ליצירה והחלה הפניה כדי לקדם את הדיון ואת הסיווג של חלבונים בתוך קבוצה מגוונת
August 16th, 2017
המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח התייחסות חלבונים מתבדרת בקבוצה חסר קוהרנטי לקריטריונים במינוח והסיווג. הפניה זו יקל על ניתוח ודיון של הקבוצה בכללותה, יכול לשמש שמות הוקמה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני סטנדרטית כדי לפתח התייחסות לחלבונים שונים בקבוצה שחסרה קריטריונים קוהרנטיים למינוח וסיווג. שיטה זו יכולה לעזור להבהיר קשרים בין חלבונים קשורים שיש להם מינוח מבלבל או לא עקבי, כגון משפחת העל אלפא-בטא מיוצבת ציסטאין של פפטידים הגנתיים הכוללת הגנות חסרי חוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת ייצוג חזותי פשוט של החלבונים המעניינים.
כדי להתחיל, זהה את המאפיינים המגדירים של קבוצת החלבונים המעניינת. לדוגמה, קיפול אלפא-בטא CS במבנה התמיסה של הגנת חרקים וסיוע מ-phormia terraenovae מגדיר את משפחת העל של CS אלפא-בטא. קפל זה כולל גם מוטיב קטן יותר הנקרא סליל מיוצב ציסטאין, המזוהה על ידי CXXXC במעלה הזרם של CXC.
ארבעת הציסטאין יוצרים שני קשרים דיסולפידים. כדי להשלים את מוטיב האלפא-בטא של CS, נוצר קשר דיסולפיד שלישי על ידי זוג ציסטאין נוסף. בסופו של דבר זה קריטי לדעת לפחות כמה תכונות חשובות הקשורות למבנה או לתפקוד של החלבון.
בלי זה, אין בסיס ליצירת הפניה. כעת, הזן את התכונות המגדירות הללו לגיליון אלקטרוני. השתמש בעמודות עבור השרידים שהשתמרו וכדי לייצג את הרווחים בין מאפיינים אלה.
שמור על העמודות רחבות מספיק כדי להתאים למספרים והענק להן רוחב עקבי. בשורות, תאר את הרצפים. כדי לציין רצף כתכונה, מלא את תיבת התכונה בצבע, באמצעות פונקציית המילוי.
לאחר מכן, כדי לציין את המרווח בין התכונות, הזן את מספר חומצות האמינו בתיבה שביניהם. כעת, הוסף רצפים מייצגים שהוקמו בעבר כחברים בקבוצה על סמך מסדי נתונים מבניים ותוצאות שפורסמו. לפי הצורך, הוסף תכונות שעשויות להגדיר תת-קבוצה של רצפים, כגון ציסטאין נוסף.
אם חסרות תכונות ברצף נתון, השאר את התיבה לא מלאה ושלב אותה עם תיבות המייצגות חומצות אמינו מתערבות. לשם כך, אנו פונקציות מיזוג ומרכז. לאחר הזנת רצפים מייצגים, זהה קבוצות של רצפים קשורים בבירור.
לאחר מכן, סכם את המאפיינים של קבוצות אלה. כאשר מספר חומצות האמינו בין תכונות משתנה, השתמש במקף כדי לציין טווח או בקווים נטויים כדי לציין כמה מספרים ספציפיים. לפי הצורך, הוסף ביאורים יצירתיים לתכונות שעשויות להיות רלוונטיות או שאינן נפוצות מספיק כדי לכלול בהפניה.
לדוגמה, מכיוון שציסטאין חשוב במשפחת העל, ניתן לתייג נוכחות של ציסטאין נוסף. לפעמים, כאשר מוסיפים רצפים שזוהו לאחרונה לגיליון האלקטרוני, הרצפים של מין אחד מתחלקים לכמה קבוצות שונות של משפחת העל, כמו למשל עבור טרדיגראדים. לאחר השלמתו, ניתן למיין את שורות הגיליון האלקטרוני כדי להדגיש שונות בתוך מין, או שונות בין קבוצות טקסונומיות.
הדגמה זו משתמשת בתוכנת MEGA 6 הזמינה בחינם. עם זאת, ניתן להשתמש בתוכנות אחרות באופן דומה. כדי להתחיל יישור חדש, בחר ערוך/בנה יישור תחת הכרטיסיה יישור.
לאחר מכן בחר צור יישור חדש, בתיבה שמופיעה ולחץ על אישור. לאחר מכן בחר חלבון. כעת, בחר הוסף רצף מקובץ, בתפריט עריכה, כדי לייבא את הרצפים. הרצפים חייבים להיות בפורמט PASTA.
צבעי רקע המשקפים סוגים שונים של חומצות אמינו מוצגים כברירת מחדל וניתן לכבות אותם באמצעות לחצן דו-מצבי, בתפריט תצוגה. לאחר הזנת כל הרצפים, לחץ על סמל הזרוע המכופפת ולאחר מכן יישר חלבון כדי ליישר את הרצפים באמצעות אלגוריתם השריר. אם ההודעה, שום דבר לא נבחר ליישור.
בחר הכל? קופץ, בחר אישור. ניתן לשנות פרמטרים מסוימים בחלון המוקפץ, אך להדגמה זו, ברירות המחדל יספיקו. כעת, בדוק את היישור על סמך התכונות החשובות של משפחת החלבונים.
המוט העליון מציג כוכבית בכל עמדה בה חומצת האמינו נשמרת לחלוטין. היישור הראשוני מזהה שלושה מתוך ארבעת הציסטאין המשומר. רצף אחד בבירור לא מיושר.
לתיקון רצף לא מיושר, סמנו את הקווים המפרידים ולחצו על המקש Delete מבלי למחוק בטעות חומצות אמינו. לאחר מכן, הזיזו את חומצות האמינו ליישור הנכון שלהן על ידי הוספת רווחים. לאחר יישור הרצף באופן ידני, שימו לב שהציסטאין האחרון של מוטיב CXXXC נשמר לאורך כל היישור.
לעתים קרובות יש צורך בהתאמה ידנית כדי לתעדף את התכונות החשובות ביותר של הרצפים. יישור הגיליון האלקטרוני של משפחת העל CS אלפא-בטא שהוקמה בעבר חשף חמישה דפוסים בסיסיים של יצירת קשרים. רצפי הטרדיגרד החדשים שזוהו נכנסו לספקטרום השלם של דפוסים אלה.
לאחר מכן, נעשה שימוש בניתוחים פילוגנטיים כדי לבחון כיצד קבוצת חלבונים זו עשויה להתפתח. עם זאת, הרצפים הם בדרך כלל קצרים ושונים מאוד. לפיכך, העצים שנוצרו נפתרו בצורה גרועה והציעו מעט תובנות.
יישור הרצפים המרובים עבר אופטימיזציה באמצעות הייחוס, אך עדיין הייתה רזולוציה גרועה בניתוח הסבירות המקסימלית ובניתוח הפילוגנטי הבייסיאני. לרוב הקלידים היו רמות תמיכה נמוכות בלבד. עם זאת, חמש קבוצות קטנות נתמכו לפחות באחד משני העצים.
רצפים עם מספרי ציסטאין שונים בתוך קבוצה טקסונומית עשויים להיות קרובים יותר מאשר רצפים עם אותו דפוס מקבוצות שונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי ליצור הדמיה פשוטה של מאפייני חלבון חשובים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שקביעת המאפיינים הרלוונטיים ביותר לקבוצת החלבונים היא לרוב תהליך איטרטיבי, וסביר להניח שיהיה צורך בתיקון ההתייחסות.
תמיד ניתן להוסיף רצפים חדשים לגיליון אלקטרוני, וקל לקבל גרסאות מרובות המאפשרות להוסיף תכונות חדשות שעשויות להיות שימושיות לסיווג וניתוח. למרות שיישור הגיליון האלקטרוני מאפשר הדמיה קלה של תכונות מבניות ופונקציונליות, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח פילוגנטי כדי לספק תובנה נוספת לגבי קשרים אבולוציוניים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
הפרוטוקול הזה נועד ליצור התייחסות לחלבונים מגוונים בתוך קבוצה שלא קיים לה כיום נומנקלטורה וקריטריונים לסיווג. על ידי הבהרת היחסים בין חלבונים קשורים, התייחסות זו תשפר דיונים וניתוחים של הקבוצה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- סיווג חלבונים
- נומנקלטורה ביולוגית
- פפטידים הגנתיים
רקע
- הסופר-משפחה של אלפא-בטא יציב בציסטאין כוללת פפטידים הגנתיים שונים.
- נומנקלטורה לא עקבית מסבכת את המחקר על חלבונים קשורים.
- ניתן להשתמש בתוכנת גיליונות אלקטרוניים רגילה לייצוג ויזואלי.
- מאפיינים מוגדרים עוזרים בזיהוי קבוצות חלבונים.
מטרת המחקר
- לפתח התייחסות עקבית לחלבונים מגוונים.
- להקל על הבנה ותקשורת טובים יותר לגבי היחסים בין חלבונים.
- לסייע בסיווג חלבונים עם נומנקלטורה מבלבלת.
שיטות ששימשו
- שימוש בתוכנת גיליונות אלקטרוניים רגילה לארגון נתונים.
- זיהוי מאפיינים מוגדרים של קבוצות חלבונים.
- ייצוג ויזואלי של חלבונים כדי להבהיר את היחסים.
- התמקדות בקיפול אלפא-בטא יציב בציסטאין ומוטיבים קשורים.
תוצאות עיקריות
- נוצרה התייחסות ברורה לחלבונים מגוונים.
- היחסים בין חלבונים יוצגו ויזואלית.
- הנומנקלטורה המבלבלת טופלה באמצעות סיווג שיטתי.
- הופקו תובנות לגבי הסופר-משפחה של אלפא-בטא יציב בציסטאין.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי חשוב לסיווג חלבונים.
- הוא משפר את ההבנה של היחסים בין חלבונים בתוך הקבוצה.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על משפחות חלבונים אחרות שחסר להן נומנקלטורה עקבית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Protein classification challenges can impede target validation and comparative analyses across discovery programs, especially when nomenclature and sequence diversity obscure functional relationships. Establishing a reference framework that prioritizes structural and activity-related features enables more reliable placement of new sequences and supports cross-functional R&D discussions. This approach enhances predictive confidence and portfolio decision-making for protein families with high sequence divergence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Clarifies functional relationships among divergent proteins for robust target validation.
- Enables systematic interrogation of sequence-activity relationships within protein superfamilies.
- Supports biological de-risking by highlighting conserved structural motifs relevant to mechanism.
- Facilitates portfolio triage by providing a coherent framework for new sequence integration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated reference sets for downstream assay development and screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization by anchoring assays to conserved sequence features.
- Enables scalable evaluation of novel sequences against established structural benchmarks.
- Supports reliable compound evaluation by clarifying sequence-function context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sequence classification with disease-relevant structural features when applicable.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent annotation.
- Reduces mechanistic ambiguity in translational studies involving diverse protein families.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying evolutionary and functional relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This reference-based method integrates into the discovery continuum from early target identification through lead optimization, especially for protein families with complex sequence diversity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by mapping conserved features across divergent sequences.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility by standardizing sequence annotation and alignment.
- Analytics: Delivers quantitative outputs for comparing sequence features and supporting statistical analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when structural motifs are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable classification framework adaptable to new protein groups and evolving datasets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein classification.
- Operational Value: Standardizes sequence annotation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying sequence-function relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein structure, sequence analysis, and spreadsheet-based annotation.
- Needs access to sequence databases, alignment tools, and visualization software.
- Demands cross-team agreement on feature prioritization and annotation standards.
- May require adaptation for different protein families or taxonomic groups.
- Manual curation and iterative revision are necessary to maintain reference accuracy and relevance.
