צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים תסיסנית Brains

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר הליך דיסקציה פשוט של שלב אחד עבור מוחות דרוזופילה בוגרים, שיכול לייצר במהירות מוחות עם מורפולוגיה שמורה היטב המתאימה לניתוח הר שלם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחומי מדעי המוח והגנטיקה. זה כולל מיפוי עדין של מעגלי המוח, חקר ההשפעות של מניפולציות גנטיות של נוירונים ואפיון תפקודי של גנים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא כרוכה בהליך קל ללמידה. זה יכול להקל על ניתוח מוח זבוב בוגר עם מורפולוגיה שמורה היטב תוך פחות מ-10 שניות. הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית, שכן שליטה במומנטום הנדרש בעת שחרור המלקחיים כדי לקרוע את השלד החיצוני המקיף את ראש הזבוב דורשת מיומנויות ותרגול.

זבובי הפירות הזעירים והמעצבנים האלה לימדו אותנו הרבה על העקרונות הביולוגיים. הם עשויים גם לסייע לנו למצוא את הגורמים והתרופות למחלות אנושיות, כמו למשל מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון. בעזרת מיקרוסקופ חיתוך המוגדר להגדלה של פי 1.2, משתקים זבוב מורדם וטובלים אותו בתמיסת חיתוך קרה כשהבטן פונה כלפי מעלה.

שמור את המלקחיים בזווית של 160 עד 170 מעלות בהתאמה ללוחית החיתוך, ולאחר מכן הפעל כוח קטן על בטן הזבוב. זה אמור לשתק את הזבוב, לאלץ את הראש לאחור 15 עד 25 מעלות ולהאריך את הפרובוסקיס כלפי מעלה. לאחר תמרון זה, אמור להתגלות אזור שקוף רך של הציפורן מתחת לחוטם.

הגדל את ההגדלה והתאם את מישור המוקד לאזור זה. בעזרת היד הדומיננטית, קח זוג מלקחיים מנתחים והפעל לחץ כדי לסגור את הקצוות. מקם את המלקחיים בניצב למלקחיים המגבילים את הזבוב.

חודרים את הקצוות הסגורים של המלקחיים דרך האזור השקוף והרך של הציפורן, נזהרים לא לחדור כל כך עמוק עד שהם נוגעים במוח. ואז במהירות, אך בהתמדה, שחרר את המלקחיים, כך שהנקודות ייפתחו, ויקרעו את השלד החיצוני של ראש הזבוב. השתמש במומנטום משחרור קצות המלקחיים כדי להסיר בעדינות את השלד החיצוני ואת רוב העין וקנה הנשימה הקשורים לראש מרקמת המוח בתנועה אחת.

מוח שלם אמור להיות גלוי כעת. בעזרת המלקחיים, הסר בזהירות את רקמות העזר הנותרות, כגון רקמת קנה הנשימה הסיבית הלבנה, והקפד לא למשוך או לפגוע במוח עצמו. הנח את דגימות המוח המנותחות עם פלג גוף עליון קשור לתוך כמיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד על קרח למשך 40 עד 60 דקות.

הסר את הפרפורמלדהיד, ולאחר מכן שטוף את הדגימות במיליליטר אחד של X PBS אחד על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה שלוש פעמים, תוך הקפדה לא לשאוב את המוח. לאחר מכן, הסר את ה-PBS ולאחר מכן שטוף חמש פעמים עם מיליליטר אחד של X PBT אחד למשך חמש דקות כל אחת עם אגוזים. הוסף את הנוגדן העיקרי המעניין בדילול המתאים.

ואז לדגור את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוטציה. הסר את הנוגדן הראשוני ושטוף את הדגימות חמש פעמים עם מיליליטר אחד של X PBT אחד למשך חמש עד 10 דקות כל שטיפה עם אגוזים. הוסף נוגדן משני לדגימות השטופות בזמן הדילול והדגירה המתאימים.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות שש פעמים במיליליטר אחד של X PBT אחד למשך 10 דקות כל אחת עם אגוזים. שלב זה הוא קריטי להסרת כל נוגדנים משניים שאינם קשורים ספציפית. דגרו את הדגימות בדילול של 1 עד 10,000 של מיליגרם אחד למיליליטר DAPI במיליליטר אחד של תמיסת X PBT אחת למשך 30 עד 60 דקות עם נוטציה.

לבסוף, שטפו את הדגימות על ידי הוספת מיליליטר אחד של X PBS אחד ולאחר מכן פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה שלוש פעמים. הנח החלקת כיסוי על מגלשת הרכבה. בעזרת פיפטה עם קצה חתוך, העבירו את המוח בתמיסת X PBS אחת על הכיסוי.

לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, הפרידו את המוחות מהגופים. השתמש בקצה פיפטה עדין כדי להסיר את הנוזל סביב רקמת המוח. ואז, הוסף 20 עד 40 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה.

פרש בעדינות את המוח, תוך הזזת המדיום הצמיג כלפי חוץ. החל מצד אחד, הורד בעדינות כיסוי שני על הדגימות, תוך הקפדה למזער את המגע המוחי עם בועות. הניחו להחלקות להתייצב, ולאחר מכן הסירו את כל הנוזלים העודפים מקצה ההחלקות באמצעות מגבון מעבדה.

השתמש בפיסת סרט קטנה כדי לחבר זמנית את זוג הכיסוי לשקופית ההרכבה. כדי לצלם את הדגימות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי מורכב. תמונות אלה מציגות מראות קדמיים ואחוריים של אותה דרוזופילה בוגרת.

גרעיני התאים הודגמו על ידי צביעת DAPI ונוירונים סומנו באמצעות סמן עצבי פאן ונוגדנים נגד ELAV. נוירונים דופמינרגיים, או DA, התגלו על ידי כתם נוגדנים נגד TH. רמות דומות של עוצמה נצפו בין שני צידי המוח עבור כל ערוצי התמונה.

תצוגות מוגדלות של החלק הקדמי והאחורי של המוח מאפשרות בחינה מפורטת של אשכולות העצבים של DA. ניתן לראות את האשכול המדיאלי הקדמי המזווג בתמונות הקדמיות, ואת האשכולות הצדדיים האחוריים והאחוריים המזווגים בצד האחורי של המוח. כימות של נוירונים אלה גילה כי לזבובי זן w1118 זכרים בני שלושה ימים יש בדרך כלל 27 נוירונים DA בצביר PPM בכל המוח, 16 באשכול PPL לכל חצי כדור וחמישה בצביר PAL לכל חצי כדור.

ממוצע של 97 נוירוני DA נצפה בכל אחד מה-PAM clusters. 3D שחזור של אשכולות PAL ו-PAM הראה גם כי לנוירוני DA באשכול PAM יש גדלים קטנים יחסית וצביעה TH חלשה יותר מאלה שבאשכולות האחרים, כגון PAL. יותר ויותר מחקרים מתמקדים במוחות של זבובים בוגרים לניתוח מסלולים מולקולריים ומעגלים עצביים העומדים בבסיס תפקודי מוח גבוהים יותר, ולמידול מחלות מוח אנושיות.

במחקרים מבוססי מוח כאלה יהיה צורך להכין ביעילות דגימות מוח עם מורפולוגיה שמורה היטב. זה יכול להיות חשוב במיוחד במסכים מבוססי מוח בקנה מידה גדול. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשנאבקתי להחזיק זבובים במלקחיים.

במקום מלקחיים עם קצוות חדים שרוב חוקרי הדרוזופילה משתמשים בהם, שבנא ניסתה מלקחיים קהים וגילתה שקל יותר לנתח את המוח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-10 שניות אם היא מבוצעת כראוי. פעם ניתחתי כ-100 מוחות של שישה גנוטיפים שונים לניסוי אחד ביום אחד בלבד.

למרות שהליך דיסקציה זה עשוי להיראות פשוט, חשוב לתרגל אותו תחילה עם זבובים שניתן לחלוק עליהם. החוקר עשוי גם להתקשות במיקום המלקחיים מבלי להרוס את מוח הזבוב. המוחות המנותחים יכולים לשמש למחקרים אחרים, כמו RNA, הכלאה באתר, ומיצוי של דגימות חלבון ורנ"א מרקמת המוח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לנתח מוחות זבובים עם מורפולוגיה שמורה היטב. אנו צופים שניתן לפתח שיפורים כדי להפוך את ההליך הזה לפשוט ומהיר יותר. זה יכול להפוך לאוטומטי בעתיד עבור מחקרים בקנה מידה גדול.

אל תשכח שעבודה עם הפרפורמלדהיד ומלקחיים חדים עלולה להיות מסוכנת. נקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת טיפול בתמיסות מקבעות, ולאחר השלמת הדיסקציה כסה מיד את המלקחיים לפני שמניחים אותם בצד.