שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

קריין המטרה הכללית של שיטה זו היא לייצר ביעילות כמויות גדולות של ספרואידים תאיים חזקים באמצעות אגרגציה של תאים, לשימוש במגוון מבחנים מבוססי תאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש במטריצה מסיסה במים שאינה חלבונית לצורך אגרגציה של תאים ויצירת ספרואידים, דבר המאפשר בידוד קל ומהיר של הספרואידים. שיטה זו יכולה לסייע בהשגת תובנות חדשות בביולוגיה של התא לגבי השפעותיהן של אינטראקציות בין תאים ותאי-מטריצה על צמיחת רקמה בסביבה מיקרוסקופית תלת-ממדית.

קריין לפני הכנת הצברים, חממו 50 מיליליטר של מים אולטרה-טהורים ל-80 °C, והוסיפו 10 גרם של אבקת מתילצלולוז. ערבבו את התמיה עד שהחלקיקים יתפזרו באופן אחיד. לאחר מכן, הוסיפו מים אולטרה-טהורים קרים עד לנפח סופי של 100 מיליליטר, ואחסנו את החלקיקים למשך לילה ב-4 °C עד שהתמיס יהיה שקוף ובצבע קש, ללא מוצקים נראים.

העבירו את התמיסה דרך מסנן של 0.45 micrometer כדי להסיר שרידים שלא נמסו, ודללו את התמיסה המסוננת ביחס של 1:5 milligrams per milliliter במצע גידול מתאים. לאחר מכן, סננו את המצע המועשר ב-methylcellulose דרך מסנן של 0.22 micrometer. בשלב הבא, בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, שטפו תת-תרבית במיזוג (confluency) של 70% באמצעות PBS, והצמידו את התאים עם three milliliters של באפר Trypsin-EDTA בתוך אינקובטור לתרביות תאים.

לאחר מספר דקות, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 10x. כאשר התאים התנתקו מהפלטה, נטרלו את התגובה באמצעות שבעה מיליליטר של מצע גידול מועשר בסרום. העבירו את תמיסת התאים למבחנה נקייה של 15 מיליליטר, ולאחר מכן אספו את התאים המשוחררים באמצעות סנטריפוגציה.

הגורם השכיח ביותר ליצירת ספרואידים לא מוצלחת, מלבד חלקיקים מזהמים, הוא שימוש בריכוזים שאינם אופטימליים של מתילצלולוז או סרום לצורך אגרגציה וצמיחה של קו התאים הספציפי שלכם. קריין-בעזרת מיקרופיפט P1000 עם טיפ עם מסנן, בצעו טריטורציה למשקע שלוש עד חמש פעמים עם 1 mL של מצע ליצירת ספרואידים, כאשר קצה הפיפטה נלחץ אל תחתית המבחנה בזווית קלה, תוך שאיבה ופליטה איטית ללא ריקון מלא של תוכן הטיפ כדי להפריד את המשקע. לאחר הספירה, דללו את תגלי התאים לריכוז של 1×10⁴ תאים ל-mL, ושטפו מאגר של פיפטה רב-ערוצית סטרילית במים אולטרה-טהורים מסוננים כדי להסיר אבק וסיבים.

העבירו את התאים למכל (reservoir) והשתמשו בטיפים עם מסנן כדי להעביר 100 µL של התאים לכל באר בצלחת 96 בארי בעלת תחתית בצורת U דוחה-תאים (cell repellent plate), תוך ערבוב תקופתי של תרחיף התאים כדי למנוע את שקיעתם לתחתית המכל. לאחר שכל התאים הועברו, הניחו את הצלחת באינקובטור לתרביות רקמה ובדקו את הבאריים מדי יום כדי לעקוב אחר היווצרות ספרואידים. התאים אמורים לשקוע לתחתית כל באר בתוך שש שעות, ובדרך כלל יתרכזו לספרואיד בתוך 24 עד 48 שעות.

כדי לאשר את היווצרותו של ספרואיד תקין, השתמשו בטיפ P10 תחת מיקרוסקופ אור כדי להעביר בעדינות מצע גידול מעל הספרואיד. ספרואידים שנוצרו כראוי ישתחררו מהפלטה ויתגלגלו, מה שיאשר את המבנה התלת-ממדי שלהם. כדי להטמיע את הספרואידים בקולגן, השתמשו בטכניקת פיפוט הפוך כדי לצפות באופן שווה את תחתיתו של כל באר בשקופית תאי תרבית בעלת שמונה בארים, באמצעות מינימום של 50 µL של קולגן מנוטרל לכל באר.

לאחר שכל הבארות כוסו, הנח את השקופית לתא (chamber slide) בתוך צלחת לתרבית רקמה של 35 מילימטר המלאה במים מזוקקים במיוחד, בתוך צלחת לתרבית רקמה של 10 סנטימטר, והדגר את צלחת תרבית הרקמה של 10 סנטימטר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כשעה. כאשר הקולגן התפולימר, השתמש בקצה מסנן P1000 כדי להעביר בזהירות את הספרואידים שהוכנו מראש לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter. קריטי להדגיר את שכבות הבסיס של הקולגן עד שהן מפולמרות לחלוטין, כדי למנוע הפרעה לקולגן בעת הוספת הספרואידים או המצע.

קריין אספו את הספרואידים שנאספו במ centri-fuge שולחני, והשתמשו בפיפט P200 כדי להסיר את העל-נוזלים (supernatants), תוך ספיגה של שאריות נוזל על ידי היפוך המבחנה על נייר סופג נקי לפי הצורך. באמצעות טיפ P200 בעל פתח רחב, השעיקו מיד את הספרואידים ב-50 µL של קולגן מנוטרל והעבירו בזהירות את תערובות הספרואידים והקולגן לכל באער של שקופית תרבית רקמות בעלת שמונה באערים. החזירו את השקופית לאינקובטור עד לפולימריזציה של הקולגן.

לאחר כשעה, הוסיפו באיטיות לפחות 100 µL של מצע תרבית מחומם המכיל את הטיפול הרלוונטי לכל באר לצורך דגירה נוספת. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לרכוש חתכים של דימות אופטית דרך הספרואידים הפולשים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לייצר ספרואידים ממגוון של קווי תאים.

תחת תנאי טיפול מתאימים של מתילצלולוז וסרום, התאים הבודדים שוקעים ונצמדים זה לזה במרכז הבאר כדי ליצור ספרואידים עם היצמדות מינימלית לתחתית הבאר. חלק מקווי התאים מסוגלים להיצמד ללוחות דוחה-תאים בהיעדר מתילצלולוז או בריכוזים נמוכים שלו, מה שמוביל להיווצרות של ספרואיד המוקף בשכבת תאים חד-שכבתית (monolayer). באופן כללי, ריכוזים גבוהים יותר של מתילצלולוז מונעים מהתאים להיצמד לבאר.

אולם ריכוז גבוה מדי של מתילצלולוז מפחית את ההיצמדות בין התאים ומונע מהם לשקוע לתחתית הבאר, מה שמוביל להיווצרות של אגרגטים רופפים וספרואידים לווינים רבים. ניתן לטפל בספרואידים המוטמעים בקולגן באמצעות חומר כימואטרקטיבי כדי להשרות פלישה של תאים בודדים מהספרואיד החוצה אל המטריקס שסביבו. ניתן לצלם ספרואידים מקובעים המוטמעים בקולגן באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר כדי לכמת את המרחק ומספר התאים הפולשים, או באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסנציה כדי להדמיאן את המבנים הפולשים שנוצרו על ידי התאים המהגרים.

חשוב להקצות זמן מספיק לתאים כדי להתרכז לספרואידים יציבים מבחינה מבנית, חסונים מספיק כדי לאפשר מניפולציה ללא פירור, וניתנים לאספירה קלה לצורך שימוש בניסויים המשכיים. ניתן להתאים את פרוטוקול גידול התאים שלנו למגוון ניסויי ביולוגיה של התא. לדוגמה, השקעת התאים בתוככי גידול המועשרו בריכוזים גבוהים של מתילצלולוז יכולה לשמש להערכת עמידות תאית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו מייצרים ספרואידים תאיים תלת-ממדיים על ידי אגרגציה, אשר יהוו כלי בעל ערך ליישומים רבים בביולוגיה של התא.