JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis

Full Text

15,207 Views

06:51 min

May 23, 2010

DOI: 10.3791/1949-v

Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering,University of Pittsburgh, ²Developmental Biology,University of Pittsburgh

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Transcript

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים הדמיה חיה ושיטות כימות פשוטות לניתוח מורפולוגיה של תאי אפיתל עובריים. זה מושג על ידי הכנת כל הכלים והמכשירים תחילה. השלב השני של ההליך הוא להוציא את ה-X מעוברי הצפרדעים ולאחסן אותם בתאים לתרבית ארוכת טווח.

השלב השלישי של ההליך הוא איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל בזמן אמת. השלב האחרון של ההליך הוא לכמת פרטים מורפולוגיים של תאי אפיתל באמצעות תמונה J.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המציגות אזורי תאים ועוצמות ממברנה במעקב באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. היי, אני Sagar Joshi ממעבדת Davidson במחלקה לביו-הנדסה באוניברסיטת פיטסבורג.

היום נראה לך הליך להדמיית תאים חיים וניתוח כמותי של תאי אפיתל עובריים של Xenos lavia . אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור שינויים בשלד התאים בזמן אמת. אז בואו נתחיל.

להכנת תאים לטיפוח מכסי כובע לבעלי חיים, השתמש בשומן סיליקון כדי לאטום תא אקרילי מותאם אישית או מכונת כביסה קטנה מניילון לזכוכית כיסוי גדולה בגודל 45 על 50 מילימטר. הוסף מיליליטר אחד של 1% BSA בשליש XMBS לתא. מצפים שברי החלקה קטנים עם אותה תמיסה בדגירה למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס.

כדי להפחית את הידבקות ה-X לזכוכית, יש לשטוף ולמלא את התא במדיום DFA עד שרגע לפני ההעברה ב-XS, יש לשטוף את שברי החלקת הכיסוי באותו אופן. לאחר מכן טבלו אותם בצלחת של עוברי תרבית DFA שהוזרקו למיקרו בשלב תא אחד עד ארבעה עם ה-MR NA הרצוי לשלב הרצוי בשליש XMBS. השתמש בפיפטה עם פתח מלוכסן כדי להעביר את העוברים לצלחת של DFA תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח.

השתמש במלקחיים כדי לאכול את העוברים כדי לכרות צמח CapEx של בעלי חיים. השתמש בלולאת שיער כדי לתמוך בעובר בתנוחה אחת. השתמש בסכין שיער כדי לבצע חתך קטן בקוטב החיות.

בצע חתכים חלקים חוזרים ונשנים כדי להאריך את החתך ולהסיר את אקטודרם המכסה. בלו שלושה או ארבעה x הסבר באותו אופן. והשתמש בפיפטה העברה כדי להעביר אותם לתא התרבות המוכן.

באמצעות לולאת השיער מקם כל משטח X כך שהאפיתל פונה לתחתית החדר. שימוש במלקחיים. החזק שבר תלוש כיסוי במרכזו.

טובלים את הקצוות בשומן סיליקון. הניחו קטע אחד מעל כל אקספלור. מקבעים קלות כל שבר במקומו עם טיפות קטנות של שומן סיליקון.

נזהר לא לרסק את ה-X בכוח מופרז לחלוטין. מלאו את החדר ב- DFA, מצפים את הקצוות העליונים של החדר בשומן סיליקון. ואז אטום את החלק העליון עם החלקת כיסוי בגודל 24X40 מילימטר.

התאם את רמת ה-DFA בתוך החדר כדי להפחית בועות אוויר והשתמש ברקמה כדי למחוק כל הצפה. כעת ניתן לגדל את צמחי ה-X לטווח ארוך בתא האטום למשך יום בטמפרטורת החדר, להזיז את המטרה של 20x של מיקרוסקופ קונפוקלי למקומה. מקם את החדר המכיל את ה-X על במת המיקרוסקופ והנח משקולות איזון קטנות על החדר כדי להחזיק אותו במקומו תחת שדה בהיר.

התאם את המיקוד והשתמש במיקום המסלול כדי להמחיש את הקצוות האפיקליים של התאים השטחיים. עבור לפלואורסצנטיות ולמטרה בעלת הספק גבוה יותר. כדי לאסוף תמונות בודדות או סרטוני דולג זמן של אפיתל האקספלן, כוונן את הרכישה כדי להשיג את התמונה הטובה ביותר האפשרית.

עיין בחלק הכתוב של פרוטוקול זה לקבלת טיפים על כוונון והדמיה. שמירה על עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר. צלם תמונות או סרטוני דולג זמן של אפיתל x explan.

עיין בחלק הכתוב של הפרוטוקול לקבלת הצעות לאיסוף נתונים. ניתן לכרות קבצי תמונה קונפוקליים עבור נתונים בדרכים שונות. להלן שתי דוגמאות כיצד לנתח קבצי נתונים באמצעות תוכנת ניתוח Image J עם תוסף פורמטים ביולוגיים.

כדי למדוד את שטח התא של תא אפיתל, משוך כלפי מטה את תפריט הניתוח ולחץ על הגדרת מדידות. בחר את כלי הבחירה מסרגל הכלים וסמן את התא בתפריט הניתוח, בחר כלים ולאחר מכן מנהל החזר ROI. כדי לפתוח את מנהל אזורי העניין לחץ על control t.

כדי להוסיף את החלוקה לרמות למנהל ההחזר על ההשקעה, בחר והוסף כמה קווי מתאר שתרצה מהתמונה. לאחר מכן לחץ על שמור כדי לשמור את החזר ה-ROI שנקבע במנהל ה-ROI. לחץ על מדידה.

חלון התוצאות יציג כעת את האזורים הנמדדים של כל החזר על ההשקעה. כדי למדוד את העוצמה של ממברנת התא, בחר בכלי הקו הישר מסרגל הכלים של תמונה J. צייר קו בניצב על פני הממברנה.

הקש CTRL T כמו בדוגמה הקודמת. כדי להוסיף את הבחירה למנהל ההחזר על ההשקעה, משוך כלפי מטה את תפריט הניתוח ולחץ על פרופיל העלילה כדי ליצור עלילה של עוצמות יחסיות על פני הקו. כדי לשמור את הגרף כתמונה, לחץ על שמור בחלון ההתוויה החדש שמופיע.

משוך כלפי מטה את תפריט הרשימה כדי להגיש, ולאחר מכן שמור כפי שהראינו לך זה עתה כיצד לצלם ולכמת תאי אפיתל עובריים מהסבר CapEx של בעלי חיים שנכרתו. בזמן ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה ל-DFA. כדי להרתיע צמיחת חיידקים ופטריות, היזהר במיוחד בעת לחיצה על צמחים מתחת להחלקות הכיסוי מכיוון שלחץ גדול מהנדרש יכול לרסק את האקספלור.

חשוב גם לזכור שיהיו הגדרות אופטימליות במיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לקבל נתוני תמונה באיכות מקסימלית. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

Explore More Videos

לביולוגיה התפתחותית גיליון 39 בתאי אפיתל צפרדעים Xenopus laevis epithelia תאיים ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה confocal כובע explant בעלי חיים עוברים