Name: הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: למד הכנת מוח ורשתית של Drosophila לצילום חי ואימונוהיסטוכימיה. הפרוטוקול מדגים ניתוחי מוח בוגר, רשתית ודיסק עין מתפתח לחקר תאי קולטני אור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קרן וולש (I-1657) ו-NIH (RO1EY18884). PRH הוא חוקר יוג&#39;ין מק &#39;דרמוט במחקר ביו.

<ol><li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+lobe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li>
<li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li>
<li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li>
<li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li>
<li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+subtype+specification%3A+from+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li>
<li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaoptin%2C+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis%2C+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li>
<li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system%3A+optic+neuropile+expression+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li>
<li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li>
<li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li>
</ol>

בדיקות ניאון משמש הדמיה כאן אנו מתארים את נקודות החוזק ואת המגבלות של הכנת תסיסנית מערכת הראייה עבור מבחר של בדיקות ניאון משלוש מחלקות: (1) בדיקות שיתווספו הכנה רקמת חיים exogenously; (2) חלבוני ניאון כי מקודדים גנטית הן לחיות הדמיה קבוע; (3) צבעי ניאון שיתווספו רקמות קבוע אימונוהיסטוכימיה. 1. אקסוגניים בדיקות: Lysotracker גרין DND-26 או אדום DND-99 (Invitrogen, Inc) אלה זמינים מסחרית פלורסנט קרום חדיר תרכובות להצטבר בתאים acidified חזק בתא, הבולט lysosomes, מאוחר endosomes, ואת autophagosomes. Lysotracker בריכוזים nanomolar (אנו משתמשים בדרך כלל 50 ננומטר) חודר דיסק L3 ו-P עין 20% באופן מלא פחות מדקה אחת. מאז Lysotracker ברציפות מצטבר ו מפעיל השפעה alkalizing, אנו התמונה פחות מ -5 דקות. בניגוד דיסקים העין, Lysotracker לא לחדור למוח ללא הפרעה של הרקמה. עם זאת, נזהר קריעת הקרום החיצוני מאפשר חדירה של קטרים ​​תא כמה באונה אופטיים. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc) בניגוד Lysotracker, Lysosensor לא לצבור בתאים acidified, אבל מפגין גדל הקרינה ב-pH חומצי. Lysosensor יש מאפיינים חדירה דומים מאוד Lysotracker. אנו משתמשים Lysosensor בריכוז של 1μM. 2. מקודד גנטית בדיקות: עבור רבים ניסויים הדמיה לחיות, אנחנו מבטאים גנים מתוייגים עם מולקולות ניאון שונים כמו ה-GFP, TagRFP 10 או ה-pH רגיש pHluorin 11 תחת שליטה של מערכת בינארית Gal4/UAS הביטוי 12. Gal4 קווים המבטאים ב photoreceptors בפיתוח כוללים GMR-Gal4 (כל photoreceptors) 8 ו-mDelta0.5 Gal4 (פיתוח R4 ו R7) 13. מספר תת ספציפיים Gal4 נהג קווים קיימים להשתמש יזמים שונים Rhodopsin 14. בדיקות ניאון שימושי במיוחד בתחום ההדמיה לחיות הם חלבונים photoconvertible. השתמשנו בהצלחה Dendra2, חלבון monomeric ירוק ל-אדום photoconvertable 15. שים לב Dendra2 נועד להיות photoconvertible באמצעות קו ארגון 488nm לייזר. עם זאת, לא נוכל להשיג באמצעות המרת אור כחול לעין שלנו באמצעות הגדרת במצב או קונבנציונלי או סריקת תהודה confocal. לעומת זאת, המרה עם לייזר UV 405nm יעיל. 3. אימונוהיסטוכימיה: עבור העין מבוגר קבוע, לעתים קרובות אנו לבחור phalloidin rhodamine (Invitrogen, Inc) או אנטי Chaoptin (נוגדן ספציפי photoreceptor 16) כדי להמחיש rhabdomeric מבנה (איור 1A). דרך טובה לנתח את מבנה מחסנית lamina היא לשלב אנטי chaoptin 16, סמן גליה אנטי הובנה 17, ואנטי sec6 18 (1B איור). כפי שמוצג באיור. 3, זה שילוב של נוגדנים המבדיל העיקרי presynaptic (chaoptin) ו postsynaptic (sec6) תהליכים, כמו גם גליה אפיתל (הובנה) ב lamina 19. הרכבת לשכת זלוף עבור הדמיה לחיות, אנחנו מעסיקים קאמרית זלוף המאפשר חילופי איטי של פתרונות מבלי להפריע הכנה רקמות. הפגנה של הרכבה קאמרית זלוף כלול וידאו ומוצגות סכמטי באיור 2. האסיפה של החדר זלוף מתוארת באיור. 2A. בגין על ידי הנחת אטם מעל הדגימה הראשונה, ולאחר מכן להמשיך עם הרכבה כפי שמוצג. מטרתו של אטם היא ליצור רווח בין הבסיס של החדר ואת המכסה, בתוך חלל שבו רקמה היא חתומה באמצעות פתרון אשר יזרמו. החלל בתוך אטם חייב לכלול את כניסת (פתרון נכנס כאן), הכנה רקמות, ולשקע שדרכו פתרון עוזב את החדר. שתי תכונות של אטם הם קריטיים: ראשית, אטם חייב להיות עבה מספיק בשביל המוח עדיין רזה מספיק כדי לאפשר הדמיה עם עדשה ברזולוציה גבוהה. עובי אטם אידיאלי תלויה הגדרת פרמטרים ספציפיים. שנית, חריץ אטם מספק בתא המאפשר בועה לעבור בלי קשר את הדגימה (איור 2B). הדמיה על המיקרוסקופ אנו משתמשים עדשה 63x (צמצם 1.3) טבילה גליצרין עבור החדר זלוף או עדשה 63x טבילה במים ישירות לתוך המדיום תרבות בשקופית. עדשות גליצרין לספק יותר עבודה מאשר המרחק עדשות שמן. אנו משתמשים מיקרוסקופ סורק תהודה confocal שסורקת בשיעורים הרבה יותר מהר מאשר סורק קונבנציונאלי (8000 הרץ לעומת 1400 הרץ, בהתאמה). סריקת תהודה מאפשר 3 מימדי ההקלטות לאורך זמן על מהירותאה מסגרת חליפין. בנוסף, מהירות סריקה מהירה יותר להפחית באופן משמעותי phototoxicity 6 לייזר אשר הוא החשש העיקרי עבור סריקות חוזרות ונשנות של רקמה חיה. איזון עוצמה לייזר מתח PMT (רווח) חייבת להיות מושגת על מנת למקסם את האות תוך מזעור רעש photobleaching. שיקול נוסף חשוב הוא כי כמות ההשפעה לייזר על איזור מסוים נקבעת על ידי החלטה וזום. לדוגמה, באזור הבחירה נסרק ברזולוציה באותו 256x256, זום 2x ליום 512x512, זום 1x, אך מהירות מקסימלית אפשרית הדמיה לחיות היא 4 פעמים מהר יותר ב 256x256, זום 2x. כדי להקליט את הפעילות של תאים תאיים נע במהירות, יש לנו נרשם בהצלחה עם ההגדרות הבאות: 5 frames per-z מחסנית בקצב של אחד Z-מחסנית ל 10 שניות עם מהירות סריקה של הרץ ו - 8000 בממוצע קו 2x. הפעלות הדמיה ארוך בהיקף של שעות, לעתים קרובות אנו להפחית את שיעור מסגרת אחת לכל כמה דקות ולבחור אזורים גדולים כמו הכנת סביר יותר משמרת. תסיסנית חזותית האנטומיה מערכת איור 3 מראה את האנטומיה של העין מבוגר תסיסנית (איור 3A), המוח הבוגר (איור 3B), ו 20% -25% מורכבים גלמי דיסק / עין המוח (איור 3 ג). איור 3A ממחיש את העין למבוגרים עם או בלי lamina ואת בתאי השומן המצורפת. במהלך דיסקציה העין מבוגרים, lamina, אשר נמצא במרכז העין השוכן בקערה שיצרו גופי התא photoreceptor (משמאל), יש להסיר מבלי לשבש את גופי התא מתחתיו (ימין). עבור לנתיחה המוח הבוגר, אחד צריך להיות מסוגל להבחין בין גופי התא photoreceptor, lamina, האונה אופטיים, המוח המרכזי, קנה הנשימה (איור 3B). Photoreceptors ואת קנה הנשימה צורך להסיר לנתיחה זה תוך השארת lamina המצורפת באונה אופטיים. כדי לסייע בזיהוי המורכב של 20-25% גלמי עין דיסק / המוח, תמונה חיה מוצג באיור 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="דיאגרמת אנטומיה עצבית המציגה מוח, אונה אופטית, גופי תאים; דיסקציה של למינה, קולטני אור." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (א) במוח מבוגר. (ב) בוגר העין. (ג) 20% -25% מורכבים גלמי eye-disc/brain. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="תרשים התקנה מיקרופלואידית עם זרימת דגימה, עדשת אובייקטיבית, כניסות, שקעים, משאבה, אטם, בסיס." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 2"> איור 2. (א) חדר זלוף הרכבה (ב) מיקום אטם יחסית הדגימה. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; מבנים תאיים, סמנים ירוקים/אדומים, השוואה ניסויית." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 3"> איור 3. (א) מכתים rhabdomere למבוגרים באמצעות אנטי chaoptin. (ב) lamina למבוגרים מכתים באמצעות אנטי chaoptin (ירוק, photoreceptors), אנטי הובנה (אדום, גליה), ו sec6 (כחול, interneurons).

ציוד מיוחד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היקף Dissection: Leica Mz12.5 עם מצלמה דיגיטלית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייקה TCS SP5 Confocal טנדם-מיקרוסקופ סורק לסריקה קונבנציונאלי ומהדהד לחיות מיקרוסקופיה הדמיה, כולל כחול (488nm), ירוק (561nm), תפוזים (594nm) והרבה אדום (633nm) לייזרים וכן 63x מיוחד, 1.4 גליצרין ו 63x, 1.3 עדשות טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרווארד מכשירים Confocal הדמיה לשכת RC-30 ו peristaltic משאבה דגם 720 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סאטר פיפטה חולץ P-97 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנה: 5.2 עמירה, הדמיה הפרצוף </li></ol>

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

<em&gt; תסיסנית</em&gt; המוח ומערכת הראייה מנוצלים נרחב במערכות מודל ללמוד פיתוח העצבית, פונקציה וניוון. כאן אנחנו מראים three ההכנות של המוח ומערכת הראייה כי לכסות את טווח ממתחם בפיתוח עין דיסק המוח המתפתח גלמים בעין הפרט לנתיחה המוח מפני זבובים בוגרים. כל הפרוטוקולים מותאמים לתרבות חיים של ההכנות. עם זאת, אנו מציגים גם את התנאים אימונוהיסטוכימיה רקמות קבוע במקומות המתאימים. לבסוף, אנו מראים התנאים הדמיה לחיות אלה ההכנות באמצעות קונבנציונאלי ומהדהד 4D הדמיה confocal לחיות בתא זלוף. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים בסיס הדמיה לחיות על סולמות זמן שונים, החל מבחני תאיים פונקציונלי בקנה מידה של דקות תהליכים התפתחותיים או ניווניות בהיקף של שעות רבות.

פרוטוקול זה מתאר שלוש<em&gt; תסיסנית</em&gt; ההכנות: 1) מוח לנתיחה למבוגרים, 2) ברשתית מבוגר לנתיחה ו 3) לפתח דיסק במוח עין לנתיחה קומפלקסים. הדגש מושם על טכניקות הכנה מיוחדת ותנאי הדמיה לחיות, למרות כל ההכנות ניתן להשתמש אימונוהיסטוכימיה רקמות קבוע.

המוח ומערכת הראייה של ה-Drosophila הם מערכות מודל הנמצאות בשימוש נרחב לחקר התפתחות נוירונלית, תפקוד ודגנרציה. כאן אנו מציגים שלושה...

שלום לכולם, בסרטון זה אדגים כיצד להכין דגימות של מוח ורשתית לצילום חי (live imaging) ואימונוהיסטוכימיה, תוך התמקדות בתאי פוטורספטורים. ראשית, אראה לכם כיצד להכין את הציוד לדיסקציות של המוח. לאחר מכן, אדגים שלוש דיסקציות שונות: מוח של בוגר, רשתית של בוגר, ועין בשלבי התפתחות.עבור כל אחד מאלה, ניתן לקבע את הרקמה לצורך אימונוהיסטוכימיה או לדגמה בשידור חי. לבסוף, אתאר כיצד אנו מדגמים רקמה חיה, ואציג מספר דוגמאות של דימוי חי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת רזוננס. אז בואו נתחיל.עבור חיתוכי גודנס (goodness sections), נדרשות פינצטות חדות. באמצעות בלוק השחזה או נייר זכוכית דק מאוד, העבירו בעדינות את הפינצטות הלוך וחזור על כל צד עד שהקצוות נפגשים. לקבלת חוד דק, אנו משתמשים באבן השחזה סטנדרטית.לא אפרט כאן את טכניקת ההשחזה, אך אציין שפינצטות חדות הן חיוניות לניתוחים של רקמות חיות. אנו משחזים את הפינצטות מדי יום עבור ניתוחים של מוחות בוגרים. הניחו את הזבובים על פד CO2 כדי להרדימם ומיינו את הגנוטיפ הרצוי.עבור דיסקציות של אישונים, פשוט הגיעו אל תוך הבקבוק והוציאו בזהירות אישון בעזרת הפינצטה, תוך הקפדה להימנע משבירת מעטפת האישון. גלגלו נייר ניגוב מסוג kim wipe והרטיבו אותו במים. תשתמשו בנייר זה במהלך הדיסקציה כדי להסיר שאריות מהפינצטה.הניחו צלחת ניתוח על המשטח של סטראוסקופ ומלאו אותה בתמיסת HL three. כל הניתוחים יבוצעו ב-HL three כדי להבטיח שהרקמה תישאר חיה ובריאה במהלך הליך הניתוח. כמו כן, אני מעדיף להשתמש בצלחת ניתוח בעלת ציפוי Syl guard בתחתית כדי להגן על הפינצטות במהלך הניתוח.כעת, הכינו תמיסת קיבוע. אם בכוונתכם לבצע אימונוהיסטוכימיה, העבירו 180 µL של HL three לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 500 µL.הוסיפו 20 µL של formaldehyde בריכוז 37% כדי להגיע לתמיסת formaldehyde בריכוז 3.7%. לבסוף, מיקום נכון של הידיים הוא חיוני לביצוע נתיחות איכותיות; כאשר הידיים ממוקמות נכון, הפינצטות יהיו יציבות ויאפשרו תנועות עדינות ומבוקרות.ראשית, הניחו את הפינצטה לצד האגודל, ולאחר מכן הורידו את האצבע המורה כך שקצה האצבע ינוח מעליה. כעת, הניחו את צד הפינצטה על צד האצבע האמצעית והעבירו אותה אל צלחת הניתוח. צרו מגע פיזי עם הצלחת באמצעות האגודל והאצבע האמצעית, תוך כדי הנחתן על הצלחת.הניחו את שורש כף היד על בסיס המיקרוסקופ. כך. בצורה זו, יש לכם שלוש נקודות נשענות בבטחה על משטחים במהלך הניתוח, וכעת ניתן לבצע מניפולציות עדינות מאוד בלבד באמצעות הפינצטה.על משטח ה-CO2. מקמו זבוב בוגר כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה והראש רחוק מהיד שלכם. אחזו בחזה מיד מתחת לראש.בביצוע נכון, הרגליים והחרטומ ייוצרו בזמן התבוננות תחת סטראוסקופ; תפסו את החרטומ המתוח בעזרת הפינצטה כדי להסיר את הראש, השליכו את הגוף והטביעו את הראש. התמקדו מחדש בראש הטבוע. כל תהליך הנתיחה יבוצע בתוך התמיסה.חשוב מאוד להחזיק את הראש בעזרת הפינצטה בכל עת. אחרת, הראש יצוף. וזכרו, ראש צף הוא תמיד קשה לשליפה.אם הראש יוצא מהמיקוד במהלך הנתיחה, פשוט החזירו אותו למישור המיקוד מבלי לכוון את המיקרוסקופ. משימה שנראית פשוטה זו עשויה להיות קשה בתחילה, אך שמירה על הראש במיקוד תהפוך לקלה יותר עם הזמן. התחילו את הנתיחה תחילה על ידי קריעה של רקמת החיבור שבין הprobus לבין העין.קרעו את העין תוך כדי החזקה איתנה עם פינצטה אחת לפחות בכל עת. ודאו שקצה הפינצטה נמצא רק מעט מתחת לרשתית או ל cuticle. כדי למנוע נזק למוח שמתחתיה, החליפו בין צד שמאל לצד ימין.השתמשו בפינצטה כדי לקרוע את הרשתית תוך התקדמות לכיוון החלק האחורי של הראש. קריעת הרשתית תגדיל את הסיכויים שהלמינה תישאר מחוברת לאונה האופטית. לאורך נתיח זה, המשיכו סביב החלק האחורי של הראש, תוך קריעת הקוטיקולה בדרככם, קרעו דרך העין השנייה והתחילו להסיר את הקוטיקולה.כל עוד אתם אוחזים בקוטיקולה, אתם יודעים שאינכם מועכים את המוח. בהתחשב בכך, המשיכו למשוך את הקוטיקולה והרשתית הרחקה עד שהמוח ייחשף. ברגע שהמוח נראה לעין, ניתן להתחיל בהסרת הקנה (trachea) המחובר למוח; המשיכו למשוך אותו, את הקנה ואת הקוטיקולה עד שהמוח יהיה מבודד.בשלב זה, יש להתמקד מחדש בתחתית הצלחת עבור השלבים הנותרים של הדמיית קצות הפוטורצפטורים. רצוי לשמר את ה-lamina, אך יש להסיר את הרשתית המכילה את גופי התאים ופיגמנט בעל אוטופלורסנציה חזקה. כדי לעשות זאת, משוך בזהירות את שאריות גוף התא המסועף מבלי לפגוע ב-lamina.זוהי מיומנות עדינה יותר הדורשת תרגול. הסר את שארית הקנה. מכיוון שהמוח עלול לצוף במהלך שטיפות הנוגדנים למשך הלילה, ניתן לשמור את מוח המבוגר בחיים למשך שעות או אפילו לילה שלם תוך שימוש בתנאים שנדון בהם בסעיף שבע. עבור אימונוהיסטוכימיה, מוח המבוגר מוכן כעת לקיבוע בפורמאלדהיד.השתמשו בפיפט P 20 המכוון לחמישה מיקרוליטרים כדי להעביר את מוח המבוגר לתמיסת הקיבוע שהכנתם מראש. המשיכו בניתוח של מוחות מבוגרים במשך 20 דקות, מה שאמור להניב בין ארבעה ל-10 מוחות. השאירו את המוחות בקיבוע למשך 40 דקות נוספות.עם זאת, משך זמן זה עשוי להשתנות. לצביעה אופטימלית של נוגדן ראשוני, יש להסיר את תמיסת הפורמאלדהיד ולשטוף את המוחות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם עם 400 µL של תמיסה המכילה PBS ו-0.4%TRITTON X 100, אשר תיקרא להלן PBS Triton. לאחר שטיפה מלאה של תמיסת הקיבוע, ניתן להוסיף את תמיסת הנוגדן הראשוני.התחילו את הנתיחה כפי שמתואר עבור המוח הבוגר. לאחר טבילת הראש ומיקוד מחדש של המיקרוסקופ, התחילו בקריעת רקמת החיבור שבין ה-probus לבין העין, מעל ה-probus. הפרידו את הקוטיקולה מהעין. כעת הפרידו את הקוטיקולה מהצד התחתון של העין, תוך התקדמות לעבר החלק האחורי של הראש באמצעות פינצטה אחת.בתהליך נתיחה זה, אחזו במרכז החלק האחורי של הראש. ניתן למעוך את המוח עם פינצטה שנייה. אחזו בעין ומשכו אותה החוצה.המתינו עד שהעין תשקע לתחתית הצלחת. הלמינה תהיה ככל הנראה עדיין מחוברת לעין וניתן להשתמש בה לצילום חי (live imaging) של קצות הפוטורצפטורים מתאי פוטורצפטורים שלמים לחלוטין. שלושת הסעיפים הבאים מסבירים כיצד להכין את העין לצביעה אימונוהיסטוכימית.עבור אימונוהיסטוכימיה, העבירו את העין לתמיסת הקיבוע. באמצעות פיפטמן P 20 המכוון לחמישה µL, המשיכו בניתוח עיניים של בוגרים למשך 10 דקות בסך הכל. השאירו את העיניים בקיבוע למשך 30 דקות נוספות.הסיר את תמיסת הקיבוע ובצע שטיפות כפי שמתואר בניתוח מוח של בוגר. אם ברצונך לצלם בסופו של דבר את המבנה החומרי של העין, יש להסיר אותם. כעת החזר את העיניים המקובעות לצלוחית הניתוח והסר כל קשקשת של קנה הנשימה או תאי שומן שעשויים להיות עדיין צמודים.לאחר מכן, תוך כדי החזקת החלק החיצוני של העין עם פינצטה אחת, הסר את ה-lamina עם הפינצטה השנייה. היא אמורה להיפרד כיחידה אחת, ובכך לחשוף את גופי התאים שמתחתיה. הקפד לתפוס רק את ה-lamina; אחרת, קיים סיכון לניתוק גופי התאים מהרשתית.באמצעות פיפט P 20, העבירו את העיניים ל-400 microliters של PBS Triton במבחנה של 500 microliter. נענעו אותן בעדינות בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך הלילה כדי להסיר את הפיגמנט האדום האוטופלורסצנטי מהפוטורצפטורים. למחרת, ניתן להשליך את תמיסת השטיפה ולהוסיף נוגדן ראשוני לצורך דימוי חי של עיניים בוגרות ללא הלמינה.אנו משתמשים אך ורק בזבובים בוגרים, שהם בשלב מאוחר של בופות זמן קצר לפני הבקיעה. בשלב זה, גופי התאים של הפוטורספטורים נפרדים מהטרמינלים בלאמינה במהלך הדיסקציה. בבופות בוגרות ניתן להבחין בכנפיים, עיניים וקוטיקולה מוגדרים היטב דרך מעטפת הבופה.בחר בבובנאי והטבל אותו ב-HL three. הסר את החלק הקדמי של מעטפת הבובנאי כדי לחשוף את אזור הראש. הסר בזהירות את הקרום הפנימי הדק העוטף בנוסף את הזבוב המתפתח.תפסו את בסיס הראש באמצעות הפורספס ומשכו. השליכו את שאר הגולם תוך שמירה על הראש טבול. המשיכו כפי שמתואר בניתוח העין עבור אימונוהיסטוכימיה בשלב הבוגר של ה-fer rate.עם זאת, גופי התאים של הפטורצפטורים יdetached בקלות רבה יותר מהלמינה (lamina), מה שיאפשר לכם לדמות את גופי התאים השקועים ברשתית. כמו כן, הלמינה נשארת מחוברת לאונה האופטית (optic lobe), מה שמאפשר לדמות את הלמינה הדיסטלית. אם ברצונכם לדמות את הלמינה הפרוקסימלית, שבה ניתן לראות את הקרטדג'ים (cartridges) של קצות הפטורצפטורים, בצעו את דיסקציית העין בזבוב בוגר, שבו הלמינה מחוברת בעוצמה רבה יותר לעין.דיסקיות העין המתפתחות בשלב של 20% מפיתוח הפופה הפכו לאתר מועדף לדימיון חי במעבדתנו. זאת מכיוון ששכבה בודדת זו של תאים מתפתחים וגדולים יחסית ניתנת לצפייה בקלות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כדי לבחור פופה בשלב של 20%, חפשו את צינורות ה-Ian, כתם ירוק המופיע מתחת למעטפת הפופה, והימנעו מפופות בעלות גוף כהה, אשר נוצר לאחר שלב של 20% מפיתוח הפופה.לאחר בחירת בובת, טבל אותה ב-HL three בצלחת הדיסקציה והסר בזהירות חלק קדמי של מעטפת הבובה. היזהר שלא לחדור דרך הממברנה הפנימית הדקה. אחז בממברנה הפנימית באמצעות הפינצטה ומשוך אותה לצדדים.חפש בקפידה בתוך התוכן שהופרש כדי למצוא את המוח המתפתח ואת דיסקיות העין, שהם בולטים למדי. בודד את המוח בתחתית כלי הניתוח. הפר בעדינות את המוח המרכזי מהאונה האופטית.קומפלקס ה-optic lobe I disc ישמש לצילום חי (Live imaging). אם ברצונכם לבצע צילום למשך פרק זמן קצר רק באחד או שניים תמיסות, תוכלו לצלם את הרקמה על גבי למסת זכוכית. במקרה זה, הכינו את הלמסת על ידי ציפוי ראשוני של פני השטח ב-syl guard בהתאם להוראות היצרן.העבירו 20 µL של HL three למרכז הזכוכית. העבירו את הרקמה המבודדת לתוך הזכוכית בתוך 20 µL נוספים של HL three. אין לחשוף את הרקמה לאוויר בשום שלב.בנוסף, יש להימנע מכל מאמץ או עומס הנובעים מטיפול בפיפט. עבור דימוי חי, יש לקבע את הרקמה בצורה יציבה. השג אלקטרודה מזכוכית, כדוגמת אלו המיוצרות עבור רישומים אלקטרופיזיולוגיים.שברו את הקצה ומלאו את הפיה בדבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שיוצר הפה; שברו רק חלק קטן מהאלקטרודה כך שהדבק יוכל להיכנס. כעת, השתמשו בלחץ חיובי כדי למרוח כמות קטנה של דבק על מגן הסף תחת טיפה של HL three. כעת, הניחו במהירות את הרקמה על הדבק, תוך שמירה על הכיוון הרצוי לצורך הדמיה חיה.כעת ניתן להשתמש בעדשת טבילה במים לצורך הדמיה. אם ברצונכם להוסיף צבע חודר ממברנה, ניתן להוסיפו לאמבט. לצורך הדמיה לאורך פרקי זמן ממושכים, או כדי להחליף תמיסות באופן מלא או מספר פעמים, אנו משתמשים בתא פרפוזיה המחובר למשאבה פריסטלטית המזרימה לאט תמיסת תרבית על הרקמה החיה.השתמשו בלוחית כיסוי מצופה בטיפה של syl guard שגולפה כדי להפוך אותה לדקה ושטוחה. טפטפו 20 µL של HL three למרכז לוחית הכיסוי. החליקו והדביקו את הרקמה החיה אל ה-sill guard.ייצרו אטם שיאפשר לבועות לעבור דרך התא מבלי לחשוף את הרקמה החיה לאוויר. האטם צריך להיות עבה מספיק כדי למנוע מעיכה של הרקמה, אך דק מספיק כדי לקרב את הרקמה לעדשת המיקרוסקופ הקונפוקלי. הרכיבו את תא הפרפוזיה תוך הקפדה שהרקמה תישאר טבולה לחלוטין בכל עת.לפיכך, ניתן לבצע החלפות תמיסה בקצבים של עד 100 µL לדקה. לצורך דימות בטווח של שעות, ייתכן שתצטרכו להוסיף 20 hydroxy Dyson ואנטיביוטיקה, אך לא תרופה אנטי-פטרייתית, ולבצע פרפוזיה במהירויות נמוכות בהרבה, בסביבות 10 µL לדקה. כמו כן, אנו מבעבעים חמצן לתוך תוצר התרבית המזין את המשאבה הפריסטלטית.כעת רכשתם את כל המיומנויות הדרושות לביצוע נתיחה מוצלחת של המוח והרשתית של ה-drosophila. בנוסף, באפשרותכם לבצע דימיון של דיסקיות עין מתפתחות בחי או של פוטורצפטורים בבוגרים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

סרטון זה מתאר שיטה להרכבת מוחות שלמים מזבובים בוגרים מתחת למגלשת גשר ומציג את הפרוטוקול המבוצע על מוחות מוכתמים חיסונית עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הרכבת מוחות דרוזופילה בוגרים: שיטה להכנת שקופיות לדימות קונפוקלי

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מתאר שלושה שלבים להכנת אונות אופטיות דרוזופילה בוגרות של זחלים ובוגרים להדמיה: 1) דיסקציות מוחיות, 2) אימונוהיסטוכימיה ו-3) הרכבה. דגש מושם על שלב 3, שכן נדרשים כיווני הרכבה ברורים כדי לדמיין מבנים ספציפיים של האונה האופטית.

דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

אנו מציגים שיטה המותאמת במיוחד כדי לדמות את המוח כולו של Drosophila הבוגר במהלך ההתנהגות בתגובה לגירויים. הראש ממוקם כדי לאפשר גישה אופטית לכל המוח, בעוד הזבוב יכול להזיז את רגליו ואת האנטנות, את קצה הפרובוסיס, והעיניים יכולות לקבל גירויים חושיים.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

למד הכנת מוח ורשתית של Drosophila לצילום חי ואימונוהיסטוכימיה. הפרוטוקול מדגים ניתוחי מוח בוגר, רשתית ודיסק עין מתפתח לחקר תאי קולטני אור.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

גלה סרטונים נוספים