Dissection, תרבות וניתוח של Xenopus laevis רקמת רשתית עוברית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תרבית תאים ראשונית של תאי רשתית קסנופוס. זה מושג על ידי הסרת הרקמות שמסביב כדי לחשוף את הרשתית. השלב השני הוא כריתת רקמת רשתית.

לאחר מכן, רקמת הרשתית מתפרקת לתאים בודדים. השלב האחרון הוא צלחת תאי רשתית על צלחת לא משובטת והוספת שפעת הו 4:00 בבוקר להדמיית סידן. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לאיתור פעילות סידן בתרבית תאי רשתית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, הנוירוביולוגיה והביולוגיה של התא, כגון תפקיד הסידן והפעילות החשמלית בהתפתחות הרשתית, כמו גם ביטוי גנים ברמת התא הבודד. בדרך כלל, אנשים חדשים בהליך זה יתקשו מכיוון שתנועות מוטוריות עדינות נחוצות לנתיחות בזמן ומדויקות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הדיסקציה קשים מכיוון שתנועות עין-יד מורכבות חיוניות.

כדי להתחיל בהליך זה בתוך מכסה המנוע, הכינו ותייגו את הדברים הבאים, צלחת פטרי אחת מפלסטיק בגודל 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר. מדיום תרבית תאים שישמש כצלחת דיסקציה. לחלופין, ניתן להוסיף 10 מיליגרם קולגנאז B לצלחת הדיסקציה לריכוז סופי של 1.0 מיליגרם למיליליטר כדי לסייע בהפרדת שכבת הרקמה לדיסקציה של עוברים בשלב 25 ומטה.

כמו כן, הכינו צלחת משטח 1 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר. מדיום תרבית תאים שישמש כצלחת תרבית. צינור מיקרו צנטריפוגה ריק אחד בנפח 1.5 מיליליטר שישמש כצינור דיסוציאציה וצינור בז חרוטי אחד בנפח 15 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר.

מדיום תרבית תאים. לאחר מכן הכינו 2 צלחות פטרי מפלסטיק בגודל 35 מילימטר המכילות שני מיליליטר, CMF לדיסקציה, האחת תשמש כצלחת דיסוציאציה אקספלן, השנייה כצלחת שטיפה X explan מחוץ למכסה המנוע. הכינו שתי צלחות פטרי מפלסטיק בגודל 60 מילימטר המכילות 10 מיליליטר.

0.1 XMMR, האחד שישמש כלוחית אחיזה, השני כצלחת אחים, ועוד צלחת פטרי מפלסטיק 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר, 0.1 XMMR ועוד 0.5 מיליגרם למיליליטר. MS 2 22. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר, 5% טריפסין ב-CMF ללוחית הדיסוציאציה של האקספלן.

מערבבים לערבב ואז מניחים בצד. לאחר מכן, המשך בדיסקציה באמצעות טווח ניתוח, באמצעות שני זוגות מלקחיים עדינים. בצע חתך אמצע סגיטלי בצד הגחון של העובר החל מהקצה האחורי, והמשך דרך בלוטת המלט בחלק הקדמי של העובר.

פתח בזהירות את העובר על ידי פיזור שני צידי החיתוך. התוצאה היא שהצד הגבי של העובר פונה ללוחית הדיסקציה. לאחר מכן פתח את האקטודרם הגחוני כדי לחשוף את האנדודרם והמזודרם.

לאחר מכן, הסר את האנדודרם והמזודרם את השכבה הראשונה והגדולה ביותר של רקמה זו. האנדודרם רך מאוד במראה עם תאים גדולים ומעט ארגון ברור. לאחר הסרת שכבה זו, הסומיטים והנור יהיו גלויים.

לקבלת ניגודיות טובה יותר, העבירו את העובר לצלחת פטרי פלסטיק נפרדת בגודל 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר, מדיום תרבית תאים ו-100 מיקרוליטר של תמיסה של 1% של סולפט כחול הנילוס ודגרו במשך שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו אותו בחזרה ללוחית החיתוך. זה יכתים את האקטודרם, הסומיטים והנור לזיהוי והתמצאות קלים יותר.

תוך התמקדות בחלק הקדמי של העובר, הסר בזהירות את הנור וכל מזודרם שנותר כדי לחשוף את המוח ושלפוחיות הראייה. ברגע שהמוח ושלפוחיות הראייה חשופים לחלוטין, השתמשו במלקחיים כדי לנתק את הצינור העצבי ואת האקטודרם הבסיסי ממש אחורי למוח. הפוך את החלק הזה כך שהאקטודרם יהיה למעלה.

היזהר כדי להימנע מפגיעה בשלפוחיות האופטיות הבסיסיות והסר בזהירות את האקטודרם. לבסוף, הפרד את השלפוחיות האופטיות מהמוח בעזרת המלקחיים כדי לנתח עובר מעל שלב 25. ראשית, הסר את החלק הגחוני של העובר בעזרת מלקחיים בצלחת ההרדמה.

לקבלת ניגודיות טובה יותר, העבירו את העובר לצלחת פטרי מפלסטיק בגודל 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר, 0.1 XMMR ו-100 מיקרוליטר של 1% נילוס כחול סולפט למשך שתיים-שלוש דקות כדי להכתים את האקטודרם. לאחר מכן העבירו אותו לצלחת החיתוך. לאחר מכן החזק את העובר במקומו הסר בזהירות את הרשתית או השלפוחית האופטית הנמצאת ישירות מתחת לאקטודרם העליון.

לאחר ניתוח השלפוחית האופטית או הרשתית, העבירו אותה בזהירות לצלחת השטיפה של X explan עם מיקרו פיפטה P 100 באמצעות קצה עמיד לתרסיס. היזהר לא לאפשר לו לגעת בגבולות נוזל האוויר. לאחר מכן הניחו לאקספלן לשבת במשך 30 שניות.

לאחר מכן, העבירו 80 מיקרוליטר של 0.1% טריפסין ב-CMF מלוח הדיסוציאציה של האקספלן לצינור הדיסוציאציה של האקספלן. לאחר מכן, העבירו את הרשתית או השלפוחית האופטית מצלחת השטיפה של האקספלן לצינור הדיסוציאציה של האקספלן. הימנעות מהעברת תמיסת השטיפה של האקספלן.

לאחר מכן אפשר לרקמה להתנתק בצינור הדיסוציאציה למשך שעה בטמפרטורת החדר. אם יש לצלם מספר תמונות של התאים במהלך הניסוי, חבר רשת לחלק התחתון של לוחית התרבית עם טיפות קטנות של דבק סופר. זה יאפשר לצלם תמונות של תאים זהים בכיוונים זהים בנקודות שונות בהליך הצלחת של התאים.

ראשית, הסר לאט 40 מיקרוליטר מהתמיסה מצינור הדיסוציאציה והשליך. לאחר מכן השתמש ב-P 100 עם קצה עמיד לתרסיס כדי להעביר לאט את התאים לצלחת התרבית. כאשר שואבים את התאים לצלחת, פיפטה לאט ושמרו את התאים באזור קטן במרכז הצלחת.

איור זה מציג דוגמה לפעילות הסידן של תא בודד במשך שעה אחת של הדמיה. נתונים אלה מספקים את התוצאות המייצגות של ניסויי הדמיית סידן בתאי רשתית עובריים כפי שנותחו בשלבי התפתחות שונים. בקצרה, התוצאות מראות כי סידן מווסת התפתחותית עם שיאים מזנקים בשלב 35 במונחים של מתאם בין פעילות הסידן לתאים חיוביים לבדיקה ספציפית.

בניסויים בדגים, בעוד שלא היו הבדלים מובהקים סטטיסטית, הייתה מגמה של תאים חיוביים לסמן GABAergic להפגין רמות גבוהות יותר של פעילות זינוק סידן מאשר תאים חיוביים לסמן גלוטמטרגי או לקידוד גן PT F1 A.A, גורם שעתוק הקשור לקידום הפנוטיפ GABAergic לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשלוש שעות ו-30 דקות עבור צלחת אחת אם מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון תרבית תאים ו-C 2 הכלאה או הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו תאים מבטאים סמנים פנוטיפיים ספציפיים או לנתח הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח רקמת רשתית, לנתק רקמת רשתית ותאי רשתית צלחת.