Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis
23 במאי 2010
Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים שיטות של דימוי חי וכמות đơn-פשוטה לניתוח מורפולוגיה של תאי אפיתל עובריים. זאת מושג תחילה על ידי הכנת כל הכלים והמכשור. השלב השני של הפרוצדורה הוא חילוץ X explan מעוברי צפרדע והשכנתם בתאי תרבית לתרבית ארוכת טווח.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל בזמן אמת. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא כימות פרטים מורפולוגיים של תאי אפיתל באמצעות Image J. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שטחי תאים עקובים ועוצמות ממברנה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שלום, אני סאגר ג'ושי ממעבדת דוידסון במחלקה להנדסת ביו (Bioengineering) באוניברסיטת פיטסבורג.
היום נדגים לכם פרוצדורה לדימיון של תאים חיים וניתוח כמותי של תאי אפיתל עובריים של Xenos lavia. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור שינויים בשלד התא בזמן אמת. אז בואו נתחיל.
כדי להכין תאי גידול עבור animal caps, השתמשו בגריז סיליקון כדי לאטום תא אקרילי מותאם אישית או שייבת ניילון קטנה לזכוכית כיסוי גדולה של 45 על 50 מילימטר. הוסיפו לתא מיליליטר אחד של 1%BSA ב-one third XMBS. צפו רסיסי זכוכית כיסוי קטנים באותו תמיסה והדגירו אותם למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
כדי להפחית את ההיצמדות של ה-X לזכוכית, שטפו ומלאו את התא במצע DFA. רגע לפני העברה של ה-xs, שטפו את רסיסי כיסוי הזכוכית באופן דומה. לאחר מכן, טבלו אותם בצלחת של תרבית DFA עם עוברים שהוזרקו במיקרו-הזרקה בשלב של תא אחד עד ארבעה תאים עם ה-MR NA הרצוי, עד לשלב הרצוי ב-one third XMBS. השתמשו בפיפט העברה עם פתח אלכסוני כדי להעביר את העוברים לצלחת DFA תחת מיקרוסקופ סטריאו למחקר.
השתמשו בפינצטה כדי להוציא את העוברים לצורך השתלת CapEx חיותי. השתמשו בלולאת שיער כדי לקבע עובר במקומו. השתמשו בסכין שיער כדי לבצע חתך קטן בקוטב החיوي.
בצעו חיתוכים מהירים וחלקים חוזרים כדי להרחיב את החתך ולהסיר את האקטודרמה של כיפת העין. השתמשו בשיטה זו כדי להוציא שלושה או ארבעה explan. השתמשו בפיפטת העברה כדי להעביר אותם לתא התרבית שהוכן.
השתמש בלולאת השערה כדי למקם כל X explan כך שהאפיתל יפנה לתחתית התא. בעזרת פינצטה, החזק רסיס של זכוכית כיסוי במרכזו.
טבלו את הקצוות בגריס סיליקון. מקמו פרגמנט אחד מעל כל X explan. קבעו קלות כל פרגמנט במקומו בעזרת נקודות קטנות של גריס סיליקון.
יש להקפיד לא למעוך את ה-X explan בכוח רב מדי. מלאו את התא ב-DFA וגרשמו את השוליים העליונים של התא בגריז סיליקון. לאחר מכן, אטמו את החלק העליון בעזרת זכוכית כיסוי בגודל 24 x 40 מילימטר.
כוון את גובה ה-DFA בתוך התא כדי להפחית בועות אוויר והשתמש בנייר סופג כדי לספוג כל עודף. כעת ניתן לגדל את צמחי ה-X לטווח ארוך בתוך התא האטום למשך יום אחד בטמפרטורת החדר; העבר את עדשת העבדה 20x של מיקרוסקופ קונפוקאלי למקומה. מקם את התא המכיל את דגימת ה-X עלב פלטת המיקרוסקופ והנח משקולות איזון קטנות על התא כדי לקבע אותו במקומו תחת תאורה בשדה בהיר.
כווננו את המוקד והשתמשו במיקום גס (course positioning) כדי להדמיות של הקצוות האפיקליים של התאים השטחיים. עברו לפלואורסצנציה ולאובייקטיב בעוצמה גבוהה יותר. כדי לאסוף תמונות בודדות או סרטי time-lapse של אפיתל ה-explan, כווננו את תהליך הרכישה כדי להשיג את התמונה הטובה ביותר האפשרית.
עיינו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה לקבלת טיפים על כיוונון והדמיה. שמרו על עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר. צלמו תמונות או סרטי time-lapse של ה-x explan epithelium.
עיינו בחלק הכתוב של הפרוטוקול להצעות בנוגע לאיסוף נתונים. ניתן לחלץ נתונים מקבצי תמונות קונפוקאליות בדרכים שונות. להלן שתי דוגמאות לאופן ניתוח קבצי נתונים באמצעות תוכנת הניתוח Image J עם תוסף bio formats.
כדי למדוד את שטח התא של תא אפיתליאלי, פתחו את תפריט ה-analyze ולחצו על set measurements. בחרו את כלי הבחירה (selection tool) מסרגל הכלים ותחמו את התא; בתפריט ה-analyze, בחרו ב-tools ולאחר מכן ב-ROI manager. כדי לפתוח את מנהל אזורי העניין (regions of interest manager), לחצו על control t.
כדי להוסיף את התבליט למנהל ה-ROI, יש לבחור ולהוסיף מהתמונה מספר התבליטים הרצוי. לאחר מכן, לחץ על save כדי לשמור את סט ה-ROI במנהל ה-ROI. לחץ על measure.
חלון התוצאות יציג כעת את השטחים הנמדדים של כל ROI. כדי למדוד את העוצמה של ממבננת תא, בחרו בכלי הקו הישר מסרגל הכלים של Image J. שרטטו קו מאונך לרוחב הממברנה.
לחצו על CTRL T כפי שנעשה בדוגמה הקודמת. כדי להוסיף את הבחירה למנהל ה-ROI, פתחו את תפריט analyze ולחצו על plot profile כדי להפיק גרף של עצימויות יחסיות לאורך הקו. כדי לשמור את הגרף כתמונה, לחצו על save בחלון הגרף החדש שמופיע.
גררו את תפריט הרשימה אל קובץ, ולאחר מכן שמרו בשם. הרגע הדגמנו כיצד לבצע דימוי חי וכמותיות של תאים אפיתליאליים עובריים מתוך Explant של CapEx שהוצא מהחיה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה ל-DFA. כדי למנוע צמיחה של חיידקים ופטריות, גלו זהירות מוסיפה בעת לחיצה על ה-explants תחת כיסויי הזכוכית, מכיוון שלחץ רב מדי עלול למעוך את ה-explan.
חשוב גם לזכור להשתמש בהגדרות אופטימליות במיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לקבל נתוני תמונה באיכות מרבית. זה הכל. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים טכניקות של דימות חי כדי לבחון מורפולוגיה של תאי אפיתל עובריים ב-Xenopus. הוא מדגיש שיטות לבידוד רקמות של צפרדעים ולהדמיה של תאי אפיתל חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- אפיטל עוברים של Xenopus משמש כמודל לחקר התנהגויות תאיים.
- דימוי תאים חיים משלים את ההיסטולוגיה המסורתית.
- הבנת המורפוגנזה האפיטללית היא קריטית למחקרי התפתחות.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקה תאית.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקות של דימוג חי (live imaging) עבור תאים אפיתליאליים.
- לכימות פרטים מורפולוגיים של תאים אפיתליאליים.
- לספק פרוטוקול לבידוד ולגידול של רקמות צפרדע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת הכלים והמכשור עבור הדמיה.
- חילוץ רקמות מעוברים של צפרדע לצורך תרבית.
- איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל.
- כימות מורפולוגיה של תאים באמצעות תוכנת Image J.
תוצאות עיקריות
- התקבלו תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל חיים.
- ניתוח כמותי חשף שטחי תאים שעקבו אחריהם ועצמות ממברנה.
- דימוי חי סיפק תובנות לגבי התנהגות תאים במהלך מורפוגנזה.
- השיטות תוקפו עבור תרבית ארוכת טווח של רקמות צפרדע.
מסקנות
- מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים יעילה לחקר תאים אפיתליאליים.
- ניתן ליישם את השיטות במגוון מחקרים בביולוגיה התפתחותית.
- התוצאות משפרות את ההבנה של מורפוגנזה אפיתליאלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי תאי חיים ואנליזה כמותית של תאי אפיתל עובריים ב-Xenopus laevis מספקים פלטפורמה דינמית לבחינת תהליכים מורפוגנטיים הרלוונטיים לגילוי מוקדם ותיקוף מטרות. מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה מאפשרת מדידה בזמן אמת של מורפולוגיה תאית ומיקום חלבונים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במודלים של ביולוגיה התפתחותית. זרימת עבודה זו מגבירה את הערך התרגומי של מערכות אפיתליאליות להפחתת סיכונים מכניסטיים ותיעוד תיקי פיתוח במחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על שינויים בשלד התא ועל דינמיקה של צורת התא בזמן אמת.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מולקולריות המעורבות במורפוגנזה אפיתליאלית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות שינויים בשטח התא ובעוצמת הממברנה.
- מספק פלטפורמה לבדיקה של מסלולי התפתחות המונחית על ידי היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות תאים חיים שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של דימוג כמותי בהמשך השלב.
- מנstandardize את המדידה של פרמטרים מורפולוגיים באמצעות ניתוח Image J הניתן לשחזור.
- מאפשר סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות המשפיעות על התנהגות תאים אפיתליאליים.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחקרים השוואתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי לכידה של תהליכים אפיתליאליים דינמיים.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פלטים כמותיים.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי אספקת קריאות תאיות חיזויות בזמן אמת.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות דימוי חי של לוקליזציה של חלבונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לתיקוף מודלים פרה-קליניים, תוך שימוש בדימוי תאי חיים ליצירת נתונים חסונים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרה של מסלולים באמצעות ניתוח מורפולוגי בזמן אמת.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מדויקות של שטח התא ועוצמת הממברנה עבור אנליטיקה השוואתית.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי למחקר פרה-קליני באמצעות תמיכה במידול מערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמת דימוי וניתוח הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים שונים על תאי אפיתל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של תאי אפיתל.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) בזרימות עבודה של דימות תאים חיים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים בשלבי הגילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובניתוח כמותי של תמונות.
- מחייב גישה למכשור דימוי ייעודי ותוכנות ניתוח (למשל, Image J).
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימוי והמדידה.
- עשוי לדרוש התאמה למערכות מודל או לסוגי רקמות שונים.
- תלוי בתנאי תרבית אופטימליים ובטיפול זהיר בדגימות להבטחת איכות הנתונים.
