שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

קריין: המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר ביעילות כמויות גדולות של ספרואידים תאיים חזקים על ידי צבירת תאים לשימושם במגוון בדיקות מבוססות תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא משתמשת במטריצה מסיסה במים שאינה חלבונית לצבירת תאים והיווצרות ספרואידים, המאפשרת בידוד קל ומהיר של הספרואידים. שיטה זו יכולה לעזור לצבור תובנות חדשות בביולוגיה של התא לגבי ההשפעות של אינטראקציות תא-תא ותא / מטריצה על צמיחת רקמות במיקרו-סביבה תלת מימדית.

קריין: לפני הכנת האגרגטים, מחממים 50 מיליליטר מים טהורים במיוחד ל-80 מעלות צלזיוס, ומוסיפים 10 גרם אבקת מתיל צלולוז. מערבבים את המתלה עד שהחלקיקים מתפזרים באופן שווה. לאחר מכן הוסיפו מים קרים אולטרה-טהורים לנפח סופי של 100 מיליליטר, ואחסנו את החלקיקים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה הופכת צלולה וצבעה קש ללא מוצקים נראים לעין.

העבירו את התמיסה דרך פילטר של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר שברים לא מומסים, ודללו 1:5 מיליגרם למיליליטר מהתמיסה המסוננת במדיום התרבות המתאים. לאחר מכן מסננים את המדיום בתוספת מתיל צלולוז דרך מסננת של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית, שטפו תת-תרבית משולבת של 70% עם PBS, והצמידו את התאים עם שלושה מיליליטר של מאגר אסוציאציה של טריפסין-EDTA באינקובטור תרבית תאים.

לאחר מספר דקות, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10. כאשר התאים התרוממו מהצלחת, נטרלו את התגובה עם שבעה מיליליטר של מדיום תרבית בתוספת סרום. העבירו את תמיסת התא לצינור טרי של 15 מיליליטר, ולאחר מכן אספו את התאים המשוחררים על ידי צנטריפוגה.

הסיבה השכיחה ביותר להיווצרות ספרואידים לא מוצלחת, מלבד חלקיקים מזהמים, היא השימוש בריכוזים לא אופטימליים של מתיל צלולוז או סרום לצבירה וצמיחה של קו התאים הספציפי שלך. קריין-באמצעות מיקרופיפטה P1000 עם קצה מסנן, טריטו את המזרן שלוש עד חמש פעמים עם מיליליטר אחד של מדיום היווצרות הכדורים, לחצו את קצה הפיפטה על תחתית הצינור בזווית קלה, תוך כדי פיפטה איטית מבלי להוציא את כל תכולת הקצה כדי לשקף את הגלולה. לאחר הספירה, יש לדלל את תרחיף התאים לריכוז של 10 פעמים 10 עד הרביעי למיליליטר, ולשטוף מאגר פיפטה רב-ערוצי סטרילי במים אולטרה-טהורים מסוננים כדי להסיר אבק וסיבים.

הוצא את התאים למאגר והשתמש בקצות סינון כדי להעביר 100 מיקרוליטר מהתאים לכל באר של צלחת דוחה תאים בתחתית U של 96 בארות, תוך ערבוב תרחיף התאים מעת לעת כדי למנוע מהתאים להתיישב לתחתית המאגר. כאשר כל התאים התיישבו, הניחו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה ובדקו את הבארות מדי יום לאיתור היווצרות ספרואידים. התאים צריכים להתיישב בתחתית כל באר תוך שש שעות, ובדרך כלל להצטבר לספרואיד תוך 24 עד 48 שעות.

כדי לאשר את היווצרות הספרואיד המוצלח, השתמש בקצה P10 מתחת למיקרוסקופ אור כדי להעביר בעדינות מדיום פיפטה מעל הספרואיד. ספרואידים שנוצרו כהלכה ישתחררו מהצלחת ויתגלגלו, ויאשרו את המבנה התלת-ממדי שלהם. כדי להטמיע את הספרואידים בקולגן, השתמש בפיפטינג הפוך כדי לצפות באופן שווה את החלק התחתון של כל באר של שקופית תא תרבית רקמות של שמונה בארות עם מינימום של 50 מיקרוליטר של קולגן מנוטרל לבאר.

לאחר שכל הבארות כוסו, הנח את מגלשת התא בצלחת תרבית רקמה בגודל 35 מילימטר מלאה במים טהורים במיוחד לתוך צלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ ודגירה על צלחת תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ ב-37 מעלות צלזיוס למשך כשעה. כאשר הקולגן התפלמר, השתמש בקצה מסנן P1000 כדי להעביר בזהירות את הספרואידים המוכנים מראש לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. חיוני לדגור את שכבות הבסיס של הקולגן עד לפילמור מלא, כדי למנוע הפרעה לקולגן בעת הוספת הספרואידים או המדיום.

קריין אסוף את הספרואידים שנקטפו במיקרו צנטריפוגה על השולחן, והשתמש בפיפטה P200 כדי להסיר את הסופרנטנטים, תוך נידוף כל עודף סופרנטנט על ידי היפוך צינור על מגבת נייר נקייה לפי הצורך. בעזרת קצה פיפטה P200 רחב קדח, השעו מיד מחדש את הספרואידים ב-50 מיקרוליטר קולגן מנוטרל והעבירו בזהירות את תערובות הקולגן הספרואידיות לכל באר של שקופית תא תרבית הרקמות של שמונה הבאר. מחזירים את השקופית לחממה עד שהקולגן מתפלמר.

לאחר כשעה, הוסיפו לאט לאט לפחות 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית מחומם המכיל את הטיפול המתאים המעניין לכל באר לדגירה נוספת. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לרכוש קטעי הדמיה אופטיים דרך הספרואידים הפולשים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור ספרואידים ממגוון קווי תאים.

בתנאי הטיפול המתאימים, התאים הבודדים מתיישבים ונצמדים זה לזה במרכז הבאר ליצירת ספרואידים עם היצמדות מינימלית לקרקעית הבאר. קווי תאים מסוימים מסוגלים להיצמד ללוחות דוחי תאים בהיעדר או בריכוזים נמוכים של מתיל צלולוז, וכתוצאה מכך נוצר ספרואיד המוקף בשכבה חד-שכבתית של תאים. באופן כללי, ריכוזים גבוהים יותר של מתיל צלולוז מונעים מהתאים להיצמד לבאר.

אך ריכוז גבוה מדי של מתיל צלולוז מפחית את הידבקות התא לתא, ומונע מהתאים להתיישב לקרקעית הבאר, וכתוצאה מכך נוצרים אגרגטים רופפים וספרואידים לווייניים רבים. ניתן לטפל בספרואידים משובצים בקולגן באמצעות חומר כימואטרקטיבי כדי לגרום לפלישה של תאים בודדים החוצה מהספרואיד למטריצה שמסביב. ניתן לדמות ספרואידים משובצים בקולגן קבוע על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לכמת את המרחק ומספר התאים הפולשים, או על ידי מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי כדי לדמיין את המבנים הפולשניים שנוצרו על ידי התאים הנודדים.

חשוב לאפשר לתאים מספיק זמן להצטבר לספרואידים בריאים מבחינה מבנית שהם חזקים מספיק למניפולציה שלהם ללא פיצול, ושניתן לאסוף אותם בקלות לשימושם במבחנים הבאים. ניתן להתאים את פרוטוקול צמיחת התאים שלנו למבחני ביולוגיה תאיים מרובים. לדוגמה, ניתן להשתמש בהושבת התאים במדיומים בתוספת ריכוזים גבוהים של מתיל צלולוז כדי להעריך עמידות תאית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספרואידים תלת מימדיים של תאים על ידי צבירה, אשר יהווה כלי רב ערך עבור יישומים רבים בביולוגיה של התא.