גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד את חלבון G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 ממערכת ביטוי חיידקים באמצעות שלב טיהור ייחודי תלוי ATP כדי לבודד אנזים כמעט טהור ופעיל קטליטי. שיטה זו יכולה לעזור לחוקרים להשיג עבורנו חלבון רקומביננטי רקומביננטי G4 Resolvase1 כמעט טהור ופעיל קטליטית במגוון רחב של בדיקות ביוכימיות במבחנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא אינה כוללת אנזים מקופל או לא פעיל מבחינה קטליטית אחרת מתכשיר החלבון.

הרעיון להשתמש ב-ATP כדי לסלק את הליקאז G-quadruplex מקורו לאחר שלא הצליח לסלק את האנזים הפעיל קטליטית מחרוזי ה-G4, אפילו בריכוזי מלח גבוהים במיוחד. הכן וגדל תרביות חיידקים גדולות המבטאות G-quadruplex Resolvase1 או G4R1 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפשירו את גלולת החיידקים בשלושה מיליליטר של מאגר TN בטמפרטורת החדר.

החזיקו את הבקבוקים ביד והסתחררו כדי להפשיר ולהשעות מחדש את הכדור החיידקי. לאחר הפשרה והשעיה אחידה יחסית, הביאו את הנפח עד חמישה מיליליטר עם מאגר TN. לאחר מכן, ממיסים 20 מיליגרם ליזוזים ב -250 מיקרוליטר מים לתרבית ומוסיפים לחיידקים המרחפים.

אפשרו לליזוזים לעכל את החיידקים במשך כחמש עד 10 דקות תוך כדי סיבוב הבקבוקים ביד. צבע המתלה יתחיל להתבהר מעט ככל שהעיכול יתקדם, והמתלה יהיה יחסית לא צמיג. הוסף 250 מיקרוליטר קוקטייל מעכב פרוטאז בקיצור PIC.

לאחר מכן, מוסיפים 10 מיקרוליטר של לופפטין ומערבבים היטב. הניחו את התרחיף על קרח והוסיפו 10 מיליליטר מאגר TN קר ו -22 מיקרוליטר בטא מרקפטואתנול או BME. העבירו את המתלה לצינור של 50 מיליליטר.

סוניקטור את החיידקים על הקרח עם סוניקטור דיגיטלי המוגדר ל-30% משרעת. דופק בשתי שניות הפעלה ושתי שניות כבוי למשך דקה אחת. חזור על הסוניקציה שלוש פעמים, ואפשר לדגימות להתקרר על קרח לפחות שתי דקות בין שלבי הסוניקציה.

לאחר מכן, הוסף נפח שווה של נתרן ציטראט קר ארבעה X מלח או SSC בתוספת BME, PIC ולופפטין וערבב את המתלה. בצנטריפוגה שולחנית מקוררת מראש לארבע מעלות צלזיוס צנטריפוגה הליזטים ב -2, 300 פעמים G למשך 20 דקות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינורות טריים מקוררים מראש של 50 מיליליטר.

קח מיליליטר אחד של חרוזים פרמגנטיים של סטרפטווידין, או תרחיף SPB לכל תרבית, והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. גלולה את ה-SPB עם מגנט. לאחר מכן שטפו את ה-SPB פעמיים עם שני X SSC בתוספת חמישה מילימולר EDTA PH8.

לאחר מכן, השעו מחדש את ה- SPB השטוף ב -200 מיקרוליטר מאותו תמיסה. הוסף ציון אחד של שלוש OD של G4 DNA לתרחיף SPB. מערבבים במהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.

לאחר מכן, הניחו את הצינורות על מסובב וסובבו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. לאחר תקופת סיבוב זו, חסום את ה-SPB הקשור ל-G4 על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.4% לקטאלבומין, והשאר על הקרח עד הצורך. כדי לקשור את G4R1 הרקומביננטי המתויג בהיסטידין לחרוזי קובלט, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חרוזי קובלט לכל צינור של 50 מיליליטר המכיל את הליזאט החיידקי המובהר.

דוגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב. לאחר הדגירה יש לסובב חרוזי קובלט ב-110 פעמים G למשך חמש דקות בצנטריפוגה שולחנית של ארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הנוזל בזהירות, והשאירו כמה מיליליטר נוזלים כדי לא להפריע לחרוזי הקובלט הגלולים.

לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם 10 עד 15 מיליליטר קר ארבעה X SSC בתוספת BME, וגלו את החרוזים כמו קודם. יוצקים את הליזאט המובהר הבא על חרוזי הקובלט הגלולים. דגירה למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר על המסובב, ושטוף את החרוזים עם 10 עד 15 מיליליטר של ארבעה X SSC בתוספת BME.

לאחר מכן, גלו את החרוזים ב-100 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה שנייה יש לשאוב את הנוזל ולהשאיר כשני מיליליטר חרוזים ונוזל בתחתית הצינור. העבירו את חרוזי הקובלט הקשורים לחלבון לצינור מקורר מראש של שני מיליליטר באמצעות קצה פיפטה ברוחב מיליליטר אחד.

צנטריפוגה קצרה של החרוזים בצינור שני מיליליטר במהירות גבוהה במיקרו-צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. הסר בעדינות והשליך את הסופרנטנט על ידי פיפטינג תוך זהירות לא לאבד את חרוזי הקובלט הקשורים לחלבון. פיפטה 0.5 מיליליטר של מאגר פליטת היסטידין, או HEB על החרוזים והשעיית אותם מחדש על ידי היפוך הצינור.

לאחר מכן דגרו את חרוזי הקובלט ב- HEB על מסובב למשך חמש דקות בחדר קר. לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה ב-18,000 פעמים G במיקרו-צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הסירו בעדינות את החלבון המכיל סופרנטנט על ידי פיפטינג זהיר והשאירו כמות קטנה של נוזל על גבי חרוזי הקובלט.

העבירו את הסופרנטנט לצינור מקורר מראש של 15 מיליליטר. חזור על שלבים אלה עבור סך הכל שלוש מסירות HEB. לאחר מכן נמחק פעם אחת עם 0.2 EDTA מולארי ב-PH 6.0.

צבע חרוזי הקובלט ישתנה מוורוד ללבן כאשר ה-EDTA מכרסם את הקובלט. לאחר העברת הפליטה הרביעית והאחרונה לצינור של 15 מיליליטר, פיפטה את מאגר הפליטה השיורי מחרוזי הקובלט באמצעות קצה טעינת ג'ל בקצה קצה פיפטה של מיליליטר אחד. על ידי צלילה של הקצה לתחתית הצינור, ניתן לאסוף שאריות חלבון המכיל מאגר פליטה.

הטיסו את ה-G4 SPB המוכן לצד הצינור בעזרת מגנט והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של שלושה מאגר X רזולוציה ל-G4 SPB ופיפטה לערבוב. פיפטה ה-G4 SPB תלוי בשלושה מאגרים X רזולוציה לתוך שפופרת ה-15 מיליליטר המכילה כשני מיליליטר חלבון המכיל HEB EDTA.

דגירה למשך 15 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מדי פעם כדי שהחרוזים לא ישקעו. לאחר שטיפת החלבון הקשור G4 SPB כמתואר בפרוטוקול הטקסט גלולה את ה-G4 SPB עם מגנט על קרח והשעיה מחדש של החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר פליטה מחומם מראש. העבירו מיד את החרוזים לצינור PCR שחומם מראש ודגרו למשך 30 שניות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הוסף מיד 12 מיקרוליטר של נתרן כלורי חמישה מולארי ופיפטה למעלה ולמטה במרץ 20 עד 30 פעמים. השילוב של המלח הגבוה וה-ATP הכלול במאגר הפליטה משמש לסילוק G4R1 רקומביננטי מחרוזי G4. גלולה מיד את ה-G4 SPB עם מגנט, והעבירו את החלבון המכיל אלוט לצינור PCR טרי על קרח.

לאחר חזרה על הפליטה וההעברה, התוצר הסופי הוא כ-200 מיקרוליטר של מאגר פליטה המכיל G4R1 רקומביננטי מטוהר. לבסוף, בצע את בדיקת הפעילות האנזימטית של בקרת האיכות כדי לבדוק אם G4R1 רקומביננטי פעיל מאוד טוהר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בדיקת G4 מספקת מדד לפעילות אנזימטית רקומביננטית של G4R1.

בטווח של 0.2 עד 0.013 מיקרוליטר באנזים, נצפה בדרך כלל כי 50% מתוך 0.2 פיקומולים של טטרמתילרודמין המסומן ב-DNA טטרה-מולקולרי G4 מומרים למונומרים. מעמד Coomassie של G4R1 רקומביננטי מטוהר מצביע על פס בודד בגודל הצפוי של 120 קילו-דלטון עם פס מזהם קל בכ-75 קילודלטון. פס זה עשוי לייצג G4R1 רקומביננטי קטום ששמר על יכולתו לקשור חרוזי DNA G4 לתוך חרוזי DNA בצורה תלויה ב-ATP.

רצועת העניין מכומתת כנגד עקומת תקן חלבון. פרוטוקול זה משיג בדרך כלל 200 מיקרוליטר של 20 עד 100 אנזים מטוהר ננו-מולרי לליטר אחד של תרבית חיידקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר את חלבון G4 Resolvase1 ממערכת ביטוי חיידקים באמצעות שלב טיהור ייחודי תלוי ATP כדי לבודד אנזים כמעט טהור ופעיל קטליטי.

לאחר השליטה, ועם הכנה מוקדמת של כדורי החיידקים הקפואים, ניתן לבצע טיהור של G4R1 רקומביננטי תוך כשש שעות. כדי לשמור על הפעילות הקטליטית האופטימלית של האנזים, חשוב לשמור את התכשיר על קרח, אלא אם צוין אחרת. השתמש תמיד במעכבי פרוטאז.

הימנע מהיווצרות בועות בצינורות. הקפיאו אנזים מטוהר במהירות, והימנעו ממחזורי הפשרה מיותרים בהקפאה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום להגדיר במדויק את זיקות הקישור ופעילויות ההליקאז של חלבון זה למגוון רחב של מצעי DNA ו-RNA.

ניתן להתאים שיטה זו גם לטיהור אנזימי חומצות גרעין אחרים התלויים ב-ATP שעבורם תוצר התגובה האנזימטית אינו עוד מצע מחייב לאנזים.