (nutation). הסירו את הנוגדן הראשוני ושטפו את הדגימות חמש פעמים ב-1 mL של 1X PBT, למשך 5 עד 10 דקות בכל שטיפה, תוך נטציה. הוסיפו נוגדן שני לדגימות השטופות בדילול ובזמן הדגרה המתאימים.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות שש פעמים ב-1 mL של 1X PBT למשך 10 דקות בכל פעם תוך כדי נעתוק (nutation). שלב זה קריטי להסרת נוגדנים משניים שנקשרו באופן לא ספציפי. דגרו את הדגימות בדילול של 1:10,000 של 1 mg/mL DAPI ב-1 mL של תמיסת 1X PBT למשך 30 עד 60 דקות תוך כדי נעתוק.

לבסוף, שטפו את הדגימות על ידי הוספת 1 mL של PBS בריכוז 1X, ולאחר מכן בצעו פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה שלוש פעמים. הניחו זכוכית כיסוי על גבי שקופית הרכבה. באמצעות פיפט עם קצה קטום, העבירו את המוחות בתמיסת 1X PBS אל זכוכית הכיסוי.

בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להפריד את המוחות מהגופים. השתמשו בקצה פ pipette דק כדי להסיר את הנוזל שסביב רקמת המוח. ולאחר מכן, הוסיפו 20 עד 40 µL של תמיסת קיבוע למניעת דהייה (anti-fade mounting medium).

פזרו בעדינות את המוחות, תוך דחיפת המדיום הצמיגי כלפי חוץ. החל מהצד, הניחו בעדינות כיסוי זכוכית שני על הדגימות, תוך הקפדה לצמצם את מגע המוח עם בועות. המתינו עד שהכיסויים יתיישבו, ולאחר מכן הסירו כל עודף נוזל מקצות הכיסויים באמצעות נייר ניגוב למעבדה.

השתמשו בחתיכת סרט דביק קטנה כדי להצמיד זמנית את זוג כיסית הזכוכית לסמידה. כדי לצלם את הדגימות, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי مرکב או במיקרוסקופ קונפוקאלי. תמונות אלו מציגות מבטים קדמיים ואחוריים של אותה דרוזופילה (Drosophila) בוגרת.

גרעיני התאים הודגמו באמצעות צביעת DAPI ונוירונים סומנו באמצעות סמן נוירונלי כללי ונוגדנים למשמר ELAV. נוירונים דופמינרגיים, או DA, זיהויי באמצעות צביעה בנוגדן anti-TH. רמות עצימות דומות נצפו בשני צדי המוח בכל ערוצי התמונה.

תצוגות מוגדלות של החלקים הקדמיים והאחוריים של המוח מאפשרות בחינה מפורטת של אשכולי נוירוני ה-DA. ניתן לראות את האשכול המדיאלי הקדמי הזוגי בתמונות הקדמיות, ואת האשכולים המדיאליים האחוריים הזוגיים והלטרליים האחוריים הזוגיים בחלק האחורי של המוח. כימות של נוירונים אלו גילה כי לזבובים זכרים בני שלושה ימים מזן w1118 יש בדרך כלל 27 נוירוני DA באשכול ה-PPM בכל המוח, 16 באשכול ה-PPL לכל המיסצירה, וחמישה באשכול ה-PAL לכל המיסצירה.

בממוצע נצפו 97 נוירוני DA בכל אחד מאשקרי ה-PAM. שחזור תלת-ממדי של אשקרי ה-PAL וה-PAM הראה בנוסף כי לנוירוני ה-DA באשקר ה-PAM יש גדלים קטנים יחסית וצביעת TH חלשה יותר מאשר באשקרים אחרים, כגון ה-PAL. ככל שחולף הזמן, מחקרים רבים יותר מתמקדים במוחות של זבובים בוגרים לצורך ניתוח נתיבים מולקולריים ומעגלים נוירונליים העומדים בבסיס תפקודי מוח גבוהים, ולצורך מידול של מחלות מוח אנושיות.

במחקרים מבוססי מוח מעין זה, יהיה צורך להכין ביעילות דגימות מוח עם מורפולוגיה שנשמרה היטב. דבר זה עשוי להיות חשוב במיוחד בסריקות רחבות היקף המבוססות על המוח. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר התקשיתי להחזיק את הזבובים בעזרת פינצטה.

במקום להשתמש בפינצטה עם קצוות חדים, כפי שרוב חוקרי ה-Drosophila עושים, שבנה ניסתה פינצטה עם קצוות קהים ומצאה שבאמצעותה קל יותר לבצע דיסקציה של המוח. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-10 שניות אם היא מבוצעת כראוי. פעם אחת, ביצעתי דיסקציה לכ-100 מוחות מששה גנוטיפים שונים עבור ניסוי אחד ביום אחד בלבד.

למרות שנוהל הניתוח הזה עשוי להיראות פשוט, חשוב לתרגל אותו תחילה עם זבובים שניתן לוותר עליהם. החוקר עשוי גם להתקשות במיקום הפינצטה מבלי להרוס את מוח הזבוב. ניתן להשתמש במוחות המנוסחים למחקרים אחרים, כגון RNA, היברידיזציה באתר (in situ hybridization), והפקת דגימות חלבון ו-RNA מרקמת המוח.

לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו לבצע נתיחה של מוחות זבובים תוך שמירה על מורפולוגיה משומרת היטב. אנו צופים שניתן יהיה לפתח שיפורים כדי להפוך הליך זה לפשוט ומהיר יותר. בעתיד, הדבר עשוי להפוך לאוטומטי עבור מחקרים בהיקף רחב.

זכרו כי עבודה עם פאראפורמאלדהיד ומלקחי ניתוח חדים עלולה להיות מסוכנת. נקטו באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת טיפול בתמיסות קיבוע, ועם סיום הניתוח סגרו מיד את כיסוי המלקחים לפני שתניחו אותם בצד.