ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב Xenopus טרופי
25 במאי 2017
פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את כלי הדם של ראשנים של Xenopus tropicalis. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הקרדיווסקולרית כגון כיצד מווסתת אנגיוגנזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין כלי דם בעובר שלם מסוג באר על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי פשוטה.
התחל בשימוש במעמיס מיקרו למילוי מיקרו פיפטה מזכוכית מחודדת בכחמישה מיקרוליטרים של תמיסת LDL שקופה diI אצטילית, תוך הקפדה שלא נטענים חלקיקים משקעים. תחת מיקרוסקופ מנתח השתמש בזוג עדין של מלקחיים מספר 55 כדי לחתוך את קצה הפיפטה כדי להתאים את נפח הקומפלקס שהועלה ולהגדיר את מערכת ההזרקה המבוקרת בלחץ לפלוט כחמישה ננו ליטר תמיסה בכל זריקה. לאחר מכן טבלו את קצה הפיפטה ב-0.04%MS-222 במי מלח או MBS שהשתנו פי 0.1 בתבנית סילגארד בהתאמה אישית.
לאחר מכן, העבירו את עובר Xenopus tropicalis לתבנית Sylgard ואשרו טשטוש מלא עם חוסר תגובה לגירוי סנפיר הגב. תחת עומס המיקרוסקופ המנתח, הצד הגחוני של העובר כלפי מעלה לתוך השקע בצורת V של התבנית במצב מעט אלכסוני. התקן היטב שני סיכות זעירות של 0.1 מילימטר למחזיק סיכה והשתמש בסיכה אחת כדי לנקב את העור מעל הלב שאמור להיות פועם באופן גלוי.
הכנס את הסיכה דרך החור בחלל שבין הלב לעור מבלי לנקב את הלב ומקם את הקצה המוחדר בתוך האזור בו יבוצע החתך. לאחר מכן שפשפו את הסיכה השנייה על הסיכה המוכנסת כדי לבצע חתך ליניארי והשתמשו בשני הסיכות יחד כדי להרחיב בעדינות את החתך, ולחשוף את הלב. כדי להזריק את תמיסת ה-LDL האצטילית DiI, הכנס את קצה פיפטת הזכוכית ללב והזריק 50 עד 60 ננו ליטר של ה-LDL האצטיל DiI בכ-10 פעימות פליטה.
לאחר שכל תמיסת הצבע נמסרה יש לוודא שהלב עדיין פועם ולהעביר את העובר לצלחת פטרי חדשה המכילה 0.1X MBS. לאחר חמש עד 10 דקות הראשן אמור להתאושש מההרדמה ולהתחיל לנוע. לאחר הזרקת מספר מתאים של עוברים, סנן ויזואלית את העוברים המורדמים המסומנים כהלכה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והשליך את כל בעלי החיים שיש להם איברים אחרים מסומנים.
ניתן להזריק שוב עוברים שלא סומנו מספיק. לאחר מכן צלמו תמונות של העוברים המסומנים כהלכה. להדמיה יסודית יותר של כלי הדם, יש לתקן עוברים מורדמים ב-4% פרפורמלדהיד למשך שעה בטמפרטורת החדר המוגנים מאור להדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית.
אם מוזרקת כמות מספקת של LDL אצטיל diI ללב, הווריד הקרדינלי האחורי, או PCV, אמור להיות גלוי מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוורידים הבין-סומיטיים, או ISV's, יוצאים בגב מה-PCV בגל קדמי לאחורי החל משלב 36 ומסתיים בסביבות שלב 40 עד 41 והופכים מסתעפים קלות סביב שלב 43. ה-PCV וה-ISV גדלים בדפוס אנגיוגני סטריאוטיפי שנמצא תחת שליטה התפתחותית הדוקה.
מעניין שהפלת איתות TIE-2 על ידי מורפלינוס אנטיסנס מקטינה את האורך והמורכבות של ISV בעוד שביטוי הצורה הפעילה מבחינה קונסטיטוציונלית של TIE-2 גורם להסתעפות ISV מוגזמת. ניתן לחשב מדד מורכבות ורידים כדי להעריך את המורכבות של ISV וניתן ליצור נתיבים מעובדים כדי לדמיין את הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם העובריים Xenopus tropicalis. הפרוטוקול המקורי תואר לשימוש ב-Xenopus laevis על ידי לוין וקוליקס והתאמנו אותו ל-Xenopus tropicalis.
לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. לפני הליך זה, ניתן לבצע מניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו גנים ומסלולי איתות מווסתים את התפתחות כלי הדם. באמצעות הליך זה ניתן לדמות את כלי הדם המסומנים בבעל חיים שלם בזמן אמת, ומספק כלי רב עוצמה לחקירת הדינמיקה של התפתחות כלי הדם.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק LDL אצטילציה diI ללב ראשן Xenopus tropicalis כדי לדמיין את כלי הדם שלו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת פלואורסצנציה להדמיית כלי הדם ולכימות המורכבות שלהם ב-Xenopus tropicalis. הטכניקה מאפשרת הדמיה של כלי דם זמן קצר לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי ללב העובר, ובכך מקלה על מחקרים של התפתחות מערכת הלב וכלי הדם in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם
- אנגיוגנזה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- Xenopus tropicalis הוא אורגניזם מודל לחקר התפתחות חולייתנים.
- הבנת ההתפתחות הווסקולרית היא קריטית להשגת תובנות לגבי מחלות שונות.
- טכניקות של דימוי פלואורסצנטי משפרות את הוויזואליזציה של מבנים ביולוגיים.
- שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על שינויים וסקולריים.
מטרת המחקר
- להדמיית כלי הדם של ראשני *Xenopus tropicalis*.
- לחקירת הוויסות של תהליך האנגיוגנזה.
- לספק שיטה פשוטה ויעילה לחקר התפתחות מערכת הלב וכלי הדם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת צבע פלואורסצנטי ללב העובר.
- שימוש במיקרו-טוען (micro loader) ובמיקרו-פיפטת זכוכית מחודדת להחדרה מדויקת של הצבע.
- הדמיה של כלי דם תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
- יישום מניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות לבדיקת השפעות על מערכת כלי הדם.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של כלי דם בעוברים שלמים.
- כימות של מורכבות כלי הדם שהושג באמצעות דימיון.
- תובנות שנרכשו על הדינמיקה של התפתחות מערכת הלב וכלי הדם.
- הוכחת יעילותו של שיטת ההזרקה של הצבע הפלואורסצנטי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר התפתחות כלי דם.
- דימות פלואורסצנטי הוא כלי רב עוצמה לניתוח בזמן אמת.
- גישה זו יכולה לסייע במחקרים נוספים בביולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה וכימות של מורכבות כלי דם במודל של חולייתן, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים במסלולי אנגיוגנזה. באמצעות אספקת נתונים כמותיים של ניצבי כלי דם ופיצולים, היא מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות וסקולריות לפני המעבר למסעות של זיהוי מובילים. מערכת ה-Xenopus tropicalis מציעה פלטפורמה רלוונטית למחלות להערכת פנוטיפים אנגיוגניים עם ביטחון ניבוי במחקר קרדיווסקולרי פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוגע לווסתים אנגיוגניים, כגון סיגנלינג של TIE-2, באמצעות תצפית ישירה על דפוסי ניצני כלי דם.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה מהיר של שבוע אחד להערכת השפעת גנים או מסלולים על התפתחות כלי דם, ללא צורך במודלים מהונדסים גנטית.
- ערך ניבוי: תוצרים כמותיים, כגון מדד מורכבות הווריד (Vein Complexity Index), תומכים בהערכה אובייקטיבית של השפעות המודולציה של המטרה לצורך קבלת החלטות במיון הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר סימון כלי דם סטנדרטי וניתן לשחזור, התואם לצנרת דימות וניתוח במורד הזרם.
- תוצר כמותי: מאפשר מדידה של אורך הווריד הבין-סגמנטי (intersomitic vein) ומורכבות ההסתעפות כמדדים התגובים למינון עבור סריקת תרכובות.
- יכולת הרחבה: הליך פשוט של הזרקת צבע ודימות תומך בהערכה של רמה בינונית (medium-throughput) של הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל אנגיוגנזה סטראוטיפית ב-Xenopus tropicalis, ומספק תובנות לגבי מסלולי התפתחות כלי הדם בבני אדם.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאי גילוי מוקדמים לתיקוף פרה-קליני באמצעות מנגנונים אנגיוגניים שמורים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר בדיקה מהירה של מודולטורים של מסלולים כדי להבהיר את הביולוגיה של המטרה לפני השקעה במחקרי מודלים של יונקים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת נתונים על פנוטיפ וסקולרי המנחים החלטות של המשכה או הפסקת הפיתוח (go/no-go) בתוכניות המתמקדות באנגיוגנזה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבירור מסלולים על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לשינויים כמותיים בארכיטקטורה של כלי הדם.
- סריקה: מספק תוצאות הדימות הניתנות לשחזור, המתאימות להערכת השפעות של תרכובות על ניצות אנגיוגניות.
- אנליטיקה: מספק מדדים כמותיים של מורכבות כלי דם המאפשרים השוואה אובייקטיבית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: ממנף מנגנוני אנגיוגנזה שמורים כדי לתמוך ברציפות ממודלים עובריים למערכות כלי דם של יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית להפנוטיפינג של כלי דם, הישימה בפרויקטים מרובים של מטרות אנגיוגנזה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות אנגיוגניות באמצעות ויזואליזציה כמותית וישירה של רשתות כלי דם.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת כלי דם באמצעות הזרקת צבע פשוטה והדמיה הניתנת לשחזור, דבר הממזער את השונות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות וסקולריות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים של תוכניות קרדיו-וסקולריות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של משני אנגיוגנזה בהתבסס על תוצאות פנוטיפיות כמותיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות לטיפול בעובריות ולהזרקה מיקרוסקופית ללב.
- תלוי בתשתיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך ויזואליזציה של כלי דם ולכידת תמונות.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי התפתחות העובר ותזמון ההזרקה כדי להבטיח סימון כלי דם עקבי.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הממצאים למערכות מודל אחרות או להקשרים של רלוונטיות אנושית.
- מגבלות מעשיות כוללות הסתמכות על נגישות העוברים והצורך באופטימיזציה קפדנית של ריכוז הצבע כדי למנוע סימון לא ספציפי.
