הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה
1 באוגוסט 2017
שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשתיל פיגומים לנשיאת תאים אנושיים בעכברים כדי ליצור נישות של מח עצם אנושי, ולאחר מכן לבצע דימות חי של התנהגות התאים האנושיים בתוך השתלים. שיטה זו תסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההמאטופויזה האנושית, כיוון שהיא מאפשרת לשחזר ולדמות בשידור חי ברזולוציה של תא בודד רכיבים שונים של מח העצם. הרב-גוניות של מערכת זו היא אחד מיתרונותיה המרכזיים, שכן היא מאפשרת השתלה של רכיבי נישה שונים באופן עקבי, אחד אחד או בשילובים.
ניתן להחיל מתודולוגיה זו פוטנציאלית על תחומי מחקר אחרים, כגון מחקרי גרורות של גידולים או סריקת תרופות. תוך שימוש בטכניקה סטרילית מתאימה, התחל בחיתוך ספוג ג'לטין שעבר סטריליזציה ל-24 חלקים בגודל דומה. בצע רקומינציה של פיגומים הג'לטין באמצעות טבילה ב-ethanol ולאחר מכן ב-PBS.
לאחר מכן, טפחו בעדינות על כל פיגום באמצעות טישו סטרילי כדי להסיר את עודפי הנוזל, והעבירו את הפיגומים לבארות נפרדות בלוחית 24 בארות בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment). באמצעות מזרק אינסולין, הזריקו בזהירות 10⁵ עד 10⁶ תאי סטרומה ב-50 µL של מצע תרבית לתוך כל פיגום, והניחו את הלוחית באינקובטור לתרבית תאים. בעת הזרקת התאים אל הפיגום, ודאו שאין דליפה מהפיגום החוצה.
לאחר שעה אחת, מלאו כל באר בשלושה מיליליטרים של מצע תרבית תאים טרי, והחזירו את הפיגומים למדגרה. לאחר 24 שעות, הזריקו 1×10⁵ תאים המטופואטיים לתוך הפיגומים, ולאחר מכן בצעו אינקובציה והוספת מצע נוספת, ואינקובציה של 24 שעות כפי שהודגם זה עתה. לצורך יצירת פיגומים נשאי recombinant human bone morphogenetic protein two, הניחו את הפיגומים שהושחזרו לבארים בודדות של פלטת 96 בארות בעלת תחתית מסוג U, והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של recombinant human bone morphogenetic protein two לכל פיגום.
לאחר מכן, כסו את הפיגומים ב-20 µL של thrombin וב-20 µL של fibrinogen. לצורך השתלה כירורגית של הפיגומים הביו-הנדסיים, גלחו תחילה את אזור הניתוח בגבו של העכבר הניסויי, והשתמשו במקלון צמר טבול ב-chlorhexidine מהול כדי לנקות את פני העור החשוף שלוש פעמים בכל כיוון. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטרילית ובסכין מנתחים כדי לבצע חתך בעור באורך 0.5 עד 0.7 cm מהחלק הקדמי לאחורי, והחדירו את הפינצטה אל מתחת לרקמה התת-עורית כדי ליצור כיס.
החדירו את הפיגום עמוק לתוך התוך, וסגרו את החתך באמצעות דבק כירורגי. המתינו שמונה עד 24 שבועות להתפתחות הפיגומים המושתלים לפני השליפה. לאחר מתן תוך-ורידי של חומרים פלואורסצנטיים והדמיסה של בעלי החיים, סטריליזו את העור כפי שהודגם כעת ובצעו חתך עורי אורכי בגב בעל החיים, סמוך לאתר ההשתלה המקורי.
הפרידו בזהירות את העור מהכיס התת-עורי שבו הושתל הפיגום, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות את הפיגום וגזרו בזהירות את הממברנה והרקמות שנותרו מסביב לפיגום כדי להוציא את המבנה. השתמשו בדבק מהיר כדי לקבע את הפיגום לצלחמת פטרי של 35 על 10 מיליליטר. עבור פיגומים של bone morphogenetic protein two, לפני מילוי הצלחת ב-PBS, השתמשו במקדח מיקרו-כירורגי תחת מיקרוסקופ כירורגי כדי לדלל את פני השטח של העצם, דבר המאפשר ויזואליזציה של הפלואורופורים ולכידה של תמונות ברזולוציה גבוהה.
יש להקפיד במיוחד במהלך תהליך הקידוח מכיוון שעובי העצם משתנה בדרך כלל בין פיגומים שונים, וחשוב לא לשבור את פני השטח. מלאו את הצלחת ב-PBS בטמפרטורת החדר. לצורך דימוי במיקרוסקופיה של שני פוטונים של הפיגומים הביו-הנדסיים, הניחו את הפיגום על במת המיקרוסקופ הקונפוקאלי, ובחרו בעדשה עם הגדלה של 20 פעמים ו-1.0 NA בטבילה במים.
לאחר מכן, במצב הרכישה (acquisition mode) של תוכנת ההדמיה, סמנו את תיבת הבחירה להצגת כלים ידניים (show manual tools). בתפריט הלייזר, הפעילו את לייזר ה-2-photon, והמתינו לחימום ולהתייצבות של הלייזר. כאשר הלייזר מוכן, בתפריט הגדרות ההדמיה, הפעילו את מצב הערוצים (channel mode) ובחרו באפשרות החלפת ערוץ בכל פריים (switch track every frame).
בתפריט נתיב האור (light path) בחרו ב-non descanned ובמפליט קרן ראשי MBS 760 plus. הפעילו את ארבעת הגלאים מסוג non descanned והגדירו את התצורה כפי שמוצג בסכימה. בתפריט הערוצים (channels), הגדירו את אורך גל הלייזר ל-890 nanometers ואת העוצמה ל-50%. הגדירו את ה-gain master לערך שבין 500 ל-600, את ה-digital offset לאפס, ואת ה-digital gain ל-15 עבור כל ערוץ.
במצב רכישת נתונים, הגדירו את הפרמטרים המתאימים לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה מבלי לפגוע ברקמה ובלי לגרום להבהרה (bleaching) של הפלואורופורים. לאחר מכן, הגדירו את הזום ל-1 עבור הסריקה הראשונית של התמונה. כאשר כל הפרמטרים הוגדרו, הורידו את העדשה עד שתגע בתמיסת הסליין, והגדירו ידנית את מיקוד העדשה באמצעות מנורה כמקור אור.
כעת הפעילו את תפריט ה-Z-stack, ובחרו בפונקציית ה-first last. הגדירו את המרווח הנדרש בין שתי פרוסות עוקבות ובחרו ב-live כדי לבצע סריקה חיה של הדגימה, תוך התאמה של ה-digital gain וה-digital offset לפי הצורך כדי להשיג חשיפה אופטימלית. כדי להציג מספר ערוצים בו-זמנית, בחרו בפונקציית ה-split.
בתפריט הבמה (stage menu), בזמן שהמערכת נמצאת במצב חי (live mode), סרקו את התמונה וסמנו את האזורים שמעניינים אתכם (regions of interest), כגון מיקום של חללי עצם. כאשר סריקת הדגימה מסתיימת, עברו לאזור העניין הראשון, והשתמשו בפונקציות set first ו-set last במצב החי כדי לקבוע את הגבול העליון והתחתון של ה-3D Z-stack המקיף את אזור העניין. לאחר מכן הגדירו את המרכז, C, ולחצו על כפתור start experiment כדי להתחיל את רכישת תמונות ה-Z-stack של אזור העניין.
עם השלמת הרכישה, שמרו את התמונות בתיקייה הייעודית, וסרקו את אזור העניין הבא. בתמונות מייצגות אלו, ניתן להבחין במורפולוגיה הגסה של פיגומים שונים שהוצאו מעכברי NSG עם חסר חיסוני שמונה שבועות לאחר ההשתלה. זריעה משותפת עם תאי אנדותל אנושיים מגבירה את הווסקולריזציה של הפיגום, בעוד שתוספת של recombinant human bone morphogenetic protein two מעודדת יצירת עצם.
פיגומים אלו, שדומו באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים-2 חיה, חושפים את נוכחותם של כלי דם בפיגומים ואת ההשתבצות ארוכת הטווח של תאי המטופואטיים אנושיים בפארנכימה של הפיגום. פיגומים שנזרעו עם תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים אנושיים ממחישים את השתתפותם של תאי האנדותל האנושיים ביצירת כלי דם בתוך הפיגום, מה שמוביל למערכת כלי דם כימרית עכברית-אנושית. ניתן להדמיאן את היווצרות רקמת העצם באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים-2, כמו גם את היווצרותן של חלליות במערכת כלי דם אנושית ברקמה האנדוסטאלית, אשר דומה מאוד לרקמה אנדוסטאלית של מח עצם.
יתרה מכך, בפיגומים נשאי חלבון מורפוגנטי של העצם האנושי רקומביננטי שני (recombinant human bone morphogenetic protein two), מורפולוגיית הרקמה בתוך הפיגום דומה למח עצם בוגר עם רקמת שומן, מה שמרמז כי התאים הסטרומליים המזנכימליים האנושיים תורמים גם להיווצרות רקמת שומן. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של כל ההנדסה הביולוגית ושל הפיגומים העכבריים העיקריים. זכרו תמיד לשמור על סביבה סטרילית, וגלגלו זהירות יתרה בעת טיפול בפיגומים.
יש לקחת בחשבון את המגבלות הקשורות לשיטה זו, כגון כימרות אדם-עכבר של הרקמות. זכרו כי לאחר הדימות, ניתן להשתמש בדגימות למחקרים נוספים, שכן ניתן לעכל את הפיגומים (scaffolds), ובכך להפיק מהם תאים חיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירה ולדימוי חי של נישות מח עצם אנושיות בעכברים. הגישה כוללת השתלה של פיגומים לנשיאת תאים אנושיים, המאפשרים תצפית על התנהגות תאים אנושיים בתוך השתלים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- מחקר מח עצם
- דימוי תאי
רקע
- נישות של מח עצם אנושיות הן קריטיות לחקר ההמטופואזה.
- האינטראקציה בין תאים מזנכימליים לתאים אנדותלייליים אנושיים היא משמעותית עבור הווסקולריזציה.
- דימיג חי ברזולוציית תא בודד מספק תובנות לגבי דינמיקה תאית.
- למתודולוגיה זו יש יישומים פוטנציאליים בתחומי מחקר שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להשתלת פיגומים של תאי אדם בעכברים.
- מתן אפשרות לדימוי חי של תאי אדם בסביבה מבוקרת.
- חקירת היווצרות של רקמת עצם כימרית של אדם ועכבר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פיגומים מג'לטין להשתלת תאים.
- הזרקת תאי סטרומה ותאי המטופויטיים אל תוך הפיגומים.
- השתלה כירורגית של הפיגומים בעכברים.
- מיקרוסקופיית 2-פוטון לדימוי חי של הפיגומים המושתלים.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של נישות מח העצם אנושיות בעכברים.
- נצפתה וסקולריזציה מוגברת עם תאים אנדותליאליים אנושיים.
- אושרה יצירה של רקמת עצם בוגרת כימרית.
- המתודולוגיה מאפשרת ניסויים רב-גוניים עם רכיבי הנישה.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך לחקר ההמטופואזה האנושית.
- דימות חי מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות.
- ניתן להתאים גישה זו לתחומי מחקר אחרים, כולל סריקת תרופות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
שיטה זו מאפשרת לחוקרי ביו-פארמה למדל אינטראקציות של תאי גזע המטופואטיים אנושיים בתוך מיקרו-סביבה של מוח עצם הניתנת לכוונון, ובכך לתמוך בתיקוף מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות המטולוגיות. דימות חי ברזולוציית תא בודד מספק מדדים כמותיים להערכת השפעות של תרכובות על השתרשות תאים (engraftment), דיפרנציאציה ואינטראקציות עם הנישה, ובכך משפר את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים. רב-הגמישות של המערכת מאפשרת חקירה סיסטמטית של מרכיבים סטרומליים, דבר המקל על פיתוח בדיקות וגילוי ביו-מרקרים טרנסלציונליים במחלות לוקמיה, לימפומה והפרעות של כשל במוח העצם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של התנהגות תאי גזע המטופואטיים אנושיים בתגובה לאותים סטרומליים, ובכך תומך בבדיקת השערות לגבי מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור להערכת האופן שבו רכיבי הנישה משפיעים על השקט התאי (quiescence), התחדשות עצמית ודיפרנציאציה של HSC.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של יצירת רקמה כימרית אנושית-עכברית ותקשורת תאית in situ.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצרי דימות מדידים כגון צפיפות כלי דם, רמות השתבצות ויצירת חללים לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: הכנה ושתילה סטנדרטיות של פיגומים מאפשרות ביצוע בדיקות ניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב תחת תנאים מרובים.
- ערך מדעי: מקל על הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי סריקת תרופות וסריקה פנוטיפית בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה את המיקרו-סביבה של מח העצם האנושי הרלוונטית למחלה כדי לחקור המטופואזה ממאירה ועמידות לטיפול.
- ערך תפעולי: תומך במעקב אורך של השתבשות תאים אנושיים לאורך 8–24 שבועות, מה שמאפשר מחקרים פרה-קליניים כרוניים.
- ערך מדעי: משפר את הרצף התרגומי על ידי מתן אפשרות לשליפת תאים חיים לאחר הדימות לצורך ניתוח תפקודי נוסף.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרה ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור ממאירות המטולוגיות וטיפולים המכוונים למח העצם.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי גורמים סטורמליים המשפיעים על החלטות הגורל של HSC ועל טרנספורמציה ממאירה.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות נישות אנושיות וסקולריות סטנדרטיות עם נקודות קצה של דימיון כמותיות.
- אנליטיקה: מספק נתוני דימיון רב-ערוציים (multiplexed) ברזולוציה גבוהה על לוקליזציה של תאים, היווצרות כלי דם וארכיטקטורת רקמות לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר טרנסלציונלי: ממדל אינטראקציות של נישות ספציפיות לבני אדם הרלוונטיות לתיקוף פרה-קליני של טיפולים המטופויטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: יכולת ההסתגלות של הפלטפורמה מאפשרת שימוש חוזר במספר פרויקטים על ידי שינוי של תשומות תאי סטורמה, תאי אנדותל או תאים המטופויטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת ההסתמכות על מודלי Xenograft שחסרים הקשר של סטרומה אנושית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות ייצור פיגומים והליכי השתלה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי השפעות תרופתיות על אינטראקציות בין הנישה ל-HSC.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכונים, בהתבסס על השפעות על השתרשות (engraftment), דיפרנציאציה ועיצוב מחדש של הנישה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים סטריליות, השתלה במיקרו-כירורגיה ותפעול של מיקרוסקופ דו-פוטוני.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים דו-פוטוניים עם גלאים ללא סריקה חוזרת (non-descanned detectors) וכיוונון לייזר מתאים (למשל, 890 nm).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי ביולוגיה של התא, דימות וכירורגיה של בעלי חיים כדי להבטיח הכנה עקבית של הפיגום (scaffold).
- שיקולי התאמה כוללים מקורות תאים אנושיים שונים (למשל, HSCs המופקים מחולה, שורות סטרומליות) ומרכיבי נישה (BMP2, תאים אנדותליאליים).
- מגבלות מעשיות כוללות יצירת כימרה של בן אדם ועכבר ושונות בשילוב הפיגום, העלולות להשפיע על עקביות הדימות.
