Name: חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: למדו שיטה לזיהוי חלבונים המתקשרים עם גורמי שותף גרעיניים באמצעות ניתוח LC-MS/MS בתאי HEK 293. פרוטוקול זה מאפשר חקירת רשתות אינטראקציות חלבוניות המווסתות תעתוק גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות (HT), קרן המדע של טקדה (HT), ועל ידי האגודה היפנית לקידום מענקי מדע למדענים צעירים (B) ל-HT.

1. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים HEK293 תאים צלחות תרבות 100 מ&quot;מ (2 x 10 6 תאים / תבשיל). תרבות התאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco בתוספת 10% בסרום עוברי עגל, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו -100 יחידות / מיליליטר פניצילין. דגירה התאים בתוך חממה humidified ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, transfect את התאים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד ARIP4 מתויג FLAG באמצעות 40 μl של מגיב transfection פי הנחיות היצרן 11. </li></ol> 2. הפקת חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 36 שעות שלאחר transfection, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח ו לקצור את התאים באמצעות מגרד. העברת התאים לתוך 1.5 mltube צנטריפוגות זה ב 8000 XG במשך 2 דקות ב 4 °. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5x נפח גלולה של חיץ 0.4 M KCl (חיץ מלח גבוהה: 20 מ&quot;מ טריס- HCl (pH 8.0), 0.4 KCl M, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ&quot;מ ב-mercaptethanol, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x). סובב את התערובת במשך 20 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב 17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant (תמצית כל תא) לצינור 2 מ&quot;ל חדשה ולהוסיף 3x נפח הראשונית של 0 חיץ M KCl (דילול חיץ: 20 מ&quot;מ טריס- HCl (pH 8.0), 5 2 מ&quot;מ MgCl, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע צנטריפוגה אחרת (17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C) ולהעביר את supernatant (תמצית התא כולו) לצינור 2 מ&quot;ל חדש. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה (2.4), לשטוף 50 μl של חרוזים אנטי FLAG עם PBS, 0.1 מ &#39;גליצין-הידרוכלוריד, ולאחר מכן 1 M טריס-הידרוכלוריד, ואחריו כביסה פעמיים עם 0.1M KCl חיץ (חיץ מלח נמוכה: 20 מ&quot;מ כמה עצוב HCl (pH 8.0), 0.1 מ &#39;KCl, 5 מ&quot;מ MgCl2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ&#39;M ב-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x). צנטריפוגה עבור תהליך כביסה זה מבוצעת XG ב 2000 דקות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של חרוזים FLAG עם תמציות כל תא בעדינות לסובב את התערובת במשך 4 שעות ב 2-4 מעלות צלזיוס (1% של תמצית כל תא משלב 2.4 צריך גם להישמר ב -80 ° C לשימוש עתידי כקלט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם לעמודה ספין מיקרו (ירידה של כדור הארץ). שמור את הזרימה דרך צינור 1.5 מ&quot;ל, להקפיא אותו באמצעות חנקן נוזלי, ולאחסן אותו ב -80 ° C (לבדוק את רמות החלבון של שני קלט זרימה דרך באמצעות ניתוח כתם המערבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.1 חיץ M KCl (חיץ מלח נמוכה) כדי לשטוף את החרוזים FLAG (ירידה של כדור הארץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.4 לפחות יותר ארבע פעמים (עבור סכום כולל של חמישה שוטף). </li></ol> 4. Elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל ו צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1; החרוזים יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי או בתחתית<html> הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl (שווה לנפח של חרוזים FLAG) של 0.1 מ &#39;גליצין-HCl (pH 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל חדש צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון eluted מנוטרל עם 10 μl של 1 M טריס- HCl (pH 8.0); ומערבבים היטב על ידי pipetting או באמצעות מכונה מערבולת. </li></ol> 5. אלקילציה ו trypsinization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3, 10 μl של CH 3 CN, ו -2 μl של dithiothreitol לתערובת (112 הנפח הכולל μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם במשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 333 מ&quot;מ iodoacetamide המדגם ו דגירה אותו בחושך במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של טריפסין (33 ng / μl) לתערובת ו דגירה אותו לילה בשעה 37 ° C. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. LC-MS / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות trypsinization לילה, להעביר את המוצר הסופי למתקן LC-MS / MS או למעבדה ספקטרומטריית מסה של צד שלישי עבור ניתוח 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
<li>MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+PLIN+proteins%2C+ATGL+and+CGI-58%2C+interactions+at+rest+and+following+stimulated+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction.</a> Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).</li>
<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+with+chromatin+modifiers+that+occupies+E2F-+and+Myc-responsive+genes+in+G0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells.</a> Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+histone+modifications+mediated+by+a+CtBP+co-repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex.</a> Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).</li>
<li>Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+human+papillomavirus+type+16+E7+oncoprotein+with+the+600-kDa+retinoblastoma+protein-associated+factor%2C+p600%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).</li>
<li>Huang, B. X., Kim, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+identification+of+Akt+interacting+proteins+by+two-step+chemical+crosslinking%2C+co-immunoprecipitation+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), 61430(2013).</li>
<li>ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+immuno-precipitation+proteomics+-+the+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide.</a> Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Suppression+by+Transient+Recruitment+of+ARIP4+to+Sumoylated+nuclear+receptor+Ad4BP%2FSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1.</a> Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

transfection יעיל הוא חיוני כדי להשיג תוצאה מוצלחת עם פרוטוקול זה. בהתאם לכך, אנו ממליצים להשתמש ניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את רמות החלבון FLAG-מתויג immunoprecipitated. שלב זה מאפשר למשתמשים לוודא חלבון העניין שלהם מבוטא ביתר כראוי, ויתר מזאת, כי ה- IP בוצע בהצלחה. רמות החלבון מתויג FLAG צריך גם להיבדק לפני הניתוח ספקטרומטריית מסה. מדגם מדומה אמור לשמש כביקורת שלילית, כדי למנוע קבלת תוצאה חיובית כוזבת להיפלות בר...

אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חשוב תפקודים ביולוגיים רבים. ככזה, אינטראקציות אלה היו מעורבים הולכים אותות; תחבורה חלבון על פני קרום התא; חילוף חומרים בתא; וכמה תהליכים גרעיניים, כולל שכפול הדנ&quot;א, לתקן נזקים ב- DNA, רקומבינציה, והתעתיק 1, 2, 3, 4. זיהוי חלבונים מעורבים באינטראקציות אלה היא אפוא קריטי לקידום הבנתנו תהליכים תאיים אלה. Immunoprecipitation (IP) היא טכניקה תוקף להשתמש כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים. על מנת להקל על זיהוי של חלבונים-immunoprecipitated שיתוף, ספקטרומטריית מסה הוא מנוצל לעיתים קרובות 5, 6, 7, 8,9. על ידי מיקוד חבר ידוע של קומפלקס חלבון עם נוגדן, אפשר לבודד את החלבון מורכב ובהמשך לזהות מרכיביה הידועים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה. ARIP4 (אינטראקצית קולטן האנדרוגן חלבון 4), coregulator תעתיק, אינטראקציה עם חלבונים רצפטור גרעיניים כדי להפעיל או לדכא יזמי היעד שלה באופן תלוי קשר 9, 10. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ויסות תעתיק מסדירי גורמים גרעיניים אלה, אנו מתארים שיטה מקיפה לטהר לזהות חלבוני אינטראקצית ARIP4 באמצעות מערכת LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז (ללא EDTA) (100x)</td> <td>נקלאי טסק</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>עמודות מיקרו ביו-ספין</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות lc-ms / ms ניתוח

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

רגולטורים שעתוק חיוניים לוויסות שעתוק יעיל של מבנה הכרומטין הגרעיני. רגולטורים ממלאים מגוון תפקידים בוויסות שעתוק. אלה כוללים אינטראקציה ישירה עם גורמי שעתוק, שינוי קוולנטי של היסטונים וחלבונים אחרים, ושינוי קונפורמציה של כרומטין מדי פעם. בהתאם לכך, ביסוס שיטות מהירות יחסית לזיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה בתוך רשת זו הוא חיוני לשיפור ההבנה שלנו לגבי מנגנוני הבקרה הבסיסיים. זיהוי שותף קושר חלבון בתיווך LC-MS/MS הוא טכניקה מאומתת המשמשת לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון. על ידי חיסון של חבר שזוהה בעבר בקומפלקס חלבונים עם נוגדן (לעיתים עם נוגדן לחלבון מתויג), ניתן לזהות את האינטראקציות החלבון הלא ידועות שלו באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת חלבון לזיהוי תפוקה גבוהה בתיווך LC-MS/MS של אינטראקציות חלבון הכוללות קופקטורים גרעיניים ושותפיהם המקושרים. שיטה זו מאפשרת הבנה טובה יותר של מנגנוני ויסות השעתוק של הגורמים הגרעיניים הממוקדים.

זיהינו אות ARIP4 חזקה סביב 160 kDa, כמו גם אלה של פקד מדגם מדומה וכמה חלבונים ידועים אחרים (איור 1). LC-MS ניתוח / MS זיהו שני פפטידים מורכבים ARIP4 ואת קו-פקטורים פפטיד הפוטנציאל בתוך שבריר של חרוזים FLAG (טבלה 1). p62 (Sequestosome1), גורם-שותף ARIP4 ידוע 11 זוהה בניתוח (טבלה 1), אשר מאשרת את היעילות של מערכת זו 11. גם זיהינו הרבה חלבונים בעבר דיווח...

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות חלבונים המקשרים עם קו-פקטור גרעיני (Nuclear Cofactor) באמצעות אנליזת LC-MS/MS. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות למנגנונים של שעתוק בתחום הבקרה הגנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות את החלבונים המקשרים עם קו-פקטור גרעיני.יתרה מכך, שיטה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את מנגנוני הבקרה השעתוקית של הגורמים הגרעיניים הממוקדים. קצרו תאי HEK 293 המבטאים ARIP4 מתויג ב-flag כ-36 שעות לאחר הטרנספקציה, על ידי שטיפת שכבת התאים ב-PBS קר מאוד ואיסוף התאים באמצעות גורד תאים (cell scrapper). העבירו את התאים למבחנה של 1.5 מיליליטר ולאחר מכן סבבו במערך צנטריפוגה ב-8000g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את משקע התאים בנפח פי חמישה מנפח המשקע של High Salt Buffer. סובבו את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות של סיבוב, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-17,700g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בשלב הבא, העבירו את העל-נוזלים (supernatants) למבחנה חדשה של שני מיליליטר והוסיפו Dilution buffer פי שלושה מנפח העל-נוזל. בצעו צנטריפוגציה נוספת ולאחר מכן העבירו את העל-נוזל למבחנה חדשה של שני מיליליטר. במהלך הצנטריפוגציה שנמשכת 10 דקות, שטפו 50 microliters של anti-flag beads בעזרת PBS.לאחר מכן, סובב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 2000g למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר את העלייה (supernatant) וחזור על שלבי השטיפה, תחילה עם glycine hydrochloride בריכוז 1 molar ולאחר מכן עם tris hydrochloride בריכוז 1 molar. לאחר מכן, שטוף פעמיים עם Low salt buffer.בשלב הבא, ערבבו 50 µL של חרו지를 שטיפה עם תמריות תאים שלמים. סובבו בעדינות את התערובת במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 2-4 °C. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה בעלת קצה קהה כדי להעביר את הדגימה לעמודה לסינון במיקרו-צנטריפוגה (micro spin column) והמתינו עד שהתמיס יטפטף לתוך מבחנה של 1.5 mL.בצעו הקפאה מהירה (Snap freeze) של תמיסת המעבר בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את חרוזי ה-flag חמש פעמים עם Low salt buffer. כדי לבצע אלוטציה (elute), הכניסו את העמודה לשפופרת של 1.5 מיליליטר וסובבו בצנטריפוגה ב-2000g למשך דקה אחת כדי לייבש את החרוזים.סגרו את תחתית העמודה ולאחר מכן הוסיפו 50 µL של glycine hydrochloride בריכוז 1 M. נערו בעדינות את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, העבירו את העמודה למבחנה חדשה של 1.5 mL וסבבו בצנטריפוגה ב-2000g למשך דקה אחת.יש לנטרל את התמיסה שנאלתה באמצעות 10 µL של tris hydrochloride בריכוז 1 M ולערבב היטב על ידי פיפטינג וורטקס. יש להוסיף 50 µL של ammonium bicarbonate בריכוז 100 mM, 10 µL של acetonitrile, 2 µL של dithiothreitol ו-50 µL של הדגימה המנוטרלת.דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 °C. לאחר הדגירה, השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה 10 µL של iodoacetamide בריכוז 333 mM ודגרו בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. הוסיפו לתערובת 10 µL של trypsin ודגרו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.ביום למחרת העבירו את המוצר הסופי למעבדה ל-LC-MS/MS או למעבדה חיצונית למספקטרומיה של מסות לצורך אנליזה. תמונה זו מציגה צביעה בכסף של ARIP4 המסומן בתג flag epitope המבטא בתאי HEK 293 לאחר שיקוע חיסוני עם נוגדן ספציפי ל-flag והפרדה באמצעות אלקטרופורזה. כביקורת, בוצע טיהור דמי (mock purification) בתאי HEK 293 שלא ביטאו חלבונים אקסוגניים.באמצעות השיטה שלנו, ניתן לזהות קו-פקטורים גרעיניים משוערים באמצעות גורם השעתוק הרלוונטי, ולהעמיק את הבנתנו לגבי מנגנוני בקרה שעתוקיים.

a-protein-preparation-method-for-high-throughput-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

סרטון זה מדגים קומפלקסים של חלבונים בעלי זירוז חיסוני משותף על קרום PVDF לצורך ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון. החלבונים המופחתים מקומפלקסים טופלו בטריפסין כדי לבקע את החלבונים הבודדים בפפטידים הקטנים יותר, ולאחר מכן, שאר הפפטידים הופקו מקרום PVDF. הפפטיד הנמשך שמקורו בשני החלבונים בקומפלקס יובש והושעה מחדש בריכוז נמוך של חומצה פורמית לניתוח נוסף.

עיכול חלבונים על הממברנה להכנת חלבונים בעלי קו-אימונוזיקציה למחקרי אינטראקציה

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

למדו שיטה לזיהוי חלבונים המתקשרים עם גורמי שותף גרעיניים באמצעות ניתוח LC-MS/MS בתאי HEK 293. פרוטוקול זה מאפשר חקירת רשתות אינטראקציות חלבוניות המווסתות תעתוק גנים.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

גלה סרטונים נוספים