Dissection, תרבות וניתוח של

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין תרבית תאים ראשונית של תאי רשתית של xenopus. הדבר מבוצע תחילה על ידי הסרת הרקמות המקיפות כדי לחשוף את הרשתית. השלב השני הוא חיתוך רקמת הרשתית.

בשלב הבא, רקמת הרשתית מופרדת לתאים בודדים. השלב הסופי הוא זריעת תאי הרשתית על צלחת UnCloned והוספת flu oh 4:00 AM לצורך דימוי סידן. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לזהות פעילות סידן בתרבית תאי הרשתית.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, הנוירוביולוגיה והביולוגיה התאית, כגון תפקידם של הסידן והפעילות החשמלית בהתפתחות הרשתית, כמו גם ביטוי גנים ברמה של תא בודד. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בפרוצדורה זו יתקלו בקשיים, מכיוון שנדרשת מוטוריקה עדינה לצורך ביצוע דיסקציות מדויקות ובזמן. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הדיסקציה הם מורכבים ודורשים תיאום עין-יד מדויק.

כדי להתחיל את הפרוצדורה בתוך המCחלוץ, הכינו וסמנו את הפריטים הבאים: צלחת פטרי פלסטית אחת בקוטר 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר מצע גידול תאים, שתשמש כצלחת ניתוח. באופן רשות, ניתן להוסיף לצלחת הניתוח 10 מיליגרם collagenase B כדי להגיע לריכוז סופי של 1.0 מיליגרם למיליליטר, במטרה לסייע בהפרדת שכבות הרקמה בעת ניתוח של עוברי שלב 25 או שלבים מוקדמים יותר.

בנוסף, הכינו צלחת השתקפות של 35 מילימטר המכילה 2 מיליליטר מצע גידול לתאים, שתשמש כצלחת תרבית. הכינו שפופרת מיקרוצנטריפוגה ריקה של 1.5 מיליליטר שתשמש כשפופרת לפירוק האקספלאנט (explant) ושפופרת פאלקון קונית של 15 מיליליטר המכילה 15 מיליליטר.

מדיום לתרבית תאים. לאחר מכן, הכין שתי צלחות פטרי פלסטיק בקוטר 35 מילימטר המכילות 2 מיליליטר CMF לצורך הדיסקציה, אחת שתשמש כצלחת לפירוק האקספלנט (explan dissociation plate), והשנייה כצלחת לשטיפת האקספלנט מחוץ למCב. הכן שתי צלחות פטרי פלסטיק בקוטר 60 מילימטר המכילות 10 מיליליטר.

0.1 XMMR, אחד ישמש כלוחית החזקה, השני כלוחית אחות, וצלחת פטרי פלסטיק אחת נוספת בקוטר 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר 0.1 XMMR בתוספת 0.5 מיליגרם למילילטר MS 2 22. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר 5% tripsin ב-CMF ללוחית הדיסוציאציה של האקספלנט.

סובבו את המבחנה לערבוב, ולאחר מכן הניחו בצד. כעת, המשיכו לניתוח באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, תוך שימוש בשני זוגות של פינצטות עדינות. בצעו חתך סגיטלי מרכזי בצד הוונטרלי של העובר, החל מהקצה האחורי, והמשיכו דרך בלוטת הסימנט (cement gland) בחלק הקדמי של העובר.

פתחו בזהירות את העובר על ידי הרחבה של שני צדי החתך. פעולה זו תביא לכך שהצד הגבי של העובר יפנה כלפי לוח הניתוח. לאחר מכן, פתחו את האקטודרמה הבנטרלית כדי לחשוף את האנדודרמה והמזודרמה.

בשלב הבא, הסירו את האנדודרם והמזודרם, שהם השכבה הראשונה והגדולה ביותר של רקמה זו. האנדודרם בעל מראה מאוד פלומי, עם תאים גדולים וארגון שאינו ניכר. לאחר הסרת שכבה זו, הסומיטים וה-Noor יהיו גלויים.

לשיפור הניגודיות, העבירו את העובר לפיתרי (Petri dish) פלסטיק נפרד בנפח 60 מילימטר המכיל 10 מיליליטר של מצע לתרבית תאים ו-100 מיקרוליטר של תמיסת Nile blue sulfate בריכוז 1%, והדגירו למשך שתי עד שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו אותו בחזרה לצלחת הדיסקציה. פעולה זו תצבע את האקטודרם, הסומריטים ואת ה-Noor כדי להקל על הזיהוי וההתמצאות.

תוך התמקדות בחלק הקדמי של העובר, הסירו בזהירות את ה-Noor ואת שאריות המזoderm כדי לחשוף את המוח ואת השקיקים האופטיים. לאחר שהמוח והשקיקים האופטיים נחשפו לחלוטין, השתמשו בפינצטה כדי לחתוך את צינור העצבים ואת האקטודרם שמתחתיו, מיד מאחורי המוח. הפכו חלק זה כך שהאקטודרם יהיה למעלה.

יש לנקוט בזהירות כדי למנוע פגיעה בבקעות האופטיות (optic vesicles) שמתחתיהן, ולהסיר בזהירות את האקטודרמה. לבסוף, הפרד את הבקעות האופטיות מהמוח באמצעות פינצטה במידה ומדובר בעובר השלים שלב 25. ראשית, הסר את החלק הוונטרלי של העובר באמצעות פינצטה בלוח ההרדמה.

לניגודיות טובה יותר, העבירו את העובר לצלחת פטרי פלסטית של 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר של 0.1 XMMR ו-100 מיקרוליטר של 1% Nile blue sulfate למשך שתי עד שלוש דקות כדי לצבוע את האקטודרם. לאחר מכן העבירו אותו ללוח הדיסקציה. לאחר מכן, תוך כדי החזקת העובר במקומו, הסירו בזהירות את הרשתית או את השקיק האופטי הנמצאים ישירות מתחת לאקטודרם העוטף.

לאחר השלמת הדיסקציה של שלפוחית העין (optic vesicle) או הרשתית, העבירו אותה בזהירות ללוח שטיפת ה-X explan באמצעות מיקרופיפט P 100 עם טיפ עמיד לארטוזולים. הימנעו ממגע של הרקמה עם ממשקי אוויר-נוזל. לאחר מכן, המתינו 30 שניות.

שעתה, העבירו 80 µL של 0.1% trypsin ב-CMF מלוח הפירוק של הרקמה (explan dissociation plate) אל מבחנה הפירוק של הרקמה. לאחר מכן, העבירו את הרשתית או את השלפוחית האופטית מלוח השטיפה של הרקמה אל מבחנה הפירוק של הרקמה. יש להימנע מהעברת תמיסת השטיפה של הרקמה.

לאחר מכן, יש להמתין שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לרקמה להתפרק בתוך מבחנת הפירוק של האקספלאנט. אם בכוונתכם לצלם מספר תמונות של התאים במהלך הניסוי, הצמידו רשת לצד התחתון של פלטת התרבית בעזרת טיפות קטנות של דבק מהיר. פעולה זו תאפשר צילום של תאים זהים באוריינטציות זהות בנקודות שונות במהלך הליך זריעת התאים.

ראשית, הוצאו באיטיות 40 µL מהתמיסה משפופרת הדיסוציאציה של ה-explan והשליכו אותה. לאחר מכן, השתמשו ב-P 100 עם טיפ עמיד לארוסולים כדי להעביר את התאים באיטיות לצלחת התרבית. בעת שאיבת התאים אל הצלחת, בצעו פיפטור באיטיות ושמרו את התאים בשטח קטן במרכז הצלחת.

איור זה מציג דוגמה לפעילות הסידן של תא בודד במהלך שעת דימות אחת. איורים אלו מספקים תוצאות מייצגות של ניסויי דימות סידן בתאי רשתית עובריים, כפי שנותחו בשלבים התפתחותיים שונים. בקצרה, התוצאות מראות כי הסידן מוסדר התפתחותית עם שיאי פריקה (spiking peaks) בשלב 35, במונחים של מתאם בין פעילות הסידן לבין תאים חיוביים לגשש ספציפי.

בניסויים בדגים, למרות שלא נמצאו הבדלים מובהקים סטטיסטית, נצפתה מגמה שבה תאים חיוביים לסמן GABAergic הראו רמות גבוהות יותר של פעילות calcium spiking מאשר תאים חיוביים לסמן glutamatergic או לקידוד של הגן PT F1 A.A, גורם שעתקת הקשור לקידום הפנוטיפ GABAergic. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בערך שלושה וחצי שעות עבור פלטה אחת, בביצוע נכון. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון תרביות תאים, C two hybridization או הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו תאים מביעים סמנים פנוטיפיים ספציפיים, או כדי לנתח הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הדיסקציה של רקמת רשתית, פירוק רקמת הרשתית לתאים בודדים (dissociation) והזרעת תאי רשתית על פלטה.