יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לדמיין מורפולוגיות של תאים בודדים ברקמות אנטומיות מורכבות, ובכך לפשט את חקר האינטראקציה בין תאים בדרוזופילה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי מורפולוגיות מורכבות ואינטראקציות בין תאים באמצעות זבוב הפירות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים אותה לחקר מורפולוגיות של תאים בודדים בכל רקמה ובכל שלב התפתחותי.

תדגים את ההליך אניה קיזר, טכנאית במעבדה שלנו. טכניקת MCFO משנה את טכניקת FlpOut הסטנדרטית באופן הבא. רקומבינאז FLP של הלם חום ומדווחים שונים נשארים בשליטת מל"טים, עם זאת, לכל מדווח יש עמוד שדרה משותף של תיקיית על GFP מיריסטוילית, שבה הוכנסו עותקים של תג אפיטופ.

החלבונים הלא-פלואורסצנטיים המתקבלים נקראים GFPs מפלצת ספגטי ומזוהים עם נוגדנים. בהתאם למספר הכריתות, מתבטא שילוב שונה של אפיטופים. מכיוון שמקדם ה-HSP פעיל מעט ב-25 מעלות צלזיוס, הגדר צלבים ב-18 מעלות צלזיוס היכן שהוא באמת לא פעיל.

לאחר מכן, המתן כ-20 יום כדי להשיג את דור ה-F1. מיין את הנקבות והזכרים F1 לבקבוקונים נפרדים. כדי לחשמל אותם בחום, העבירו אותם תחילה לבקבוקוני מזון טריים כשהם בני שלושה עד ארבעה ימים.

זבובים צעירים יכולים להיות עדינים מדי להלם חום. לאחר מכן, העבירו את הבקבוקונים לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. טבלו אותם עמוק כדי להבטיח הלם חום הומוגני.

לתיוג דליל של תאי גליה, התחל עם חמש עד שמונה דקות של הלם חום ולאחר מכן מטב. זמן הלם החום האופטימלי יסמן בדלילות את תאי המטרה והקשר שלו תלוי במנהל ההתקן הספציפי של GAL4 בשימוש. לאחר הלם החום, הניחו את הבקבוקונים בצורה אופקית על הספסל למשך מספר דקות כדי לקרר אותם.

כעת, התחילו לשמור על הזבובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס באותם בקבוקונים. לאחר יומיים, ביטוי הכתב יהיה אופטימלי וניתן לנתח את הזבובים. כהכנה, הניחו שלוש בארות שקע עמוקות על קרח.

מלאו באר אחת באתנול 70%, אחת ב-PBS ואחת במדיום תרבית תאים S2. לאחר מכן, טען צלחת ניתוח של שלושה סנטימטרים מרופדת בסיליקון שחור עם S2 קר. בצע את כל הנתיחות ב-S2 כדי לשמור על בריאות הרקמות. כעת, הרדימו את הזבובים בפחמן דו חמצני.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים או נוצה, הכניסו את הזבובים לאתנול קר של 70% למשך כ-30 שניות ולאחר מכן PBS קר למשך כ-30 שניות ואז העבירו אותם ל-S2 קר. לפיכך, שטפו את כל הזבובים שיש לנתח. עד 10 זבובים מגנוטיפ אחד מספיקים בדרך כלל. כעת, תוך 30 דקות, נתחו את כל המוחות.

ראשית, נתק את הראש משאר הגוף והשליך את הגוף. שמור את הראש מוחזק ביד כבויה לאורך כל הדיסקציה או שיהיה קשה מאוד להחזיר את האחיזה בו. לאחר מכן, משוך עין אחת על ידי אחיזת הרקמה רק מתחת לרשתית.

לאחר מכן משוך את העין השנייה ובכך חשוף את המוח והרקמות שמסביב. לאחר מכן, הסירו את כל רקמת קנה הנשימה ואת הקוטיקולה שנותרה סביב המוח, עד שרקמת המוח נראית נקייה. יש להסיר את כל רקמת קנה הנשימה לקבלת תוצאות צביעה מיטביות.

זה כל מה שצריך כדי להכין את המוח לקיבוע. המשיכו לנתח את כל המוחות, תוך שמירה על המוחות המנותחים ב-S2 קר. נסה להכין עד 10 מוחות לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה לצביעה אופטימלית. העבירו את המוחות המבודדים באמצעות קצה פיפטה P10 לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר עם תמיסה מקבעת.

לעולם אל תטפל במוח באמצעות מלקחיים. דגירה על הרקמות המוגנות מפני אור. הימנע משאיבת המוח במהלך העברת תמיסות.

כדי להסיר את הקיבוע, השתמש בשלוש כביסות או יותר של 15 דקות עם תמיסת כביסה. לאחר מכן חסום את הרקמות בתמיסת חסימה למשך 30 דקות או יותר. לאחר מכן, החליפו את תמיסת החסימה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת שטיפה ודגרו על המוח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

כדי להסיר את הנוגדנים העיקריים, השתמש בשלוש שטיפות של שעה בתמיסת כביסה. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים מצומדים פלואורופור משניים בתמיסת שטיפה ודגרו על המוח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף לחלוטין את הנוגדנים הלא קשורים, השתמש בשלוש שטיפות של שעה בתמיסת כביסה ולאחר מכן שטיפה ארוכה יותר עם PBS.

ואז עלו על המוח. הכן שני פתקי כיסוי עם מרווח דמיוני. במרווח ובהחלקת הכיסוי הנוספת, יש למרוח 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם חומר נגד דהייה.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה P10, העבירו את המוח להחלקת הכיסוי, והניחו אותם ליד המדיום יחד עם כמה PBS. אל תתנו לרקמה להתייבש. כעת, העבירו בזהירות את המוחות למדיום ההרכבה באמצעות הפיפטה ולבסוף העבירו אותם למדיום במרווח וסדרו אותם בעזרת מלקחיים.

לאחר מכן, הסר את תוחם הדבק על המרווחים והצמד פתק כיסוי. אבטח את החלקת הכיסוי במעט לחץ באמצעות מלקחיים והמשך מיד בהדמיה או אחסן את השקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר. באמצעות השיטות המתוארות, שלושה מדווחים שונים עם תיוג ממברנה מושתקים על ידי סיומות שעתוק המוקפות באתרי FRT.

כאשר החיות קיבלו הלם חום, ה-FLP רקומבינאז התבטא והסיר באופן אקראי את הטרמינטורים, מה שהוביל לביטוי של שילובים שונים של מדווחים. בסך הכל, שילובי המדווחים השונים מספקים שבעה צבעים שונים, ולכן ניתן לדמיין ולחקור מורפולוגיות מרובות של תא בודד בנפרד. זמני הלם חום שונים נבדקו עם EG-GAL4 ו-ALG-GAL4.

תיוג התא הבודד נותח באזור אונת האנטנה של המוח. דוחף ה-EG-GAL4 התבטא במעטפת תאי גליה שכולם עטופים על פני אונת האנטנה. לשם השוואה, גליה דמוית אסטרוציטים המכוונת על ידי ALG-GAL4, כיסתה בעיקר אזורים לא חופפים של אונת האנטנה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג תאים בודדים בתמיסה. על מנת להבין את היחסים המורכבים והאנטומיים שלהם באמצעות דרוזופילה ובאופן עקרוני ובאורגניזם מודל בו ניתן ליישם את המערכת הבינארית GAL4 UIS. בעת ניסיון הליך זה בפעם הראשונה, חשוב לזכור תחילה לייעל את זמן הלם החום ולבצע ככל האפשר את השלבים הבודדים של פרוטוקול הצביעה על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר.