חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח
January 24th, 2017
הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם קופקטור גרעיני באמצעות ניתוח LC-MS/MS. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות למנגנוני שעתוק בתחום ויסות הגנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לזהות את החלבונים המקיימים אינטראקציה עם קופקטור גרעיני.
יתר על כן, שיטה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את מנגנוני ויסות השעתוק של הגורמים הגרעיניים הממוקדים. קציר HEK 293 תאים המבטאים ARIP4 מתויג דגל 36 שעות לאחר הטרנסבקציה על ידי שטיפת יריעת התא ב-PBS קר כקרח ואיסוף התאים עם מגרד תאים. מעבירים את התאים לצינור של 1.5 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה ב-8000 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא פי חמישה מנפח הגלולה של High Salt Buffer. סובבו את התערובת במשך 20 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות של סיבוב, צנטריפוגה את הצינור ב-17, 700 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנטים לשפופרת חדשה של שני מיליליטר והוסיפו מאגר דילול לנפח פי שלושה מהסופרנטנט. בצע צטריפוגה נוספת ולאחר מכן העביר את הסופרנטנט לצינור חדש של שני מיליליטר. במהלך הצנטריפוגה של 10 דקות שטפו 50 מיקרוליטר חרוזים נגד דגל עם PBS.
לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב-2000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר את הסופרנטנט ולחזור על שלבי השטיפה תחילה עם גליצין הידרוכלוריד מולארי אחד ולאחר מכן עם טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת. לאחר מכן שוטפים פעמיים עם מאגר מלח נמוך.
לאחר מכן, מערבבים 50 מיקרוליטר חרוזים שטופים עם תמציות תאים שלמים. סובבו את התערובת בעדינות במשך ארבע שעות בחום של 2-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בקצה קהה כדי להעביר את הדגימה לתוך עמוד מיקרו ספין ולאפשר לתמיסה לטפטף לתוך צינור של 1.5 מיליליטר.
הצמד להקפיא את הזרימה בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את חרוזי הדגל עם מאגר מלח נמוך חמש פעמים. כדי להוציא, הנח את העמוד בצינור של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב -2000 גרם למשך דקה לייבוש החרוזים.
מכסים את החלק התחתון של העמודה ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר של 1 גליצין הידרוכלוריד מולארי. מנערים בעדינות את התערובת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, הנח את העמוד בצינור חדש של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב -2000 גרם למשך דקה אחת.
נטרלו את התמיסה המנופחת עם 10 מיקרוליטר של טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת וערבבו היטב על ידי פיפטינג ומערבולת. הוסף 50 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט. 10 מיקרוליטר אצטוניטריל, שני מיקרוליטר דיתיותרייטול ו -50 מיקרוליטר דגימה מנוטרלת.
דוגרים במשך 30 דקות בחום של 56 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן מוסיפים לדגימה 10 מיקרוליטר של 333 מילי-מולרי יודואצטמיד ודוגרים בחושך למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.מוסיפים לתערובת 10 מיקרוליטר טריפסין ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת העבירו את המוצר הסופי למתקן LC-MS/MS או למעבדת ספקטרומטריית מסה של צד שלישי לניתוח. תמונה זו מציגה צביעה כסופה של אפיטופ דגל המתויג ARIP4 המתבטא בתאי HEK 293 לאחר משקעים אימונליים עם נוגדן ספציפי לדגל והפרדה על ידי אלקטרופורזה. כביקורת, בוצע טיהור מדומה על תאי HEK 293 שלא ביטאו חלבונים אקסוגניים.
באמצעות השיטה שלנו, ניתן לזהות קופקטורים גרעיניים משוערים באמצעות גורם השעתוק המעניין שלהם ולשפר עוד יותר את ההבנה שלנו לגבי מנגנוני ויסות שעתוק.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לטיהור חלבוני אינטראקציה משותפים ויסותיים באמצעות ניתוח LC-MS/MS. הטכניקה נועדה לזהות חלבונים האינטראקציה עם קו-פקטור גרעיני, ומשפרת את ההבנה שלנו של מנגנוני ויסות תעתוק.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ויסות גנים
רקע
- הבנת מנגנוני תעתוק חיונית בוויסות גנים.
- זיהוי אינטראקציות חלבונים יכול לחשוף תובנות לגבי תהליכים תאיים.
- LC-MS/MS הוא כלי רב עוצמה לניתוח אינטראקציות חלבונים.
- שיטה זו מתמקדת בקו-פקטורים גרעיניים ובתפקידי הוויסות שלהם.
מטרת המחקר
- לזהות חלבונים האינטראקציה עם קו-פקטור גרעיני.
- להבהיר מנגנוני ויסות תעתוק.
- לספק שיטה אמינה לטיהור חלבונים.
שיטות ששימשו
- קצירת תאי HEK 293 המבטאים ARIP4 עם דגל.
- שטיפת תאים עם PBS קר קרח.
- איסוף תאים באמצעות מגרד תאים.
- צנטריפוגה של תאים ב-8000g למשך שתי דקות ב-4°C.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של חלבונים האינטראקציה עם קו-פקטורים גרעיניים.
- הבנה משופרת של מנגנוני תעתוק.
- הוכחת האפקטיביות של שיטת LC-MS/MS.
- יישומים פוטנציאליים במחקר ויסות גנים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי חשוב לחקר אינטראקציות חלבונים.
- היא תורמת להבנה הרחבה יותר של ויסות גנים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על טכניקה זו לתובנות נוספות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
