Name: יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: חקור מורפולוגיות של תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם בדרוזופילה באמצעות שיטת MCFO המבוססת על Gal4/UAS. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של רקמות מורכבות בכל שלב התפתחותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה ארנים Jenett Aljoscha Nern, חברים אחרים של המעבדה רובין לקבלת ייעוץ ושיתוף של ריאגנטים שלא פורסמו, Janelia לטוס אור צוות הפרוייקט ליצירת תמונות קונפוקלי. המחברים גם תודה חברי המעבדה גאליה להערות על כתב היד.

1-הכנת זבובים לניסויים ססגוניות FlpOut (MCFO) הערה: MCFO הטכניקה מתייחס גירסה שונה של קלטת בתיווך Flp עצור שנקרא הכריתה (FlpOut). זבובים MCFO הטרנסגניים לשאת מקדם הלם חום (hsp)-Flp recombinase ובקרת כתבים שונים תחת UAS. כל עיתונאי מורכב שדרה משותף של myristoylated (myr) ירוק סופר תיקיה פלורסנט חלבון (sfGFP), בעוד איזה 10 עותקים של תג epitope (למשל., HA, דגל או V5) נוספו. החלבונים הלא-פלורסנט וכתוצאה מכך נקראים &#34; מפלצת הספגטי GFPs &#34; (smGFPs) 14, ניתן להבחין באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד התגים השונים epitope.
<ol><li>קרוס טס עם הקלטת MCFO, את hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) לקווי המתאים גליה GAL4 מנהל ההתקן (ראה טבלה של חומרים) .
	<ol><li>Hsp פעיל כבר 25 ° c, כמה תאים עשוי לעבור רקומבינציה המוביל תיוג לא ספציפי, להגדיר חוצה ב 18 ° C כדי להימנע leakiness של המערכת. המתן כ- 20 ימים ב 18 ° C כדי להשיג את הדור F1. לאחר החום לחשמל (ראה שלב 2), לשמור על זבובים 25 ° c ( איור 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. מחממים הלם הערה: בהתאם הכניסה לאתר, היעילות של hsp-Flp עשויים להיות שונים; לכן, הזמן הלם חום אופטימלי חייב להיות מותאם. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש MCFO מניה לטוס בו הוכנס hsp-Flp על כרומוזום ה-X (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>העברה הוא צאצא של הצלב בשלב 1.1 (F1 דור זבובים, בן 3-4 ימים) לתוך חדש מבחנות שמכילות אוכל וחימום לזעזע אותם ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. 
	הערה: זבובים צעירים (בן 1-2 ימים) רגישים מאוד הלם חום. לחכות 1 או 2 ימים לפני ביצוע ההלם חום על מנת להפחית את שיעור התמותה הנגרמת על ידי הטיפול. שימוש של הדור F1 זבובים כפקד, ללא זעזועים חום.</li>
	<li>במהלך הלם חום, לשמור על זבובים בקבוקונים נורמלי עם אוכל על מנת להקטין את שיעור התמותה מפגינות. להכניס נקבות וזכרים נפרד בקבוקונים.</li>
	<li>הקפידו לטבול את המבחנה כולו במים כדי להבטיח הלם חום הומוגניות. השתמש הלם 5-8 דקות כנקודת התחלה מתאימים עבור תיוג דלילה של עכשיו, דונלד תאים עם קווים רבים של הנהג GAL4; משך הלם חייב להיות אופטימיזציה עבור כל מנהל התקן וניסוי (ארוכה או קצרה יותר חום הלם פעמים עשוי להיות נחוץ).</li>
	<li>לאחר הלם חום, להניח את הבקבוקונים אופקית על הספסל לכמה דקות כדי לאפשר את הזבובים להתאושש מההלם חום. 
	הערה: אין צורך לשנות את הבקבוקונים.</li>
	<li>לשמור על הזבובים 25 ° c ומנתחים (ראה שלב 3 ו- 4) אותם ימים 2 או יותר לאחר ההלם חום לביטוי כתב אופטימלית.</li>
</ol> 3. ניתוח והכנה פתרונות <ol><li>היום של הקרע, להכין פתרון מקבע טריים ב 200 µL המבחנות על ידי ערבוב µL 180 S2 תא תרבות בינוני עם 20 µL של 20% paraformaldehyde (PFA) כדי להשיג פתרון מחברים 2%. לשמור על הפתרון מקבע על הקרח לפני ובמהלך את הקרע. 
	התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות. 
	הערה: מערבבים µL 160 S2 תא תרבות בינוני עם 40 µL של 20% paraformaldehyde (PFA) בצינור PCR 200 µL כדי להכין פתרון PFA 4% במקום פתרון 2%-</li>
	<li>להשתמש שפופרת אחת PCR לכל גנוטיפ עם מקסימום של 8-10 המוח למחזור לקבלת תוצאות מיטביות, מכתימים.</li>
	<li>להכין המוח למבוגרים שטיפה פתרון: 0.5% אלבומין שור, 0.5% X-100 Triton ב- PBS. 
	הערה: בהתאם ההכתמה, פתרון המכיל 1% טריטון X-100 עשוי להיות נחוץ. ריכוז גבוה יותר של טריטון X-100 מגביר את החדירה של הנוגדן לתוך הרקמה, זה הכרחי לאזורים הכתם שקר עמוק בתוך הרקמה (למשל, סינפטית אזורים במוח דרוזופילה למבוגרים).</li>
	<li>להכין את הפתרון חסימה: סרום עז רגיל 3% 3% חמור נורמלית בסרום, 0.5% X-100 Triton ב- PBS.</li>
	<li>המוח למבוגרים שטיפה פתרון והפתרון חסימה שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.</li>
	<li>לשים צלחת זכוכית בארות דיכאון עמוק על הקרח ומלא כל טוב עם הפתרונות הבאים: אחד עם 70% אתנול, אחד עם PBS, ואחד S2 תא תרבות בינונית.</li>
</ol> 4. ניתוח מוחי למבוגרים <ol><li>מקם 3 ס לנתח מאכל על הבמה של stereomicroscope ולמלא אותו קר S2 תא תרבות בינוני. לנהל את כל והניתוחים במדיום הזה כדי להבטיח הרקמה יישאר בריא במהלך ההליך לנתיחה. 
	הערה: תבשיל ויבתר רצוף מספר מילימטרים של סיליקון שחור אשר מספקת קונטרסט רקע טובה (בתמונות) ושימוש לשמר את המלקחיים בזמן.</li>
	<li>עזים ומתנגד הזבובים של גנוטיפ הרצוי עם CO 2.</li>
	<li>עם מלקחיים, לתפוס הזבוב על ידי הכנפיים, לשטוף אותה אתנול 70% קר ב-30 s, ואז עם PBS קר ב-30 נוספים ס</li>
	<li>להעביר לטוס לתוך טוב הדיכאון העמוק הממולא S2 תא תרבות בינונית.</li>
	<li>חוזר את ההליך עבור כל הזבובים של גנוטיפ באותה ולתחזק אותם קר S2 תא תרבות בינוני עד לנתיחה, אשר תשמר את הרקמה. 
	הערה: עזים ומתנגד רק המספר של זבובים יכולים ניסויים תוך פרק זמן של-30 דקות זמן דגירה פעמים ב S2 תא תרבות בינוני עלול לגרום נזק לרקמת.</li>
	<li>לתפוס הזבוב עם מלקחיים ויציפו, תחת stereomicroscope, הזבוב במדיום תרבות של S2 תא.</li>
	<li>לנתק את הראש משאר חלקי הגוף. למחוק את הגוף ולשמור את הראש מתחת למים S2 תא תרבות בינוני. . זה מאוד חשוב לי להחזיק את הראש עם מלקחיים לכל משך הקרע. אם הראש מתחיל לצוף, זה יהיה קשה להחזיר אותו ללא פגיעה הרקמה.</li>
	<li>מתחילים את הקרע על-ידי הוצאת עין אחת, בעוד אתה מחזיק את הראש עם מלקחיים אחד לפחות בכל עת. ודא כי הקצה של המלקחיים הוא מתחת הרשתית כדי למנוע פגיעה הרקמה שמתחת. למשוך את העין השנייה, מתחילים להסיר את הקוטיקולה להופעת המוח.</li>
	<li>להסיר כל רקמות והכו אותי ואת לציפורן סביב המוח עד הרקמה נראה נקי. הקפד להסיר את כל הרקמה והכו אותי סביב המוח לקבלת תוצאות מיטביות, צביעת; הרקמות. אתה מוכן להיות קבוע, מוכתם.</li>
	<li>לשמור על כל המוחות ביתור תוך קר S2 תא תרבות בינוני לפני העברת אותם לתוך הפתרון מחברים כדי זמן השלב קיבעון.</li>
</ol> 5. צביעת המוח למבוגרים < ol> <li>להעביר את המוח מבודדים עם פיפטה P10 הפתרון PFA בטמפרטורת החדר (RT). כדי למנוע נזק לרקמות, אף פעם לא להשתמש מלקחיים להעברת המוח לאחר הקרע. לבצע את כל השלבים ב 200 המבחנות µL על nutator.</li>
	<li>עבור כל השלבים, לפני מחיקת הפתרון הישן עם פיפטה P200, לאפשר את השכל להתיישב על החלק התחתון של הצינור. לנסות להסיר את תגובת שיקוע ללא כ רפה בעברית הרקמה. להגן על הרקמה מפני חשיפה קלה.</li>
	<li>לתקן את המוח µL 200% 2 מחברים ב S2 תא תרבות בינוני לשעה או ב- 4% PFA במשך 30 דקות. לשמור על קיבוע פעמים זהים בין דוגמאות על מנת להגדיל הפארמצבטית.</li>
	<li>לאחר 3 (או יותר) שוטף של 15 דקות כל אחד ב- 200 µL של המוח למבוגרים שטיפה פתרון, לחסום את הרקמות עם 200 µL של חסימת פתרון במשך 30 דקות. זמן הדגירה פעמים בחסימה פתרון אפשריות.</li>
	<li>Incubate השכל לילה ב 4 ° C עם נוגדנים העיקרי מדולל במוח למבוגרים שטיפה פתרון בהנפח הכולל של 200 µL. 
	הערה: טיימס הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הנוגדן בשימוש. Incubations עוד עשוי להיות נחוץ.
	<ol><li>עבור תיוג שלושה סמנים MCFO, דגירה את השכל עם אנטי-HA (שבערך), אנטי-דגל (DYKDDDDK epitope) (1: 100), ואת ראשי נוגדנים anti-V5.</li>
		<li>ראשי ישירות-מצומדת נוגדנים יכול לשמש במקום השילוב הרגיל ראשי + המשני (למשל., אנטי-549 V5:DyLight (1:200)). במקרה זה, לטפל את הנוגדנים ישירות-מצומדת נוגדנים משניים. 
		הערה: עבור כל גנוטיפ, שמור קצת שכל כפקדי כדי לוודא יחודיות של צביעה. לדלג הדגירה נוגדן ראשוני ולעבור ישירות אל השלב הבא.</li>
	</ol></li> <li>לרחוץ את רקמות 3 פעמים עבור 1 h ב 200 µL של המוח למבוגרים שטיפה פתרון (שלב 3.3), דגירה אותם עם משני fluorophore-conjugates/ראשי ישירות-מצומדת נוגדנים מדולל במוח למבוגרים שטיפה פתרון בן לילה ב-4 ° C או במשך 4 שעות ב- RT, בהנפח הכולל של 200 µL הערה: דוגמאות של נוגדנים המתאימים: 488 AlexaFluor (1:250), אנטי-549 V5:DyLight (1:200) ו- DyLight 647 (1: 100)-מצומדת נוגדנים.</li>
	<li>לשטוף את המוח 3 פעמים עבור 1 h ב- 200 µL של המוח למבוגרים שטיפה פתרון, ולאחריה שטיפה סופית ב- µL 200 ל- PBS בן לילה ב 4 ° C או 1-2 h ב- RT; השלב הסופי כביסה ב- PBS מסיר עקבות של טריטון X-100, יש צורך צביעת תוצאות אופטימליות. לטעון שכל הרכבה בינוני עם סוכן אנטי-עמעום על coverslips זכוכית דקה.</li>
</ol> 6. הרכבה של המוח עבור הדמיה <ol><li>חיתוך הדמיה מרווח לגודל המתאים באמצעות מספריים. עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כריך את מרווח הדגימה והדמיה בין שני coverslips זכוכית דקה. 
	הערה: מפרידי כלי הדמיה הם דקים (0.12 מ"מ עובי) מפרידי דבק זה קלף והדבק על השקופיות coverslips או מיקרוסקופ זכוכית, המאפשר את ההרכבה של דגימות ללא דחיסה.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להסיר דבק אניה ממשטח אחד ולהחיל את מרווח, דבק בצד למטה, על פני השטח של coverslip זכוכית (22 מ"מ x 60 מ"מ). חלות µL 10 של הרכבה בינונית coverslip זכוכית חדשה.</li>
	<li>עם P10 פיפטה, להעביר את המוח מהצינור 200 µL coverslip, ליד הירידה של הרכבה בינונית. יחד עם הרקמות, להעביר כמה PBS על מנת לשמור על המוח בפתרון.</li>
	<li>עם P10 פיפטה, להעביר את המוח מהערוץ ירידת הרכבה בינונית מנסה להגביל את כמות PBS. העבר את דגימות במדיום גובר על coverslip עם מרווח הדמיה. להשתמש במדיה הרכבה מספיק כדי לכסות את הדגימה.</li>
	<li>להסיר דבק אניה אחרים מן הצד העליון של מרווח ולהוסיף coverslip זכוכית על דגימות. עם קצה מלקחיים, חלים לחץ עדין על האזור דבק כדי לאטום. תמונה הרקמות נטענים באופן מיידי או לאחסן את השקופיות ב-20 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר.</li>
</ol> 7. תמונה רכישת <ol><li>רכוש ערימות של תמונות פלורסצנטיות קונאפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם 40 X (NA = 1.2, טבילה במי) אובייקטיבית או 63 X (NA = 1.4, שמן טבילה) המטרה (מידות פיקסלים = 1,024 x 1,024 במישור xy; המרחק בין שני מקטעים קונאפוקלית = 0.5 מיקרומטר). להתאים גלאי ורווח היסט בכל אחד מהערוצים בצורה כזאת, כי אין פיקסלים רווי ומאפסים פיקסל הם נוכח התמונות; זה מונע אובדן מידע ומבטיחה שימוש מלוא הטווח הדינמי של הגלאי. 
	הערה: מאחר הדמיה תלת-ממד זמן רב, המידות יכול להיות אוטומטי על-ידי סריקה מרובים דגימות במקביל במקומות שונים. כדי למנוע אידוי עם המטרה טבילה במים, להשתמש בשמן מיוחד טבילה בינוני עם השבירה n = 1.33.</li>
	<li>לעבד את הערימות קונאפוקלית עבור מאליהם ההקרנות, שינויי גוון ערוץ, וכוונון הבהירות, לעומת זאת באמצעות תוכנות ניתוח תמונה רגילה (ראה טבלה של חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li>
<li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+in+neuroscience%3A+Architects+in+neural+circuit+design%3A+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li>
<li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li>
<li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brain+development+and+homeostasis+by+local+and+systemic+insulin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes+Metab%22%5BJournal%5D)">Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling.</a> Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133 (3), 498-509 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interaction+in+the+insect+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interaction in the insect nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).</li>
<li>Oland, L. A., Tolbert, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+interactions+between+neurons+and+glial+cells+during+neural+development+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects.</a> Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).</li>
<li>Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interactions+through+the+Heartless+FGF+receptor+signaling+pathway+mediate+morphogenesis+of+Drosophila+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes.</a> Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).</li>
<li>Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glia in Drosophila behavior.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li>
<li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Brainbow%3A+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li>
<li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flybow%3A+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li>
<li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li>
</ol>

אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או סותר.

פרוטוקול זה מתאר שיטה נוחה ויעילה ללמוד המורפולוגיה של סוגי תאים שונים בתוך רקמה עניין ברזולוציה גבוהה. עם הטכניקה MCFO, כתבים מרובים עם תגי epitope שונים משמשים בשילוב של תיוג סטוכסטי ססגוניות (איור 2). בדומה בשיטות אחרות כגון Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO מגביר את הגיוון התווית דרך סמן coexpression, המאפשר את הפריט החזותי של תא לגבולות התא ללימודי אינטראקציה עם תא-תא. לדוגמה, עם שלושה עיתונאים, 7 ...

עכשיו, דונלד, האוכלוסייה הלא-דופאמינרגיים של מערכת העצבים (NS), זמן האמינו לספק מסגרת סטטי של נוירונים, לכן לא נחקרו בפירוט. עם זאת, אצל בני אדם, עכשיו, דונלד מהווים את הרוב המכריע של תאים שריכזה (~ 90%), מחולקים למספר קטגוריות שונות, כולל האסטרוציטים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה תאי שוואן. דרוזופילה, עכשיו, דונלד מהווים כ- 10% של תאים שריכזה. מסקרן, מורפולוגיות והפונקציות שלהם דומים להפליא אלה שנמצאו בעלי חוליות1,2. מורפולוגיות שלהם כוללים את מחסום הדם - מוח (BBB) ויוצרים epithelia, ensheathing ותאים אסטרוציט דמוי.
מערכת העצבים המרכזית (CNS) דרוזופילה מורכב המבנים העיקריים הבאים: קליפת אזורים המכילים את הגופות תאים עצביים; neuropils זה הנמל קשרים סינפטיים; ספינלי האקסון קטנים וגדולים המחברים את neuropiles שונים; העצבים ההיקפיים המחוברים אברי החישה והשרירים עם מערכת העצבים (איור 1). עכשיו, דונלד נמצאים המשויכים כל מבנים אנטומיים אלה: קליפת עכשיו, דונלד (CG) באזורים קורטיקליים, אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד (נועה) ו- ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באזורים neuropile, ensheathing עכשיו, דונלד קשורים גם עם ספינלי האקסון המרכזית, ההיקפית העצבים (EGN), ולבסוף, שני גיליון עכשיו, דונלד, עכשיו, דונלד perineurial (עמוד) subperineurial (SPG), אשר ביחד יוצרים שכבה רציפה שמכסה את NS כולו (איור 2).
מחקרים קודמים הראו כי עכשיו, דונלד תפקיד חשוב בהתפתחות NS; הם לפקח דופאמינרגיים מספרים על ידי מגיב מערכתית במחזור דמוי אינסולין הפפטידים, לספק תמיכה עם מחלות את הנוירונים, כגון המעבורת לקטט אסטרוציט-נוירון, ולחסל נוירונים גוססים על ידי phagocytosis3,4 , 5 , 6. שריכזה בוגרת, עכשיו, דונלד לשמור על BBB, תופסים נוירוטרנסמיטורים לשמור על הומאוסטזיס יוניים, לשמש התאים החיסוניים הגדולות המחלקה שכן המקרופאגים לא יכול לפרוץ BBB, לווסת את פעילות סינפטית, כמו גם התנהגות בעלי חיים6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
אם תתי סוגים שונים גליה לבצע פונקציות מיוחדות נותרת שאלה פתוחה חשוב. עם זאת, ניתוח הגנום כולו שיטתית של עכשיו, דונלד, במיוחד אצל אדם בוגר, יש כבר הקשו על ידי חוסר המתאימה לכלים שלהם מניפולציה גנטית. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת אפיון תא צורות ללמוד אינטראקציות מורכבות תא תא יעיל וקל. טכניקה זו הוחל לאפיין המורפולוגיה של גליה תתי-סוגים שונים במוח דרוזופילה למבוגרים, אבל, בהתאם הנהג GAL4 ספציפי בשימוש, זה יכול להיות מותאם ללמוד נוירונים12,13 , כל סוג של תאים בזה, באופן עקרוני כל רקמות בשלבים התפתחותיים כלשהם.

<table><tbody><tr><td>אמבט מים</td><td>מענק</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>כלי חיתוך 30 מ"מ x 12 מ"מ</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70543-30</td><td>צלחת חיתוך זכוכית</td></tr><tr><td>פיירקס 3 שקע צלחת ספוט זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>7223-34</td><td>צלחות חיתוך זכוכית</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>תוצרת בית עם פחם</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 מדיום תרבית תאים</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>רגיל סרום חמור</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ארנב HA-tag</td><td>איתות תאים</td><td>C29F4</td><td>נוגדן ראשוני, דילול 1:500</td></tr><tr><td>חולדה FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>נוגדן ראשוני, דילול 1:100</td></tr><tr><td>עכבר V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>מצומד נוגדן, דילול 1:200</td></tr><tr><td>אנטי ארנב AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>נוגדן משני, דילול 1:250</td></tr><tr><td>נגד חולדות DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>נוגדן משני, דילול 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>מרווח חותם מאובטח</td><td>גרייס ביולאבס</td><td></td><td>צור קשר עם החברה להזמנת</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22 X 60 מ"מ</td><td>מרינפלד</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22 x 22 מ"מ</td> מיקרוסקופ סטריאו <td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>שמן טבילה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, נוזל טבילה ללא הלוגן</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>למטרות טבילה במים, ללא הלוגן</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td> <td>מרכז המניות של בלומינגטון</td><td>39157</td><td>נהג GAL4</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td> <td>מרכז המניות של בלומינגטון</td><td>45914</td><td>נהג</td></tr> <tr><td>GAL4hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>פיג'י (תמונה J)</td><td></td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>Multi Time</td><td>Macro Zeiss</td><td></td><td>תוכנה לסריקה אוטומטית</td></tr></tbody></table>

יישום טכניקת flpout ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

תאים להציג מורפולוגיות שונות ויחסים האנטומי מורכב. כיצד תאים אינטראקציה עם שכניהם? האינטראקציות נבדלים בין סוגי תאים או אפילו בתוך סוג מסוים? אילו סוגים של חוקים מרחבי הם בצע? תשובות כאלה שאלות עקרוניות ויוו יש כבר הקשו עד כה על ידי חוסר כלים עבור תיוג תא בודד ברזולוציה גבוהה. . הנה, פרוטוקול מפורט היעד תאים בודדים עם טכניקה ססגוניות FlpOut (MCFO) הינו מסופק. שיטה זו מתבססת על שלושה אחרת מתויג עיתונאים (HA, דגל ו- V5) תחת שליטה UAS שנשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי חום הנוצרות על-ידי הלם Flp recombinase, אשר באופן אקראי מסירה את הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם תאים בודדים: ביטוי מתרחשת רק בתאים המבטאים גם מנהל התקן GAL4. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים של סוג תא נתון המאפשר את החזיית תא בודד מורפולוגיות ברזולוציה גבוהה. כדוגמה, הטכניקה MCFO יכול להיות משולב עם נהגים GAL4 גליה ספציפיים כדי להמחיש את מורפולוגיות מסוגי המשנה גליה שונים במוח דרוזופילה למבוגרים.

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות ניתן להשיג באמצעות הטכניקה MCFO במוח דרוזופילה למבוגרים. איור 3 מראה סכימטי של השיטה. שלושה אחרת מתויג ממברנה עיתונאים (myr-smGFP-אה, myr-smGFP-דגל ו myr-smGFP-V5) תחת שליטה UAS נשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי של Flp recombinase המסירה באופן אקראי הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם בתאים בודדים. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים מסוג ...

התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.

יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא לדמיין מורפולוגיות של תאים בודדים ברקמות אנטומיות מורכבות, ובכך לפשט את חקר האינטראקציה בין תאים ב-Drosophila. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בנוגע למורפולוגיות מורכבות ואינטראקציות בין תאים באמצעות זבוב הפירות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה לחקר מורפולוגיות של תאים בודדים בכל רקמה ובכל שלב התפתחותי.את הפרוצדורה תדגים Anja Kieser, טכנאית במעבדה שלנו. טכניקת ה-MCFO משנה את טכניקת ה-FlpOut הסטנדרטית באופן הבא. רקומבינז FLP המופעל על ידי הלם תרמי ודיווחים (reporters) שונים נשארים תחת בקרת UAS, אולם לכל דיווח יש שלד (backbone) משותף של superfolder GFP מירסטוילציה (myristoylated), שבו הוכנסו עותקים של תג אפיתופ (epitope tag).החלבונים הבלתי-פלואורסצנטיים שנוצרו נקראים spaghetti monster GFPs ומזוהים באמצעות נוגדנים. בהתאם למספר החיתוכים, באה לידי ביטוי שילוב שונה של אפיתופים. מכיוון שהפרומוטור HSP פעיל מעט ב-25 °C, יש לבצע את ההכלאות ב-18 °C, שם הוא אינו פעיל כלל.לאחר מכן, המתינו כ-20 ימים לקבלת דור ה-F1. מיינו את נקבות וזכרי ה-F1 למבחנות נפרדות. כדי להעביREM אותם הלם תרמי, העבירו אותם תחילה למבחנות עם מזון טרי כאשר הם בני שלושה עד ארבעה ימים.זבובים צעירים עשויים להיות עדינים מדי עבור הלם חום. בשלב הבא, העבירו את המבחנות לאמבט מים בטמפרטורה של 37 °C. טבלו אותן לעומק כדי להבטיח הלם חום הומוגני.עבור סימון דליל של תאי גליה, התחילו בחמש עד שמונה דקות של הלם חום ולאחר מכן בצעו אופטימיזציה. זמן הלם החום האופטימלי יסמן באופן דליל את תאי המטרה, והקשר זה תלוי בדרייבר ה-GAL4 הספציפי שבשימוש. לאחר הלם החום, הניחו את המבחנות באופן אופקי על המשטח למשך מספר דקות כדי לצנן אותן.כעת, התחילו בתחזוקת הזבובים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius באותם מבחנות. לאחר יומיים, ביטוי הרפורטר יהיה אופטימלי וניתן יהיה לבצע דיסקציה לזבובים. כהכנה, הניחו שלושה בארי עם שקע עמוק (deep depression wells) על קרח.מלאו באבור (well) אחד ethanol 70%, באבור שני PBS ובשלישי מצע גידול לתאי S2. לאחר מכן, מלאו צלחת ניתוח בגודל שלושה סנטימטרים המרופדת בסיליקון שחור ב-S2 קר. בצעו את כל פעולות הניתוח ב-S2 כדי לשמור על בריאות הרקמות. כעת, הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני.לאחר מכן, באמצעות פינצטה או נוצה, העבירו את הזבובים ל-70% ethanol קר למשך כ-30 שניות, לאחר מכן ל-PBS קר למשך כ-30 שניות, ואז העבירו אותם ל-S2 קר. כך יש לשטוף את כל הזבובים המיועדים לדיסקציה. בדרך כלל מספיקים עד 10 זבובים מגינוטיפ אחד. כעת, בתוך 30 דקות, בצעו דיסקציה והוציאו את כל המוחות.ראשית, הפרד את הראש משאר הגוף והשלך את הגוף. החזק את הראש ביד הפנויה לאורך כל תהליך הנתיחה, שכן יהיה קשה מאוד להשיג עליו אחיזה מחדש. לאחר מכן, שלוף עין אחת על ידי אחיזה ברקמה ממש מתחת לרשתית.לאחר מכן, הסירו את העין השנייה ובכך חשפו את המוח והרקמות שסביבו. בשלב הבא, הסירו את כל רקמת הטרכיאה ואת הקוטיקולה שנותרה מסביב למוח, עד שרקמת המוח תיראה נקייה. יש להסיר את כל רקמת הטרכיאה כדי להשיג תוצאות צביעה אופטימליות.זהו כל מה שנדרש כדי להכין את המוח לקיבוע. המשיכו בהשגת כל המוחות, תוך שמירה על המוחות המבודדים ב-S2 קר. מומלץ להכין עד 10 מוחות לכל מבחנה של מיקרוצנטריפוגה לצורך צביעה אופטימלית. העבירו את המוחות המבודדים באמצעות טיפ של פיפט P10 למבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 200 µL המכילה תמיסת קיבוע.אין לטפל במוחות באמצעות פינצטה. יש להדגיר את הרקמות תוך הגנה מאור. יש להימנע משאיבת המוחות במהלך העברת תמיסות.כדי להסיר את מקבע הרקמה, בצעו שלושה שטיפות או יותר של 15 דקות עם תמיסת שטיפה. לאחר מכן, חסמו את הרקמות באמצעות תמיסת חסימה למשך 30 דקות או יותר. לאחר מכן, החליפו את תמיסת החסימה בנוגדנים ראשוניים המדוללים בתמיסת שטיפה, והדגירו את המוחות למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.להסרת הנוגדנים הראשוניים, בצעו שלושה שלבי שטיפה של שעה אחת כל אחד בתמיסת שטיפה. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים משניים המשורשריים לפלואורופור בתמיסת שטיפה והדגירו את המוחות למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס או למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף לחלוטין את הנוגדנים שאינם קשורים, בצעו שלושה שלבי שטיפה של שעה אחת כל אחד בתמיסת שטיפה, ולאחריהם שטיפה ממושכת יותר ב-PBS.לאחר מכן בצעו קיבוע (mounting) של המוחות. הכינו שתי זכוכיות כיסוי עם מרווח דמיון (imagining spacer). מרחו 10 µL של תמיסת קיבוע עם חומר למניעת דהייה (anti-fade agent) בתוך המרווח ועל זכוכית הכיסוי הנוספת.בשלב הבא, בעזרת פיפט P10, העבירו את המוחות ללוחית כיסוי, והניחו אותם לצד התווך יחד עם מעט PBS. אין לאפשר לרקמה להתייבש. כעת, העבירו בזהירות את המוחות אל תוך תוך הקיבוע באמצעות הפיפט, ובסוף העבירו אותם אל התווך שבתוך המרחק (spacer) וסדרו אותם בעזרת פינצטה.לאחר מכן, הסירו את שכבת ההדבקה מהמרווחים וחברו זכוכית כיסוי. הצמידו את זכוכית הכיסוי בלחיצה קלה באמצעות פינצטה והמשיכו מיד לדימות, או שמרו את השקופיות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצורך ניתוח מאוחר יותר. באמצעות השיטות שתוארו, שלושה דגישנים (reporters) שונים המסומנים בממברנה נשמרים במצב שקט על ידי טרמינטורים של שעתוק המוקפים על ידי אתרי FRT.כאשר החיות עברו הלם תרמי, ה Rekombinase FLP התבטא והסיר באופן אקראי את הטרמינטורים, מה שהוביל לביטוי של שילובים שונים של רפורטרים. באופן כללי, השילובים השונים של הרפורטרים מספקים שבעה צבעים שונים, ובכך ניתן להדמיות וללמוד באופן פרטני מורפולוגיות שונות של תאים בודדים. זמני הלם תרמי שונים נבחנו עם EG-GAL4 ו-ALG-GAL4.סימון התאים הבודדים נחקר באזור האונה האנטנלית (antennal lobe) של המוח. הדרייבר EG-GAL4 התבטא בתאי גליה עוטפים (ensheathing glial cells), שכולם עטפו את פני השטח של האונה האנטנלית. לשם השוואה, גליה דמוית-אסטרוציט (astrocyte-like glia) שסומנה על ידי ALG-GAL4, כיסתה בעיקר אזורים שאינם חופפים באונה האנטנלית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן סימונם של תאים בודדים בתמיסה. זאת על מנת להבין את הקשרים האנטומיים והמורכבים שלהם באמצעות Drosophila, ובדרך כלל בכל אורגניזם מודל שבו ניתן ליישם את המערכת הבינארית GAL4 UIS. בעת ביצוע פעולה זו בפעם הראשונה, חשוב לזכור תחילה לבצע אופטימיזציה לזמן ההלם התרמי ולעקוב ככל האפשר אחר השלבים הבודדים של פרוטוקול הצביעה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של מוח דרוזופילה טרנסגני להדמיה חד-תאית של תאי גליה. המוח מבטא חלבונים ממוקדי ממברנה המאוחים עם שילובים שונים של אפיטופים אנטיגניים תחת שליטת מערכת רקומבינאז ספציפית לגליה. המוחות המבודדים והקבועים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים לאפיטופים האנטיגניים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. תיוג זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של תת-אוכלוסיות שונות של תאי גליה על פני אזורי מוח שונים.

צביעה אימונופלואורסצנטית של מוחות דרוזופילה להדמיה חד-תאית של תאי גליה

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

חקור מורפולוגיות של תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם בדרוזופילה באמצעות שיטת MCFO המבוססת על Gal4/UAS. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של רקמות מורכבות בכל שלב התפתחותי.

יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים