הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

איך כולכם, בסרטון הזה, אדגים כיצד להכין את ה-oph של המוח והרשתית להדמיה חיה ואימונוהיסטוכימיה עם דגש על תאים קולטני אור. ראשית, אראה לכם כיצד להתכונן לנתיחות מוח. לאחר מכן אדגים שלוש דיסקציות שונות, המוח הבוגר, הרשתית הבוגרת והעין המתפתחת.

עבור כל אחד מאלה, הרקמה עשויה להיות קבועה לאימונוהיסטוכימיה או לחיים מדומים. לבסוף, אתאר כיצד אנו מדמים רקמת חיים, ואראה כמה דוגמאות להדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת תהודה. אז בואו נגיע לזה.

עבור סעיפים טובים, אתה צריך מלקחיים חדים. בעזרת בלוק השחזה או נייר זכוכית עדין מאוד, העבירו בעדינות את המלקחיים קדימה ואחורה מכל צד עד שהקצוות נפגשים. בשלב עדין, אנו משתמשים באבן השחזה רגילה.

לא אסקור כאן את טכניקת ההשחזה, אך אומר כי מלקחיים חדים חיוניים לנתיחות חיות. אנו משחיזים מלקחיים מדי יום לנתיחות מוח של מבוגרים. הניחו את הזבובים על כרית CO2 כדי להרדים אותם ולמיין את הגנוטיפ הרצוי.

עבור דיסקציות אישון, פשוט הושט יד לתוך הבקבוקון והסר בזהירות אישון עם המלקחיים שלך, היזהר להימנע משבירת מארז האישון. יש להניח מגבון קים ולהרטיב אותו במים. תשתמש בזה במהלך הדיסקציה כדי להסיר פסולת מהמלקחיים שלך.

מקם צלחת מנתחת על במת סטריאוסקופ ומלא אותה בתמיסת HL שלוש. כל הנתיחות יבוצעו ב-HL 3 כדי להבטיח שהרקמה תישאר חיה ובריאה במהלך הליך הדיסקציה. כמו כן, אני אוהב להשתמש בצלחת דיסקציה שיש לה כיסוי תחתון של מגן סיל כדי להגן על המלקחיים שלי במהלך הדיסקציה.

כעת, הכינו פיתרון תיקון. אם אתה מתכנן לבצע אימונוהיסטוכימיה. הנח 180 מיקרוליטר של HL שלוש לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר.

הוסף 20 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד כדי להשיג תמיסת פורמלדהיד של 3.7%. לבסוף, תנוחת יד נכונה חשובה לנתיחות טובות עם תנוחת יד טובה. המלקחיים שלך יהיו יציבים ומסוגלים לשלוט בתנועות עדינות

ראשית, הניחו את המלקחיים בצד האגודל, ואז הביאו את האצבע המורה ישר כלפי מטה כך שקצה האצבע מונח למעלה. כעת הניחו את צד המלקחיים בצד האצבע האמצעית ועברו לצלחת הדיסקציה. צור מגע פיזי עם המנה על ידי האגודל והאצבע האמצעית תוך הנחת האגודל והאצבע האמצעית על המנה.

שתלו את פרק כף היד שלכם על במת המיקרוסקופ. ככה. יש לך שלוש נקודות נטועות היטב על משטחים במהלך הדיסקציה, ועכשיו אפשר לבצע רק מניפולציות עדינות מאוד של המלקחיים.

על כרית ה-CO2. כוון את צד הגחון של זבוב בוגר כלפי מעלה כשהראש רחוק מהיד שלך. תפוס את בית החזה ממש מתחת לראש.

אם נעשה כראוי, הרגליים והפרובוס יתארכו תוך כדי צפייה תחת סטריאוסקופ, תפסו את החרטום המורחב עם המלקחיים שלכם כדי להסיר את הראש, השליכו את הגוף ושקעו את הראש. התמקד מחדש בראש השקוע. הדיסקציה כולה תבוצע תחת תמיסה.

חשוב מאוד להחזיק את הראש עם המלקחיים כל הזמן. אחרת, הראש יצוף. וזכרו, ראש צף תמיד קשה לשלוף.

אם הראש זז מחוץ למיקוד במהלך הדיסקציה, פשוט הזיזו אותו בחזרה למישור המוקד מבלי לכוונן את המיקרוסקופ. משימה פשוטה לכאורה זו עשויה להיות קשה בהתחלה, אך שמירה על הראש בפוקוס תהפוך לקלה יותר עם הזמן. התחל את הדיסקציה על ידי קריעת רקמת החיבור בין הפרובוס לעין.

יש לקרוע את העין תוך אחיזה חזקה עם מלקחיים אחד לפחות בכל עת. היו בטוחים שהבוהן של המלקחיים נמצאת רק מתחת לרשתית או לציפורן. כדי להימנע מפגיעה במוח שמתחת, לסירוגין שמאלה וימינה.

השתמש במלקחיים שלך כדי לקרוע את הרשתית הפועלת לכיוון החלק האחורי של הראש. קריעת הרשתית תגדיל את הסיכוי שהלמינה תישאר מחוברת לאונה האופטית. לאורך כל הדיסקציה הזו, המשיכו סביב החלק האחורי של הראש, קרעו את הציפורן לאורך הדרך, קרעו את העין השנייה והתחילו למשוך את הציפורן.

כל עוד אתה תופס את הציפורן, אתה יודע שאתה לא מרסק את המוח. עם זאת בחשבון, המשיכו למשוך את הקוטיקולה והרשתית עד שהמוח נחשף. ברגע שהמוח נראה, אתה יכול להתחיל להסיר את קנה הנשימה המחובר למוח, להמשיך למשוך אותו, קנה הנשימה והקוטיקולה עד שהמוח מבודד.

בשלב זה, עליך להתמקד מחדש בתחתית המנה שלך עבור השלבים הנותרים להדמיה של מסופי קולטני האור. רצוי לשמור על הלמינה, אך עליך להסיר את הרשתית המכילה את גופי התאים ופיגמנט אוטופלואורסצנטי חזק. לשם כך, משוך בזהירות את שרידי גוף התאים העבותים מבלי לפגוע בלמינה.

זו מיומנות עדינה יותר ודורשת תרגול. הסר את קנה הנשימה שנותר מכיוון שהמוח שלך עלול לצוף במהלך שטיפת נוגדנים בלילה, המוח הבוגר יכול להישאר בחיים במשך שעות או אפילו לילה באמצעות מצבים שאדון בהם בסעיף 7. עבור אימונוהיסטוכימיה, המוח הבוגר מוכן כעת לקיבוע ולפורמלדהיד.

השתמש בפיפט P 20 המוגדר לחמישה מיקרוליטר כדי להעביר את המוח הבוגר לתמיסת הקיבוע שכבר הכנת. המשיכו לנתח מוחות בוגרים במשך 20 דקות, מה שאמור להניב ארבעה עד 10 מוחות. השאירו את המוח ותקנו למשך 40 דקות נוספות.

עם זאת, משך זמן זה עשוי להשתנות. להכתמת נוגדנים ראשונית אופטימלית, הסר את תמיסת הפורמלדהיד ושטוף את המוח שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת ו-400 מיקרוליטר של תמיסה המכילה PBS ו-0.4% TRITTON X 100 להלן PBS Triton. לאחר שטיפה מלאה של התמיסה הקבועה, ניתן להוסיף תמיסת נוגדנים ראשונית.

התחל דיסקציה זו כמתואר עבור המוח הבוגר לאחר טבילת הראש ומיקוד מחדש של המיקרוסקופ, התחל בקריעה של רקמת החיבור בין הפרובוס לעין מעל הפרובוס. יש להפריד את הקוטיקולה מהעין. כעת הפרד את הקוטיקולה מהחלק התחתון של העין הפועל לכיוון החלק האחורי של הראש בעזרת מלקחיים אחד.

תפוס את מרכז החלק האחורי של הראש לדיסקציה זו. זה בסדר לרסק את המוח עם המלקחיים האחרים. תפוס את העין והתפרק.

הניחו לעין להתיישב בתחתית המנה. הלמינה כנראה עדיין תהיה מחוברת לעין וניתן להשתמש בה להדמיה חיה של מסופי קולטני האור מתאי קולטני אור שלמים לחלוטין. שלושת הסעיפים הבאים מסבירים כיצד להכין את העין לאימונוהיסטוכימיה.

עבור אימונוהיסטוכימיה, העבר את העין לתמיסת קיבוע. בעזרת צינור P 20 Petman המוגדר לחמישה מיקרוליטר, המשך לנתח עיניים בוגרות למשך 10 דקות בסך הכל. יש להשאיר את העיניים ולקבע למשך 30 דקות נוספות.

הסר את התמיסה הקבועה ובצע שטיפות כמתואר בדיסקציה של המוח למבוגרים. אם בסופו של דבר אתה רוצה לדמיין את המבנה החומרי של העין, אז יש להסיר אותו. כעת החזר את העיניים הקבועות לצלחת הניתוח שלך והסר את כל קנה הנשימה או תאי השומן שעדיין עשויים להיות מחוברים.

לאחר מכן, תוך כדי החזקת החלק החיצוני של העין בעזרת מלקחיים אחד, הסר את הלמינה עם השני. זה צריך לרדת בחתיכה אחת, ולחשוף את גופי התאים שמתחת. היזהר לתפוס את הלמינה רק אחרת, אתה מסתכן בניתוק גופי התאים מהרשתית.

בעזרת צינור P 20 Eman, העבירו את העיניים ל -400 מיקרוליטר PBS Triton בצינור של 500 מיקרוליטר. נדנד אותם בעדינות בארבע מעלות למשך הלילה כדי להסיר את הפיגמנט האדום האוטו-פלואורסצנטי מקולטני האור למחרת. אתה יכול להשליך את תמיסת הכביסה ולהוסיף כל אחד ראשוני להדמיה חיה של עיניים בוגרות ללא הלמינה.

אנו משתמשים רק בזבובי חמוס בוגרים, שהם בשלב מאוחר של puy זמן קצר לפני elo. בשלב זה, גופי התאים קולטני האור נפרדים מהטרמינלים בלמינה במהלך תסירת הדיסקציה. לפוי בוגר יש כנפיים, עיניים וציפורן מוגדרות היטב הנראות דרך מארז האישון.

בחר גולם והטביע אותו ב-HL שלוש. הסר את החלק הקדמי של מארז האישון כדי לחשוף את אזור הראש. הסר בזהירות את הממברנה הפנימית הדקה הסוגרת בנוסף את הזבוב המתפתח.

תפוס את בסיס הראש עם המלקחיים שלך ומשוך. השליכו את שאר הגולם תוך שמירה על הראש שקוע. המשך כמתואר בדיסקציה של העין לאימונוהיסטוכימיה בשלב הבוגר.

עם זאת, גופי התאים קולטני האור יתנתקו ביתר קלות מהלמינה, ויאפשרו לך לדמות את גופי התאים השוכנים ברשתית. כמו כן, הלמינה נשארת מחוברת לאונה האופטית, ומאפשרת לך לדמות את הלמינה הדיסטלית. אם ברצונך לדמות את הלמינה הפרוקסימלית שבה ניתן לראות את מחסניות הקצה של קולטני האור, בצע את דיסקציה של העין על זבוב בוגר שבו הלמינה מחוברת חזק יותר לעין.

דיסק העין המתפתח ב-20% התפתחות אישון הפך למועדף להדמיה חיה במעבדה שלנו. מכיוון ששכבה בודדת זו של תאים מתפתחים גדולים יחסית ניתנת לצפייה בקלות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כדי לבחור גולם של 20%, חפשו את צינוריות איאן, נקודה ירוקה המופיעה מתחת למארז האישון והימנעו מגורים בעלי גוף כהה שנוצר לאחר התפתחות של 20% אישון.

לאחר בחירת גולם, טבלו אותו ב-HL 3 בכלי החיתוך שלכם והסירו בזהירות חלק קדמי של שק האישון. נזהר לא לחדור לקרום הפנימי הדק. אחוז בקרום הפנימי עם המלקחיים שלך והתפרק.

חפש בזהירות בתוכן המשוחרר כדי למצוא את דיסקי המוח והעין המתפתחים, שהם די בולטים. בודדו את המוח בתחתית צלחת הניתוח. הפרד בזהירות את המוח המרכזי מהאונה האופטית.

קומפלקס האונה האופטית I ישמש להדמיה חיה. אם ברצונך לצלם לפרק זמן קצר בפתרון אחד או שניים בלבד, תוכל לדמות את הרקמה שלך על שקופית זכוכית. במקרה זה, הכן את השקופית על ידי ציפוי תחילה של המשטח במגן סיל לפי הוראות היצרן.

מניחים 20 מיקרוליטר HL שלושה. באמצע השקופית, העבירו את הרקמה המנותחת שלכם ב-20 מיקרוליטר נוספים של HL 3 לשקופית. אסור לחשוף את הרקמה לאוויר.

בנוסף, יש להימנע מכל לחץ או מתח מטיפול בפיפטה. לצורך הדמיה חיה, הרקמה חייבת להיות מאובטחת היטב. השג אלקטרודת זכוכית כמו אלה שנמשכו להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.

שברו את הקצה ומלאו את הקצה בתפר דבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה, נתקו רק מספיק מהאלקטרודה שהדבק עלול להיכנס. כעת השתמש בלחץ חיובי כדי למרוח כמות קטנה של דבק על מגן האדן מתחת לטיפה של HL שלוש. כעת, הניחו במהירות את הרקמה על הדבק, תוך שמירה על הכיוון הרצוי להדמיה חיה.

כעת ניתן להשתמש בעדשת טבילה במים להדמיה. אם אתה רוצה להוסיף צבע חדיר קרום, אתה יכול להוסיף אותו לאמבטיה. בעת הדמיה להדמיה לפרקי זמן ארוכים או להחלפת תמיסות לחלוטין או מספר פעמים, אנו משתמשים בתא זלוף המתחבר למשאבה פריסטלטית המחדירה לאט תמיסת תרבית על הרקמה החיה.

השתמש בהחלקת כיסוי המצופה בטיפת מגן סיל המגולח כדי להפוך אותו לדק ושטוח. הוצא 20 מיקרוליטר HL שלושה על מרכז הכיסוי. החלק והדבק את הרקמה החיה למגן האדן.

צור אטם שיאפשר לבועות לעבור דרך החדר מבלי לחשוף את הרקמה החיה לאוויר. האטם צריך להיות עבה מספיק כדי למנוע ריסוק הרקמה, אך דק מספיק כדי לקרב את הרקמה לעדשת המיקרוסקופ הקונפוקלי. הרכיבו את תא השפע תוך הקפדה לשמור על הרקמה שקועה לחלוטין בכל עת.

כך שניתן לבצע החלפות תמיסות בקצבים של עד 100 מיקרוליטר לדקה. להדמיה בקנה מידה של שעות, ייתכן שתצטרך להוסיף 20 הידרוקסי דייסון ואנטיביוטיקה, אך לא אנטי פטרייתי ולבצע שפע במהירויות איטיות בהרבה סביב 10 מיקרוליטר לדקה. כמו כן, אנו מבעבעים חמצן למדיום התרבות המספק את המשאבה הפריסטלטית.

עכשיו יש לך את כל הכישורים הדרושים לדיסקציה מוצלחת של המוח והרשתית של הדרוזופילה. כמו כן, אתה יכול לדמיין דיסקי עיניים מתפתחים חיים או קולטני אור למבוגרים. אז תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.