חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם קופקטור גרעיני באמצעות ניתוח LC-MS/MS. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות למנגנוני שעתוק בתחום ויסות הגנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לזהות את החלבונים המקיימים אינטראקציה עם קופקטור גרעיני.

יתר על כן, שיטה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את מנגנוני ויסות השעתוק של הגורמים הגרעיניים הממוקדים. קציר HEK 293 תאים המבטאים ARIP4 מתויג דגל 36 שעות לאחר הטרנסבקציה על ידי שטיפת יריעת התא ב-PBS קר כקרח ואיסוף התאים עם מגרד תאים. מעבירים את התאים לצינור של 1.5 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה ב-8000 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא פי חמישה מנפח הגלולה של High Salt Buffer. סובבו את התערובת במשך 20 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות של סיבוב, צנטריפוגה את הצינור ב-17, 700 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנטים לשפופרת חדשה של שני מיליליטר והוסיפו מאגר דילול לנפח פי שלושה מהסופרנטנט. בצע צטריפוגה נוספת ולאחר מכן העביר את הסופרנטנט לצינור חדש של שני מיליליטר. במהלך הצנטריפוגה של 10 דקות שטפו 50 מיקרוליטר חרוזים נגד דגל עם PBS.

לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב-2000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר את הסופרנטנט ולחזור על שלבי השטיפה תחילה עם גליצין הידרוכלוריד מולארי אחד ולאחר מכן עם טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת. לאחר מכן שוטפים פעמיים עם מאגר מלח נמוך.

לאחר מכן, מערבבים 50 מיקרוליטר חרוזים שטופים עם תמציות תאים שלמים. סובבו את התערובת בעדינות במשך ארבע שעות בחום של 2-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בקצה קהה כדי להעביר את הדגימה לתוך עמוד מיקרו ספין ולאפשר לתמיסה לטפטף לתוך צינור של 1.5 מיליליטר.

הצמד להקפיא את הזרימה בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את חרוזי הדגל עם מאגר מלח נמוך חמש פעמים. כדי להוציא, הנח את העמוד בצינור של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב -2000 גרם למשך דקה לייבוש החרוזים.

מכסים את החלק התחתון של העמודה ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר של 1 גליצין הידרוכלוריד מולארי. מנערים בעדינות את התערובת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, הנח את העמוד בצינור חדש של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב -2000 גרם למשך דקה אחת.

נטרלו את התמיסה המנופחת עם 10 מיקרוליטר של טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת וערבבו היטב על ידי פיפטינג ומערבולת. הוסף 50 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט. 10 מיקרוליטר אצטוניטריל, שני מיקרוליטר דיתיותרייטול ו -50 מיקרוליטר דגימה מנוטרלת.

דוגרים במשך 30 דקות בחום של 56 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן מוסיפים לדגימה 10 מיקרוליטר של 333 מילי-מולרי יודואצטמיד ודוגרים בחושך למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.מוסיפים לתערובת 10 מיקרוליטר טריפסין ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת העבירו את המוצר הסופי למתקן LC-MS/MS או למעבדת ספקטרומטריית מסה של צד שלישי לניתוח. תמונה זו מציגה צביעה כסופה של אפיטופ דגל המתויג ARIP4 המתבטא בתאי HEK 293 לאחר משקעים אימונליים עם נוגדן ספציפי לדגל והפרדה על ידי אלקטרופורזה. כביקורת, בוצע טיהור מדומה על תאי HEK 293 שלא ביטאו חלבונים אקסוגניים.

באמצעות השיטה שלנו, ניתן לזהות קופקטורים גרעיניים משוערים באמצעות גורם השעתוק המעניין שלהם ולשפר עוד יותר את ההבנה שלנו לגבי מנגנוני ויסות שעתוק.