הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשתיל פיגומים נושאי תאים אנושיים בעכברים כדי ליצור נישות מח עצם אנושיות ולאחר מכן לדמיין בשידור חי את התנהגות התאים האנושיים בתוך השתלים. שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההמטופויאטי האנושי מכיוון שהיא מאפשרת לשחזר ולחיות תמונה ברזולוציה של תא בודד מרכיבים שונים של מח העצם. הרבגוניות של מערכת זו היא אחד היתרונות העיקריים שלה, שכן היא מאפשרת השתלה של רכיבי נישה שונים בזה אחר זה או בשילוב.

מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת בתחומי מחקר אחרים, כמו גרורות גידול או מחקרי סינון תרופות. בעזרת הטכניקה הסטרילית המתאימה, התחל בחיתוך ספוג ג'לטין מעוקר ל -24 חתיכות בגודל דומה. הרכיבו מחדש את פיגומי הג'לטין על ידי טבילה באתנול ולאחר מכן ב-PBS.

לאחר מכן טפחו בעדינות כל פיגום על רקמה סטרילית כדי להסיר את עודפי הנוזלים, והעבירו את הפיגומים לבארות בודדות של צלחת 24 בארות נמוכה במיוחד. בעזרת מזרק אינסולין, הזרקו בזהירות פעם אחת 10 עד החמישית עד אחת כפול 10 עד תאי הסטרומה השישית ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל פיגום, והניחו את הצלחת בחממת תרבית תאים. בעת הזרקת התאים לפיגום, ודא שאין דליפה החוצה מהפיגום.

לאחר שעה, מלאו כל באר בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאים טרי, והחזירו את הפיגומים לחממה. לאחר 24 שעות, יש להזריק פעם אחת 10 לתאים ההמטופויאטיים החמישיים לתוך הפיגומים, ולאחר מכן דגירה והוספת מדיה נוספת, ודגירה של 24 שעות כפי שהודגם זה עתה. ליצירת חלבון מורפוגנטי רקומביננטי של עצם אנושית שני פיגומי נשא, הנח את הפיגומים המשוחזרים לבארות בודדות של צלחת U-bottom 96 בארות, והוסף חמישה מיקרוליטרים של חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית רקומביננטית שניים לכל פיגום.

לאחר מכן מכסים את הפיגומים ב -20 מיקרוליטר תרומבין ו -20 מיקרוליטר פיברינוגן. להשתלה כירורגית של הפיגומים המהונדסים ביולוגית, יש לגלח תחילה את אזור הניתוח בגב עכבר הניסוי, ולהשתמש בקצה כותנה טבול בכלורהקסידין מדולל כדי לנקות את פני העור החשוף שלוש פעמים לכל כיוון. לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים ובאזמל כדי לבצע חתך של 0.5 עד 0.7 סנטימטר קדמי לאחורי בעור, והכנס את המלקחיים מתחת לרקמה התת עורית כדי ליצור כיס.

הכנס את הפיגום עמוק לכיס, וסגור את החתך עם דבק כירורגי. אפשר לפיגומים המושתלים להתפתח במשך שמונה עד 24 שבועות לפני ההשתלה. לאחר מתן תוך ורידי של חומרים פלואורסצנטיים והמתת חסד של בעלי החיים, יש לעקר את העור כפי שהודגם זה עתה ולבצע חתך עור אורכי בגב החיה, בסמוך לאתר ההשתלה המקורי.

הפרד בזהירות את העור מהכיס התת עורי שבו הושתל הפיגום, ולאחר מכן השתמש בפינצטה כדי לתפוס בעדינות את הפיגום וחתוך בזהירות את הממברנה הנותרת והרקמות המקיפות את הפיגום כדי לשחזר את המבנה. השתמש בדבק דבק מהיר כדי להדק את הפיגום לצלחת פטרי בגודל 35 על 10 מיליליטר. עבור חלבון מורפוגנטי של העצם שני פיגומים, לפני מילוי הצלחת ב-PBS, השתמש במיקרו-מקדחה כירורגית מתחת למיקרוסקופ מיקרו-כירורגי כדי לדלל את פני העצם, מה שמאפשר הדמיה של הפלואורופורים ולכידת תמונות ברזולוציה גבוהה.

היזהר במיוחד במהלך תהליך הקידוח מכיוון שעובי העצם משתנה בדרך כלל בין פיגומים, וחשוב לא לשבור את פני השטח. ממלאים את המנה ב- PBS בטמפרטורת החדר. להדמיית מיקרוסקופיה דו-פוטונית של הפיגומים המהונדסים ביולוגית, הנח את הפיגום על שלב המיקרוסקופ הקונפוקלי, ובחר את עדשת הטבילה במים 20 כפול 1.0 NA.

לאחר מכן, במצב הרכישה של תוכנת ההדמיה, בחר בתיבת הצג כלים ידניים. בתפריט הלייזר, הפעל את לייזר 2 הפוטונים, ואפשר ללייזר להתחמם ולהתייצב. כאשר הלייזר מוכן, בתפריט הגדרות ההדמיה, הפעל את מצב הערוץ והחלף עקוב אחר כל פריים.

בתפריט נתיב האור בחר מפצל אלומה ראשית שאינו סרוק MBS 760 פלוס. הפעל את ארבעת הגלאים שאינם סרוקים והגדר את התצורה כפי שמוצג בסכימה. בתפריט הערוצים, הגדר את אורך גל הלייזר ל-890 ננומטר ואת ההספק ל-50%הגדר את מאסטר הרווח ל-500 עד 600, את ההיסט הדיגיטלי לאפס ואת הרווח הדיגיטלי ל-15 עבור כל ערוץ.

במצב הרכישה, הגדר את הפרמטרים המתאימים לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה מבלי לפגוע ברקמה ולהלבין את הפלואורופורים. לאחר מכן הגדר את הזום לאחד עבור הסריקה הראשונית של התמונה. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הורד את העדשה עד שהיא נוגעת בתמיסת המלח, והגדר ידנית את מיקוד העדשה באמצעות מנורה כמקור האור.

כעת הפעל את תפריט Z-stack ובחר את הפונקציה האחרונה הראשונה. הגדר את המרווח הנדרש בין שתי פרוסות תת-עוקבות ובחר חי כדי לצלם סריקה חיה של הדגימה, תוך התאמת הרווח הדיגיטלי וההיסט הדיגיטלי לפי הצורך לחשיפה אופטימלית. כדי להציג באופן חזותי מספר ערוצים בו-זמנית, בחר את פונקציית הפיצול.

בתפריט הבמה, במצב חי, סרוק את התמונה וסמן את אזורי העניין, כגון מיקום חללי העצם. לאחר השלמת הסריקה לדוגמה, עבור לאזור העניין הראשון, והשתמש בפונקציות Set first ו-set last במצב חי כדי להגדיר את החלק העליון והתחתון של ערימת Z התלת-ממדית המקיפה את אזור העניין. לאחר מכן הגדר את המרכז, C, ולחץ על כפתור התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת תמונות Z-stack של אזור העניין.

בסיום הרכישה, שמור את התמונות בתיקייה המיועדת לכך, וסרוק את אזור העניין הבא. בתמונות מייצגות אלה, ניתן לראות את המורפולוגיה הגסה של פיגומים שונים ששוחזרו מעכברי NSG חסרי חיסון שמונה שבועות לאחר ההשתלה. זריעה משותפת עם תאי אנדותל אנושיים מגבירה את כלי הדם של הפיגום, בעוד שתוספת של חלבון מורפוגנטי רקומביננטי של עצם אנושית 2 גורמת להיווצרות עצם.

פיגומים אלה שצולמו על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני חי חושפים את נוכחותם של כלי דם בפיגומים ואת ההשתלטות ארוכת הטווח של התאים ההמטופויאטיים האנושיים בפרנכימת הפיגום. פיגומים שנזרעו עם תאי סטרומה אנדותל אנושיים ומזנכימליים ממחישים את השתתפותם של תאי האנדותל האנושיים ביצירת כלי דם בתוך הפיגום, וכתוצאה מכך כלי דם כימריים מורין-אנושיים. ניתן לדמיין את היווצרות רקמת העצם על ידי מיקרוסקופיה דו-פוטונית, כמו גם היווצרות חללים בכלי דם אנושיים ברקמה האנדוסטאלית, הדומה מאוד לרקמת אנדוסטאיל של מח העצם.

יתר על כן, בחלבון מורפוגנטי רקומביננטי של עצם אנושית שני פיגומים נשאים, המורפולוגיה של הרקמה בתוך הפיגום דומה למח עצם בוגר עם רקמת שומן, מה שמרמז על כך שתאי הסטרומה המזנכימליים האנושיים תורמים גם להיווצרות רקמת השומן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את כל המהנדסים הביולוגיים ואת פיגומי העכברים העיקריים. זכור תמיד לשמור על סביבה סגפנית, ולנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בפיגומים.

זכור את המגבלות הקשורות לשיטה זו, כגון כימרות אדם-עכבר של הרקמות. זכרו כי לאחר ההדמיה ניתן להשתמש בדגימות למחקרים נוספים, שכן ניתן לעכל את הפיגומים, ולכן ניתן לאחזר מהם תאים חיים.