ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב Xenopus טרופי
May 25th, 2017
פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את כלי הדם של ראשנים של Xenopus tropicalis. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הקרדיווסקולרית כגון כיצד מווסתת אנגיוגנזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין כלי דם בעובר שלם מסוג באר על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי פשוטה.
התחל בשימוש במעמיס מיקרו למילוי מיקרו פיפטה מזכוכית מחודדת בכחמישה מיקרוליטרים של תמיסת LDL שקופה diI אצטילית, תוך הקפדה שלא נטענים חלקיקים משקעים. תחת מיקרוסקופ מנתח השתמש בזוג עדין של מלקחיים מספר 55 כדי לחתוך את קצה הפיפטה כדי להתאים את נפח הקומפלקס שהועלה ולהגדיר את מערכת ההזרקה המבוקרת בלחץ לפלוט כחמישה ננו ליטר תמיסה בכל זריקה. לאחר מכן טבלו את קצה הפיפטה ב-0.04%MS-222 במי מלח או MBS שהשתנו פי 0.1 בתבנית סילגארד בהתאמה אישית.
לאחר מכן, העבירו את עובר Xenopus tropicalis לתבנית Sylgard ואשרו טשטוש מלא עם חוסר תגובה לגירוי סנפיר הגב. תחת עומס המיקרוסקופ המנתח, הצד הגחוני של העובר כלפי מעלה לתוך השקע בצורת V של התבנית במצב מעט אלכסוני. התקן היטב שני סיכות זעירות של 0.1 מילימטר למחזיק סיכה והשתמש בסיכה אחת כדי לנקב את העור מעל הלב שאמור להיות פועם באופן גלוי.
הכנס את הסיכה דרך החור בחלל שבין הלב לעור מבלי לנקב את הלב ומקם את הקצה המוחדר בתוך האזור בו יבוצע החתך. לאחר מכן שפשפו את הסיכה השנייה על הסיכה המוכנסת כדי לבצע חתך ליניארי והשתמשו בשני הסיכות יחד כדי להרחיב בעדינות את החתך, ולחשוף את הלב. כדי להזריק את תמיסת ה-LDL האצטילית DiI, הכנס את קצה פיפטת הזכוכית ללב והזריק 50 עד 60 ננו ליטר של ה-LDL האצטיל DiI בכ-10 פעימות פליטה.
לאחר שכל תמיסת הצבע נמסרה יש לוודא שהלב עדיין פועם ולהעביר את העובר לצלחת פטרי חדשה המכילה 0.1X MBS. לאחר חמש עד 10 דקות הראשן אמור להתאושש מההרדמה ולהתחיל לנוע. לאחר הזרקת מספר מתאים של עוברים, סנן ויזואלית את העוברים המורדמים המסומנים כהלכה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והשליך את כל בעלי החיים שיש להם איברים אחרים מסומנים.
ניתן להזריק שוב עוברים שלא סומנו מספיק. לאחר מכן צלמו תמונות של העוברים המסומנים כהלכה. להדמיה יסודית יותר של כלי הדם, יש לתקן עוברים מורדמים ב-4% פרפורמלדהיד למשך שעה בטמפרטורת החדר המוגנים מאור להדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית.
אם מוזרקת כמות מספקת של LDL אצטיל diI ללב, הווריד הקרדינלי האחורי, או PCV, אמור להיות גלוי מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוורידים הבין-סומיטיים, או ISV's, יוצאים בגב מה-PCV בגל קדמי לאחורי החל משלב 36 ומסתיים בסביבות שלב 40 עד 41 והופכים מסתעפים קלות סביב שלב 43. ה-PCV וה-ISV גדלים בדפוס אנגיוגני סטריאוטיפי שנמצא תחת שליטה התפתחותית הדוקה.
מעניין שהפלת איתות TIE-2 על ידי מורפלינוס אנטיסנס מקטינה את האורך והמורכבות של ISV בעוד שביטוי הצורה הפעילה מבחינה קונסטיטוציונלית של TIE-2 גורם להסתעפות ISV מוגזמת. ניתן לחשב מדד מורכבות ורידים כדי להעריך את המורכבות של ISV וניתן ליצור נתיבים מעובדים כדי לדמיין את הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם העובריים Xenopus tropicalis. הפרוטוקול המקורי תואר לשימוש ב-Xenopus laevis על ידי לוין וקוליקס והתאמנו אותו ל-Xenopus tropicalis.
לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. לפני הליך זה, ניתן לבצע מניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו גנים ומסלולי איתות מווסתים את התפתחות כלי הדם. באמצעות הליך זה ניתן לדמות את כלי הדם המסומנים בבעל חיים שלם בזמן אמת, ומספק כלי רב עוצמה לחקירת הדינמיקה של התפתחות כלי הדם.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק LDL אצטילציה diI ללב ראשן Xenopus tropicalis כדי לדמיין את כלי הדם שלו.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת פלואורסצנציה לדמיית מערכת כלי הדם וכימות המורכבות שלה ב-Xenopus tropicalis. הטכניקה מאפשרת הדמיה של כלי דם זמן קצר לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי ללב העובר, ומקלה על מחקרים בנושא התפתחות מערכת הלב וכלי הדם in vivo.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- אנגיוגנזה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- Xenopus tropicalis הוא אורגניזם מודל לחקר התפתחות בעלי חוליות.
- הבנת התפתחות כלי הדם היא חיונית להבנה של מחלות שונות.
- טכניקות הדמיה פלואורסצנטית משפרות את ויזואליזציה של מבנים ביולוגיים.
- שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על שינויים בכלי הדם.
מטרת המחקר
- לדמיין את מערכת כלי הדם של ראשנים של Xenopus tropicalis.
- לחקור את ויסות האנגיוגנזה.
- לספק שיטה פשוטה ויעילה לחקר התפתחות מערכת הלב וכלי הדם.
שיטות בהן נעשה שימוש
- הזרקת צבע פלואורסצנטי ללב העובר.
- שימוש במטען מיקרו ובמיקרו פיפטת זכוכית מחודדת למסירה מדויקת של הצבע.
- ויזואליזציה של כלי דם תחת מיקרוסקופ פירוק.
- יישום של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות לחקר השפעות על מערכת כלי הדם.
תוצאות עיקריות
- דמייה מוצלחת של כלי דם בעובר שלם.
- כימות מורכבות כלי הדם שהושג באמצעות הדמיה.
- תובנות שהושגו לגבי הדינמיקה של התפתחות מערכת הלב וכלי הדם.
- הוכחה ליעילות שיטת הזרקת הצבע הפלואורסצנטי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לחקר התפתחות כלי הדם.
- הדמיה פלואורסצנטית היא כלי רב עוצמה לניתוח בזמן אמת.
- גישה זו יכולה להקל על מחקר נוסף בביולוגיה קרדיווסקולרית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
