פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם
June 14th, 2017
הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ ביעילות חלבונים מהמסתם המיטרלי של הלב האנושי, המתאימים לניתוח פרוטאומי. שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת מנגנונים פתוגניים בתחום מחלות מסתמי הלב, ולאפשר זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים ובתקווה, של מטרות טיפוליות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא בכך שהוא מספק זרימת עבודה יעילה של חילוץ התואמת ליישומים אנליטיים רבים.
התוצאה היא אפיון ממצה יותר של פרוטאום המסתם המיטרלי הלבבי. יתר על כן, ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על מערכות אחרות, כגון המסתם המיטרלי החזירי, הדומה מאוד למסתם האנושי ומשמש במודל ניסיוני להערכת תפקוד המסתמים. תדגים את הליך הניסוי סטפניה גילרדי, טכנאית מהמעבדה שלי.
כדי להכין את המסתם המיטרלי האנושי, התחל עם לב מושתל שהיה תחת איסכמיה קרה במשך ארבע עד 12 שעות. בחדר נקי, הוציאו את הלב מתיק ההובלה והכניסו אותו לדלי מעוקר. לאחר מכן, העבירו את הלב לארון בטיחות ביולוגית.
שם, בעזרת אזמל חד פעמי, חותכים בניצב לציר הראשי בגובה החדר השמאלי והימני, כארבעה סנטימטרים מהקודקוד. לאחר מכן הניחו את הלב על וילון סטרילי. לאחר מכן, הזיזו הצידה את אבי העורקים העולה ועורק הריאה כדי לגשת לגג הפרוזדורים השמאלי.
בגג הפרוזדורים השמאלי, השתמש במלקחיים ובמכושים כדי לחתוך סביב האפרכסת השמאלית כדי לחשוף את המסתם המיטרלי. המסתם המיטרלי כלול במלואו בחדר השמאלי. לפיכך, חשפו את העלון המיטרלי הגדול ואת העלון המיטרלי הקטן.
הקומיסורים האנטרולטרליים והאחוריים מגדירים את גבול האזור הקדמי והאחורי. כעת, בעזרת מספריים ומלקחיים לא טראומטיים, נתחו את הפרוזדור השמאלי ואת עובי דופן החדר המקיף את המסתם המיטרלי. במהלך דיסקציה זו, זהה את המשכיות המסתם אבי העורקים המיטרלי.
לאחר מכן, הפרד את עלון המסתם המיטרלי הקדמי מעלון המסתם המיטרלי האחורי על ידי חיתוך לאורך הקומיסורים התוחמים את העלון האחורי. בסיום ההליך, יש לחטא את שולחן הארון בתמיסת אלכוהול איזופרופיל 70% ותמיסת מי חמצן 6%. כעת, שטפו את העלון האחורי של המסתם המיטרלי במי מלח.
לאחר מכן, חותכים את השסתום לחתיכות קטנות, כל אחת פחות מסנטימטר מרובע. עוטפים את החלקים בנפרד בנייר אלומיניום, ומקפיאים אותם בחנקן נוזלי. כדי להתחיל במיצוי החלבון, השתמש במלקחיים כדי להסיר דגימה מהחנקן הנוזלי, והניח אותה מיד על קרח יבש.
אל תתנו לדגימה להפשיר. לאחר מכן, לתוך בקבוק דיואר מלא בחנקן נוזלי, הניחו את המרגמה, העלים הנלווים והדגימה. זה קריטי שהחנקן הנוזלי ישמש להקפאת הדגימה ולקירור מערכת המטחנה.
שלב זה מונע פירוק ביולוגי ומאפשר אבקה יעילה, אך דורש הכשרה טכנית לטיפול בטוח. לאחר הקפאת הבזק, הכניסו את המרגמה והעליים לקופסת פוליסטירן המכילה קרח יבש. כמו כן, הניחו מרית על הקרח היבש.
לאחר מכן, הסר את הדגימה מהנייר כסף וטען אותה למרגמה. ומקם את העלי הגדול יותר מעליו. בעזרת מברג לסיבוב העלי, טוחנים את הדגימה 15 עד 20 פעמים.
תוך כדי הטחינה מערבבים את הדגימה עם קצה מרית צוננת. לאחר השימוש בעלי הגדול, חזור על תהליך הטחינה עם עלי קטן יותר. קבלת אבקה דקה חיונית למיצוי חלבון יעיל.
כעת, השליכו את הדגימה האבקה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מילילטר בעל מסה ידועה. לאחר מכן מברישים את כל החומר שנותר לתוך המרגמה בעזרת מרית קרה. שמור את הצינור עם הדגימה על קרח יבש וקבע במהירות את מסת הדגימה.
לאחר מכן, זרוק את הדגימה לתוך צינור הומוגנייזר זכוכית. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר אוריאה לכל 10 מיליגרם דגימה. בכך, שחזר את השאריות שנותרו בצינור על ידי שטיפתם עם מאגר האוריאה.
כעת הומוגניזציה של הדגימה באמצעות עלי PFTE ממונע הפועל במהירות של 1,500 סל"ד. לחץ לאט את העלי על הדגימה בתנועת פיתול 10 פעמים. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט הצהוב הצמיג לצינור צנטריפוגה נקי של 1.7 מיליליטר באמצעות פיפטה מזכוכית.
כעת חזור על ההומוגניזציה על הדגימה הנותרת תוך שימוש במחצית מכמות האוריאה. שחזרו את הסופרנטנט ושלבו אותו עם הקולקציה הקודמת. לאחר מכן, הנח את הצינור על מסובב צינור למשך 30 דקות.
לאחר 30 דקות, טען את הצינור לצנטריפוגה קרה וסובב את הדגימה ב -13, 000 גרם למשך חצי שעה. לאחר מכן, החזירו את הסופרנטנט. ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת החלבון של ברדפורד.
לאחר ביצוע הפרוטוקול שנקבע, תמצית החלבון נחקרה במגוון שיטות לאחר מספר טיפולים נוספים. בסך הכל זוהו 422 חלבונים ברקמת המסתם המיטרלי על ידי אלקטרופורזה דו מימדית, מיקוד איזואלקטרי בשלב נוזלי, כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה וכרומטוגרפיה נוזלית דו-ממדית-ספקטרומטריית מסה. 422 החלבונים סווגו באמצעות ניתוח אונטולוגיה גנטית.
האזורים החוץ-תאיים הכילו מספר חלבונים צפויים וחלבונים תוך-תאיים אחרים ועל פני התא. רבים מהם זוהו לראשונה במסתמים מיטרליים. נוכחותם של ארבעה חלבונים כאלה שלא זוהו בעבר במסתמים המיטרליים אושרה עם נוגדנים בשלוש דגימות ייחודיות.
החלבונים הם Septin-11, ארבעה וחצי תחומי LIM חלבון אחד, דרמטופונין ואלפא גבישי B.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ חלבונים מהמסתם המיטרלי הלבבי לצורך זיהויים וכימותם. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך כמעט שעתיים אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, כדי לקבל את התשואה הגדולה ביותר של חלבונים עם שלמות חלבון גבוהה, חיוני שהדגימות לא יפשירו במהלך ההעברה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
הפרוטוקול הזה נועד לחלץ בצורה יעילה חלבונים מהמסתם המיטרלי הלבבי האנושי לצורך ניתוח פרוטאומי. הוא יכול לעזור לזהות סמנים חדשים לאבחון ולחיזוי במחלות שסתום הלב.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה לבבית
- פרוטאומיקה
- מחלות שסתומים של הלב
רקע
- הרכב החלבונים של המסתם המיטרלי האנושי אינו מובן במלואו.
- תאיות נמוכה מסבכת את ניתוח החלבונים.
- הבנת הפרוטאום של המסתם המיטרלי חיונית לבריאות הלב.
- פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על המסתם המיטרלי החזירי.
מטרת המחקר
- לספק שיטה יעילה לחילוץ חלבונים מהמסתם המיטרלי.
- לסייע בניתוח פרוטאומי להבנה טובה יותר של מחלות שסתומים לבביים.
- לזהות מטרות טיפוליות וסמני מחלות פוטנציאליים.
שיטות ששימשו
- פרוטוקול חילוץ חלבונים מהמסתם המיטרלי הלבבי האנושי.
- תואם ליישומים אנליטיים שונים.
- הוצג על ידי טכנאי מעבדה.
- יישום פוטנציאלי במודלים ניסיוניים.
תוצאות עיקריות
- הוקם זרימת עבודה יעילה לחילוץ.
- אפיון מקיף יותר של הפרוטאום של המסתם המיטרלי.
- הפרוטוקול חל על מערכות דומות אחרות.
- תובנות לגבי מנגנונים פתוגניים של מחלות שסתומים.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של הביולוגיה של המסתם המיטרלי.
- הוא עשוי להוביל לגילוי דרכים חדשות לאבחון וטיפול.
- מחקר נוסף יכול לבנות על עבודת היסוד הזו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in cardiovascular target validation by enabling efficient protein extraction from low-cellularity, matrix-rich tissues like the human mitral valve. By supporting comprehensive proteomic profiling, it facilitates mechanistic de-risking of therapeutic targets in cardiac valve disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to pathogenic mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein identification in disease-relevant tissue.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for extracting proteins from challenging extracellular matrix-rich samples.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and target prioritization by uncovering novel disease-associated proteins.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates protein extracts compatible with downstream applications such as immunoblotting and mass spectrometry.
- Reproducibility: Establishes a consistent extraction process critical for assay standardization across laboratories.
- Scalability: Permits application to model systems like porcine mitral valve for cross-species target validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links protein expression data with mRNA and immunohistochemical analyses for multi-omics validation.
- Mechanistic De-risking: Identifies intracellular and extracellular proteins not previously detected in mitral valves, clarifying disease mechanisms.
- Preclinical Relevance: Enables target validation in models that closely resemble human valve physiology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation by providing reliable molecular readouts from diseased tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via comprehensive proteomic characterization of the mitral valve.
- Screening: Delivers quantifiable protein outputs suitable for screening campaigns targeting valve pathology.
- Analytics: Enables comparative analysis of protein expression profiles across conditions using Bradford assay and electrophoresis.
- Translational Research: Facilitates correlation of proteomic data with mRNA and immunohistochemical findings.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomic preparation platform for cardiovascular target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by revealing previously undetected proteins in mitral valve tissue.
- Operational Value: Ensures sample integrity through cold-chain handling and prevents degradation during extraction.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing mechanistic insights into valve disease pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through comprehensive molecular profiling of disease tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and cold-sample handling to prevent thawing.
- Needs access to cryogenic equipment (liquid nitrogen, dry ice) and motorized homogenization tools.
- Demands standardized protocols across teams to ensure reproducible protein yields.
- Must account for tissue variability when adapting to different valve models or disease states.
- Limited by starting material availability; dependent on access to explanted human or porcine valves.
