Name: שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: למד שיטה יעילה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים באמצעות צבירת תאים במטריצת מתילצלולוז. פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר של הספרואידים ושימוש במגוון מבחני ביולוגיה תאית כולל נדידה ופלישה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ל-M. Gordon מהמרכז להדמיה ביו-רפואית של אוניברסיטת קווינס על הסיוע. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים תפעוליים מהאגודה לחקר הסרטן של קנדה (19439) והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (MOP-142303) (LMM), ועל ידי מלגות לתארים מתקדמים של אונטריו ומלגות מתוכנית ההכשרה של מכון המחקר טרי פוקס בחקר הסרטן הטרנסדיסציפלינרי (SMM, EYL), ועל ידי מלגת קיץ של חבר המושבעים קרייג (SMM).

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
<li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781627036399">Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology</a>. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).</li>
<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מציגים שיטה מהירה וגמישה להפקת spheroids תאי 3D מודל הארכיטקטורה של רקמות in vivo באמצעות ריאגנטים זול וזמין באופן נרחב. הפרוטוקול שלנו מנצל את המאפיינים הלא-ציטוטוקסיות וקידום-הידבקות של 8 MC, 9 לתווך צבירת תא ולמזער היווצרות monolayer התא. בניגוד מטריצות מבוססי חלבון מבודד מן החי, MC הוא אינרטי, אינו מכיל גורמי גדילה, והיא מוסרת בקלות על ידי שטיפה, המאפשר בידוד של spheroids לשימוש במגוון יישומים ללא נוכחות ש...

ביולוגית רלוונטית הערכת התנהגות תאים הסרטניים היא מאתגר באמצעות דו ממדים מסורתיות (2D) מתודולוגיות תרבית תאים, בין שאר משום אלה אינם משקפים באופן נאות את המיקרו-הסביבה הניידת שנמצאה in vivo. גישות חלופיות שילוב רכיבים תאים מטריקס לתוך התרבות (למשל, מבחנים קאמריים בוידן) מייצגות פיסיולוגי יותר של סביבת רקמות in vivo. עם זאת, הם יכולים להיות מוגבלים הערכת התנהגות תאים בודדת, ואינו לשחזר את המורכבות בצירופי vivo של אינטראקציות התא-מטריקס תאי תאים תורמים לצמיחת רקמות או גידול 1, 2, 3. שימוש spheroids הרב התאי הוא גישה אחרונה יותר משחזרת את הארכיטקטורה הקומפקטית של צמיחת תאי vivo ב 1,4. Spheroids יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא-מטריצה של תאים נורמלים, אבל יכול לשמש גם אנלוגים גידול מודל מאפיינים של התקדמות גידול, כגון צמיחה גרורתי או סמי התנגדות 4. Spheroids עלול להיוצר על ידי ההתפשטות של תאים בודדים משוקעים בתוך גוש 5, או יותר במהירות, על ידי קידום הצבירה של מספר תאים כדי ליצור אשכול תא בודד (למשל, ירידה תלויה, שיטות צנטריפוגה) 6, 7. טכניקות צבירת תא קיימות מסוימות עשויות לדרוש חומרים יקרים או ציוד מיוחד. בנוסף, יש spheroids אלה מגוון רחב של גדלי מורפולוגיות ועלול להיות קשה לייצר בכמויות גדולות, לערוך השוואות בין תנאי גידול או טיפולים קשים. לבסוף, spheroids המיוצרים בשיטות אלה יכול להיות קשה לבודד מן extracel חלבונייםמטריקס lular שבה הם משובצים לשימוש ביישומים אחרים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה צבירת תא חזקה ובקלות לשינוי להיווצרות של spheroids תא בגודל העקבי באמצעות זמינים מסחריים U-תחתונות צלחות תא-דוחה מטריצת קידום הידבקות אינרטי, תאי מתיל. מרגע היווצרותם, spheroids רב-תאיים אלה מבודדים בקלות לשימוש במגוון רחב של יישומים. הפרוטוקול גם להתאים בקלות ליצור spheroids באמצעות שגשוג תאים, אשר ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכי תאים אחרים. כאן, אנו מציגים מבחני פלישת תא, לכמת ידי מכתים immunofluorescence, וכן assay anoikis, כמו יישומים לדוגמא של שני אלה פרוטוקולי היווצרות אליפטית שונים.

<table><tbody><tr><td><חזק>חוצצים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x פוספט חוצץ מלח</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>21114</td><td>משמש למאגר כביסה PBS+; אין לבצע חיטוי של מאגר כביסה PBS+ בתוספת</td></tr><tr><td>תמיסת סידן כלוריד מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>המשמש למאגר כביסה PBS+; אין לבצע חיטוי של מאגר הכביסה PBS+ בתוספת מגנזיום כלוריד</td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Spheroid Formation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>לתרבית קווי תאים SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>לטיפוח קו תאי TT</td></tr><tr><td>מסנן סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>לפני השימוש להסרת מזהמים חלקיקים</td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>הכנה במים ל-100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק בינוני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8758</td><td>לתרבית HCT-116, קווי תאים BxPC-3</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>12605028 Dissociation buffer</td></tr><tr><td>שם<</td><td>strong>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקר סוג I קולגן</td><td>קורנינג משולב</td><td>354231</td><td>מלאי 3.1 מ"ג/מ"ל; יש לשמור על קרח בעת השימוש</td></tr><tr><td>ב-DMEM פנול אדום ללא גלוקוז נמוך&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11054-20</td><td>פחות פלואורסצנטי רקע בהשוואה לפנול אדום בתוספת</td></tr><tr><td>בינונית קו תאי גליה נגזר גורם נוירוטרופי</td><td>פפרוטק</td><td>450-10</td><td>כימואטרקטורנט</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק><</td><td>חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 מדעי</td><td>מיקרוסקופיית אלקטרונים</td> Coverglass <td>72225-01</td><td>להרכבת ספרואידים כרותים</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>משמש להכתמת אקטין בשעה 1:200</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>ביושופ קנדה משולב</td><td>ALB001</td><td>משמש במאגר חסימת BSA</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>נוגד דהייה</td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>בשימוש בתוכנה חופשית של תוכנת ImageJ בינונית להרכבה של MOWIOL</td></tr><tr><td></td><td>, NIH-משמש</td><td></td> <td>לניתוח תמונה&nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>להרכבת ספרואידים כרותים</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>בשימוש במדיום הרכבה MOWIOL</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>משמש במאגר קיבוע</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>משמש במאגר חדירות</td></tr></tbody></table>

שיטת aggregation cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3d אליפטית

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

תרבית תאים חד שכבתי כראוי אינו מודל ההתנהגות in vivo של רקמות, אשר כרוך אינטראקציות תאים תאים ותא-מטריצה מורכבת. תלת ממדי (3D) תא טכניקות תרבות הם חידוש אחרון פותח כדי לענות על החסרונות של תרבית תאים חסידה. בעוד מספר טכניקות ליצירת אנלוגים רקמות במבחנה פותחו, שיטות אלה הן מורכבים לעתים קרובות, יקרים להקים, דורשות ציוד מיוחד, והם מוגבלים בדרך כלל על ידי תאימות עם סוגי תאים מסוימים בלבד. כאן אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש לאיסוף תאים לתוך spheroids 3D רב-תאיים של גודל עקבי תואמת צמיחה של מגוון רחב של גידולי שורות תאים נורמלים. אנו מנצלים ריכוזים שונים של תאית בסרום מתיל (MC) לקדם דור אליפטית-עצמאית למעגן ולמנוע היווצרות של monolayers התא באופן מאוד לשחזור. תנאים אופטימליים indivשורות תאים idual יכולה להיות מושגת על ידי התאמת MC או ריכוזים בסרום בטווח הבינוני היווצרות אליפטית. הספרואידים 3D שנוצרו ניתן לאסוף לשימוש במגוון רחב של יישומים, כולל איתות תא או ביטוי במחקרי גן, הקרנת סמים מועמדת, או בחקר תהליכים תאיים כגון פלישת תאים סרטניים והגירה. הפרוטוקול גם להתאים בקלות ליצור spheroids המשובט מתאים יחידים, והוא יכול להיות מותאם על מנת להעריך צמיחה למעגן-עצמאי-התנגדות anoikis. בסך הכל, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה וניתנת לשינוי להפקה וניצול spheroids תאי 3D כדי לשחזר את המיקרו-סביבת 3D של רקמות מודל צמיחת vivo של תאים נורמלים גידולים.

<html> אנו מתארים שיטה גמישה ויעילה כדי ליצור spheroids הבדיד באמצעות צלחות תא דוחים ומדיה היווצרות אליפטית השלימה עם MC. תחת התנאים המתאימים של MC וסרום, תאים בודדים להתיישב לדבוק יחד במרכז הבאר כדי ליצור spheroids עם דבקות מזערית על קרקעית הבאר. שימוש בפרוטוקול זה, spheroids נוצרו מתוך מגוון של שורות תאים (תרשים 2B). טיטרציה של MC וריכוזי נסיוב נדרשה עבור כל קו תא לזהות תנאים אופטימליים שבו אליפטית אחת בלבד נוצרה כי היא איתנה מספי...

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

קריין המטרה הכללית של שיטה זו היא לייצר ביעילות כמויות גדולות של ספרואידים תאיים חזקים באמצעות אגרגציה של תאים, לשימוש במגוון מבחנים מבוססי תאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש במטריצה מסיסה במים שאינה חלבונית לצורך אגרגציה של תאים ויצירת ספרואידים, דבר המאפשר בידוד קל ומהיר של הספרואידים. שיטה זו יכולה לסייע בהשגת תובנות חדשות בביולוגיה של התא לגבי השפעותיהן של אינטראקציות בין תאים ותאי-מטריצה על צמיחת רקמה בסביבה מיקרוסקופית תלת-ממדית.קריין לפני הכנת הצברים, חממו 50 מיליליטר של מים אולטרה-טהורים ל-80 °C, והוסיפו 10 גרם של אבקת מתילצלולוז. ערבבו את התמיה עד שהחלקיקים יתפזרו באופן אחיד. לאחר מכן, הוסיפו מים אולטרה-טהורים קרים עד לנפח סופי של 100 מיליליטר, ואחסנו את החלקיקים למשך לילה ב-4 °C עד שהתמיס יהיה שקוף ובצבע קש, ללא מוצקים נראים.העבירו את התמיסה דרך מסנן של 0.45 micrometer כדי להסיר שרידים שלא נמסו, ודללו את התמיסה המסוננת ביחס של 1:5 milligrams per milliliter במצע גידול מתאים. לאחר מכן, סננו את המצע המועשר ב-methylcellulose דרך מסנן של 0.22 micrometer. בשלב הבא, בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, שטפו תת-תרבית במיזוג (confluency) של 70% באמצעות PBS, והצמידו את התאים עם three milliliters של באפר Trypsin-EDTA בתוך אינקובטור לתרביות תאים.לאחר מספר דקות, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 10x. כאשר התאים התנתקו מהפלטה, נטרלו את התגובה באמצעות שבעה מיליליטר של מצע גידול מועשר בסרום. העבירו את תמיסת התאים למבחנה נקייה של 15 מיליליטר, ולאחר מכן אספו את התאים המשוחררים באמצעות סנטריפוגציה.הגורם השכיח ביותר ליצירת ספרואידים לא מוצלחת, מלבד חלקיקים מזהמים, הוא שימוש בריכוזים שאינם אופטימליים של מתילצלולוז או סרום לצורך אגרגציה וצמיחה של קו התאים הספציפי שלכם. קריין-בעזרת מיקרופיפט P1000 עם טיפ עם מסנן, בצעו טריטורציה למשקע שלוש עד חמש פעמים עם 1 mL של מצע ליצירת ספרואידים, כאשר קצה הפיפטה נלחץ אל תחתית המבחנה בזווית קלה, תוך שאיבה ופליטה איטית ללא ריקון מלא של תוכן הטיפ כדי להפריד את המשקע. לאחר הספירה, דללו את תגלי התאים לריכוז של 1×10⁴ תאים ל-mL, ושטפו מאגר של פיפטה רב-ערוצית סטרילית במים אולטרה-טהורים מסוננים כדי להסיר אבק וסיבים.העבירו את התאים למכל (reservoir) והשתמשו בטיפים עם מסנן כדי להעביר 100 µL של התאים לכל באר בצלחת 96 בארי בעלת תחתית בצורת U דוחה-תאים (cell repellent plate), תוך ערבוב תקופתי של תרחיף התאים כדי למנוע את שקיעתם לתחתית המכל. לאחר שכל התאים הועברו, הניחו את הצלחת באינקובטור לתרביות רקמה ובדקו את הבאריים מדי יום כדי לעקוב אחר היווצרות ספרואידים. התאים אמורים לשקוע לתחתית כל באר בתוך שש שעות, ובדרך כלל יתרכזו לספרואיד בתוך 24 עד 48 שעות.כדי לאשר את היווצרותו של ספרואיד תקין, השתמשו בטיפ P10 תחת מיקרוסקופ אור כדי להעביר בעדינות מצע גידול מעל הספרואיד. ספרואידים שנוצרו כראוי ישתחררו מהפלטה ויתגלגלו, מה שיאשר את המבנה התלת-ממדי שלהם. כדי להטמיע את הספרואידים בקולגן, השתמשו בטכניקת פיפוט הפוך כדי לצפות באופן שווה את תחתיתו של כל באר בשקופית תאי תרבית בעלת שמונה בארים, באמצעות מינימום של 50 µL של קולגן מנוטרל לכל באר.לאחר שכל הבארות כוסו, הנח את השקופית לתא (chamber slide) בתוך צלחת לתרבית רקמה של 35 מילימטר המלאה במים מזוקקים במיוחד, בתוך צלחת לתרבית רקמה של 10 סנטימטר, והדגר את צלחת תרבית הרקמה של 10 סנטימטר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כשעה. כאשר הקולגן התפולימר, השתמש בקצה מסנן P1000 כדי להעביר בזהירות את הספרואידים שהוכנו מראש לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter. קריטי להדגיר את שכבות הבסיס של הקולגן עד שהן מפולמרות לחלוטין, כדי למנוע הפרעה לקולגן בעת הוספת הספרואידים או המצע.קריין אספו את הספרואידים שנאספו במ centri-fuge שולחני, והשתמשו בפיפט P200 כדי להסיר את העל-נוזלים (supernatants), תוך ספיגה של שאריות נוזל על ידי היפוך המבחנה על נייר סופג נקי לפי הצורך. באמצעות טיפ P200 בעל פתח רחב, השעיקו מיד את הספרואידים ב-50 µL של קולגן מנוטרל והעבירו בזהירות את תערובות הספרואידים והקולגן לכל באער של שקופית תרבית רקמות בעלת שמונה באערים. החזירו את השקופית לאינקובטור עד לפולימריזציה של הקולגן.לאחר כשעה, הוסיפו באיטיות לפחות 100 µL של מצע תרבית מחומם המכיל את הטיפול הרלוונטי לכל באר לצורך דגירה נוספת. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לרכוש חתכים של דימות אופטית דרך הספרואידים הפולשים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לייצר ספרואידים ממגוון של קווי תאים.תחת תנאי טיפול מתאימים של מתילצלולוז וסרום, התאים הבודדים שוקעים ונצמדים זה לזה במרכז הבאר כדי ליצור ספרואידים עם היצמדות מינימלית לתחתית הבאר. חלק מקווי התאים מסוגלים להיצמד ללוחות דוחה-תאים בהיעדר מתילצלולוז או בריכוזים נמוכים שלו, מה שמוביל להיווצרות של ספרואיד המוקף בשכבת תאים חד-שכבתית (monolayer). באופן כללי, ריכוזים גבוהים יותר של מתילצלולוז מונעים מהתאים להיצמד לבאר.אולם ריכוז גבוה מדי של מתילצלולוז מפחית את ההיצמדות בין התאים ומונע מהם לשקוע לתחתית הבאר, מה שמוביל להיווצרות של אגרגטים רופפים וספרואידים לווינים רבים. ניתן לטפל בספרואידים המוטמעים בקולגן באמצעות חומר כימואטרקטיבי כדי להשרות פלישה של תאים בודדים מהספרואיד החוצה אל המטריקס שסביבו. ניתן לצלם ספרואידים מקובעים המוטמעים בקולגן באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר כדי לכמת את המרחק ומספר התאים הפולשים, או באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסנציה כדי להדמיאן את המבנים הפולשים שנוצרו על ידי התאים המהגרים.חשוב להקצות זמן מספיק לתאים כדי להתרכז לספרואידים יציבים מבחינה מבנית, חסונים מספיק כדי לאפשר מניפולציה ללא פירור, וניתנים לאספירה קלה לצורך שימוש בניסויים המשכיים. ניתן להתאים את פרוטוקול גידול התאים שלנו למגוון ניסויי ביולוגיה של התא. לדוגמה, השקעת התאים בתוככי גידול המועשרו בריכוזים גבוהים של מתילצלולוז יכולה לשמש להערכת עמידות תאית.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו מייצרים ספרואידים תאיים תלת-ממדיים על ידי אגרגציה, אשר יהוו כלי בעל ערך ליישומים רבים בביולוגיה של התא.

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

ספרואידים הם סוג של מודל תרבית תאים תלת-ממדי המשמש לייצוג מדויק יותר של סביבת התא בהשוואה למודלים חד-שכבתיים של תרבית תאים דו-ממדית. בפרוטוקול לדוגמה, נראה מדענים מייצרים ספרואידים מקו תאים של סרטן המעי הגס ומיישמים הדמיה של תאים חיים כדי לעקוב אחר גדילת הספרואידים.

יצירת ספרואידים מקווי תאים: שיטת תרבית תאים תלת ממדית (3D)

אנחנו מציגים מכשיר מיקרופלואידיסי צנטריפוגלי מנוע שיכול לטפח את התאים הניידים. באמצעות התקן זה, הספרואידים של סוגי תא יחיד או מרובים יכול להיות בקלות מתורבת בתנאי כבידה גבוהה.

פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה לייצור ספרואידים רקמתיים בקנה מידה גדול וחסכוניים באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד.

יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק וזול של ספרואידים סרטניים ואחריו אנקפסולציה הידרוג'ל. זה ישים באופן נרחב כפי שהוא אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה ובניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.

ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

ספרואידים של תאים נחשבו למודל פוטנציאלי אחד בתחום היישומים הביולוגיים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מדרגי של ספרואידים של תאים באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית, המספק שיטה יעילה לייצור חזק ומהיר של ספרואידים אחידים של תאים.

התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

מחקר זה מציג מתודולוגיה חסכונית ויעילה ליצירת מבני תאים תלת מימדיים באמצעות מערכת מבוססת חותמת ליצירת מיקרו-בארות בתבניות אגרוז. המערכת מקדמת היווצרות של ספרואידים/אורגנואידים אחידים, ובכך משפרת את האינטראקציות בין התאים. גישה זו מפחיתה את השונות הניסויית ותומכת ביישומים בבדיקות תרופות והנדסת רקמות.

יצירת ספרואידים/אורגנואידים תלת מימדיים מתרביות תאים דו-ממדיות באמצעות מכשיר חותמת חדשני

למד שיטה יעילה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים באמצעות צבירת תאים במטריצת מתילצלולוז. פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר של הספרואידים ושימוש במגוון מבחני ביולוגיה תאית כולל נדידה ופלישה.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

גלה סרטונים נוספים